我们介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT）的新型成像技术，该技术能够在介观尺度上对脑组织样本中的所有细胞进行无偏成像，并可无缝整合到同一标本基于胶带的连续扫描电子显微镜成像工作流程中。
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本文内容
摘要
摘要
理解大脑中复杂神经网络的结构与功能关系，需要构建兼具大视野和亚细胞分辨率的脑图谱。然而，现有的光学显微镜和电子显微镜成像方法均存在局限性，难以对单个样本中的所有细胞进行完整成像。本实验方案介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT）的成像技术，该技术能够在完成电子显微镜样本制备后的脑组织样本中，实现对所有细胞的无差别光学成像，从而重建包含全部神经细胞的完整脑图谱。此外，OMLIT成像可与自动胶带收集超薄切片扫描电子显微镜（automated tape-collecting ultramicrotomy scanning electron microscopy, ATUM-SEM）的成像工作流程无缝整合。这使得研究人员能够在电子显微镜成像前获取细胞的介观尺度结构信息，有助于精确选择感兴趣区域，并显著减少高分辨率电子显微镜（EM）成像所需覆盖的面积和数据量。我们在成年小鼠大脑皮层的实际样本中验证了该方法的准确性与兼容性，展示了其在多尺度脑图谱构建中的广泛应用前景。
引言
在细胞和亚细胞分辨率下对神经回路进行全面绘制，对于揭示大脑的结构与功能至关重要。传统的光学成像方法，如双光子显微镜1、荧光显微光学切片断层成像（fMOST）2,3,4以及VISoR系统5，已实现中尺度神经元成像和体内功能成像。然而，由于这些方法依赖稀疏标记，无法捕捉完整的细胞群体。另一方面，无标记光学成像技术，如功能光声显微成像（fPAM）6,7、光学相干断层成像（OCT）8和定量相位显微成像9，具备同时可视化视场内所有神经元的潜力。但这些方法通常受限于较低的轴向分辨率和较浅的成像深度，且其硬件复杂性阻碍了在脑图谱构建中的广泛应用。相比之下，连续切片电子显微镜（ssEM）技术，包括连续块面扫描电镜（SBF-SEM）10,11、聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）12
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方案
所有动物实验均按照中国科学技术大学的机构指南及相关国家法规进行。OMLIT成像的样品制备遵循与传统电子显微镜相同的方案，我们所采用的具体步骤已在其他文献中描述21。简言之，在麻醉后，小鼠经心脏依次灌注二甲胂酸钠缓冲液、人工脑脊液（ACSF），最后灌注含戊二醛和多聚甲醛的固定液。随后小心取出脑组织，并切取约1 × 1 × 1 mm³的脑组织块。样品随后进行化学固定、连续重金属染色、脱水并包埋于树脂中。该方案的整体工作流程见图1。
图1：工作流程概览。（A）本方案中提到的收集胶带（从左至右：聚酰亚胺、D-50 和碳纳米管涂层 PET）。（B）修整后样品的连续切片....
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结果
本实验方案的整体工作流程（图1）始于不同类型收集胶带的制备。图1展示了方案中提到的三种胶带（从左至右：Kapton胶带、D-50胶带和CNT涂层PET胶带），当它们置于相同的背景基底上时，表现出不同的光学特性。在样品制备和块面修整后，应首先收集若干切片用于电子显微镜成像，以确认制备结果符合预期。通过使用自动胶带收集系统，可将数千个切片收集并粘附至金属涂层或未涂层胶带上。随后，这些胶带以特定的方式和顺序排列在4英寸硅片上，形成切片阵列（图1B、C）。经过后续染色后，样品可用于光学显微镜成像。接着，对未涂层胶带增加碳溅射步骤，即可在同一组样品上进行多束电子显微镜成像（图1D–F）。图1F中的内容对应于图1.......
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讨论
本文中，我们开发了一种称为OMLIT的光学成像方法，该方法能够实现介观成像，并与基于胶带的连续扫描电子显微镜工作流程兼容。通过使用OMLIT方法，光学显微镜可从脑组织样本中捕获介观尺度的结构特征，包括血管、细胞体、细胞核、主要的树突分支以及部分较大的有髓轴突。此外，OMLIT可无缝整合到连续扫描电镜（SEM）流程中，在电子显微成像之前提供结构信息，并作为后续电镜采集时感兴趣区域定位的引导。我们展示了OMLIT成像过程的具体步骤，并在小鼠大脑皮层样本中验证了该方法的有效性。
OMLIT成像方案可分为高反射率和低反射率两种策略；这两种策略均需谨慎选择和处理胶带。在高反射率策略中，由于OMLIT成像效果主要由多层薄膜结构的干涉决定，聚酰亚胺或D-50胶带上的金属层若出现划痕或剥落，可能影响成像质量，并随机遮蔽感兴趣区域，导致数据丢失25。此外，在后续染色步骤中，我们发现铝容易与含铅离子的后染液发生反应20。对于低反射率成像策略，尽管聚酰亚胺胶带常用于连续电子显微镜成像，但我们通过OMLIT成像.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（32271430，62361166631）和中国科学技术部（2023YFF0715904）的支持。我们感谢苏州生物医学工程技术研究所公共技术中心以及合肥综合性国家科学中心人工智能研究院脑成像设施在OMLIT和连续电镜成像方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶带 | 3M | B5005094008 | 双面胶带 |
| 原子力显微镜 | Bruker | Dimension Icon | |
| 自动超薄切片收集系统 | Lehua | AutoCUTS II | |
| 导电胶带 | Ted Pella | FP16084-8 | |
| 触针式表面轮廓仪 | Bruker | DektakXT | |
| 切片用金刚石刀片 | Diatome | DUJ3530 | Diatome Jumbo 刀片 |
| 修块用金刚石刀片 | Diatome | DTB90 | 玻璃刀片 |
| 电子显微镜 | Zeiss | MultiSEM505 | 替代型号：GeminiSEM 300，Zeiss |
| FIJI（v1.54p，64位） | 开源软件 | https://fiji.sc | |
| 修块用玻璃刀片 | 自制 | ||
| 柠檬酸铅 | Leica | T534/2 | |
| 光学显微镜 | Olympus | VS200 | 替代型号：Axio Imager. A2 Vario，Zeiss |
| 光学显微镜 | Zeiss | Axio Imager.A2 Vario | |
| 等离子清洗仪 | Yidon Technologies | Hydro-S4 | 替代设备：Ted Pella Pelco 或其他台式等离子清洗仪 |
| 聚合物胶带 | Melton | Kapton | 该公司网站已无法访问。建议研究人员尝试本地可获取的 Kapton 胶带。 |
| 聚合物胶带 | Teijin | PET | https://www.teijin.com/ |
| 聚合物胶带 | Teijin | D-50 | https://www.teijin.com/ |
| 硅晶圆 | Saichi | 912303 | 晶圆单面抛光。 |
| 溅射镀膜仪 | Leica | ACE600 | 替代设备：双头溅射仪，Yujie |
| 超薄切片机 | Leica | UC7 | 替代型号：RMC PT-PC |
| 醋酸铀 | EMS | 22400 | |
| VAST（v1.5.0，64位） | 霍华德·休斯医学研究所 | https://software.dvid.io/vast/ | VAST A1:D32Lite 是一款用于对大型三维显微图像数据集进行手动标注和分割的免费工具。 |
| ZEN 软件（v3.2，64位） | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html |
参考文献
- Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron ....
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重印与许可
