一种扫描电子显微镜兼容的光学成像方法，用于中观全细胞脑映射

Summary

我们引入了一种新型成像技术——光学多层干涉断层扫描（OMLIT），该技术实现了脑标本中所有细胞的无偏分成像，并可无缝集成到同一样品上基于磁尺的串扫描电子显微镜成像流程中。

Abstract

理解大脑复杂神经网络中的结构和功能关系，需要构建具有宽广视野和亚细胞分辨率的脑图谱。然而，当前的光学和电子显微镜成像方法各有局限性，使得成像单个标本内的所有细胞变得困难。该方案引入了一种称为光学多层干涉断层扫描（OMLIT）的成像技术，能够对电子显微镜样品制备后脑标本中的所有细胞进行无差别光学成像，从而重建出所有神经细胞的完整脑图谱。此外，OMLIT成像可以无缝集成自动磁带采集超显微切割扫描电子显微镜（ATUM-SEM）的成像流程。这使得研究人员能够在电子显微镜成像前获取细胞的中尺度结构信息，便于精确选择感兴趣区域，并显著减少高分辨率电子显微镜（EM）成像所需的面积和数据量。我们在成年小鼠大脑皮层的实际样本中验证了该方法的准确性和兼容性，展示了其在多尺度脑图谱构建中的广泛应用前景。

Introduction

对神经回路的细胞和亚细胞分辨率进行全面映射，对于揭示大脑的结构和功能至关重要。传统的光学成像方法，如双光子显微镜^1、荧光微光学断层扫描（fMOST）^2,3,4和VISoR系统⁵，使中尺度神经元成像和体内功能成像成为可能。然而，由于依赖稀疏的标记，它们未能捕捉完整的细胞种群。另一方面，无标签光学成像技术，如功能性光声显微（fPAM）^6,7、光学相干断层扫描（OCT）⁸和定量相位显微^9，有望同时显示视野内所有神经元。然而，这些方法通常受限于轴向分辨率低和成像深度浅，且其硬件复杂性限制了在脑图谱构建中的广泛应用。相比之下，序列切片电子显微镜（SSEM）技术，包括序列块面显微镜（SBF-SEM）^10,11，^聚焦离子束显微镜（FIB-SEM）12,13,14，以及自动磁带采集超切片超切片SEM（ATUM-SEM）15,16,17能够揭示纳米级分辨率的密集突触连通网络，为高分辨率连接组学提供关键工具。然而，这些技术存在低吞吐量、长采集时间、视野有限以及高数据处理和^{硬件成本的问题}。

为克服上述限制，我们开发了一种名为光学多层干涉断层扫描（OMLIT）的成像方法，该方法提供了低成本、高通量的解决方案，实现超薄切片上所有细胞的无差别、高对比度、广视场成像，实现亚微米级分辨率，覆盖大面积组织区域。同时，OMLIT本质上兼容串切面SEM工作流程：在高分辨率电子显微镜出现之前，OMLIT提供相同切片的结构信息，实现精确的ROI导航，显著减少后续EM成像所需的面积和数据量。OMLIT在中尺度成像层面具有独特优势，是连接不同空间尺度神经结构图的关键桥梁。其无破坏性特性保留了未来与特定标记策略整合的潜力，例如使用耐锇荧光蛋白¹⁹ 进行样品制备和成像。该方法能够对特定脑区进行中尺度成像，从而快速获取神经元形态、数量、分布和密度。它还促进了对不同脑区神经元间轴突投射和树突分布的定量表征。对于成像结果中关注的特定区域，可以利用电子显微镜进一步研究 原位 超微结构细节。

OMLIT的成像原理已在浩凡²⁰的研究中有所描述。简而言之，成像过程中，超薄片、涂层层、集集带、导电带和晶圆形成多层薄膜结构。当平面波与该结构相互作用时，反射波会在不同界面产生并在检测空间中重叠，导致材料间反射率、折射率和吸收差异导致光学干涉。基于该原理开发的基于MATLAB的模拟程序与实验结果有较大吻合性。

OMLIT成像方案可根据磁带处理策略分为两类。第一种是高反射率策略，使用铬、铜、铝或氮等金属来覆盖磁带表面，从而使细胞质区域和树脂填充的血管腔具有比周围区域更高的光学强度。第二种是低反射率策略，采用无涂层Kapton带、D-50带或带碳纳米管涂层的PET带。在这种情况下，光学成像结果与前者相反：树脂丰富的无膜区域（如细胞质和血管腔）的强度较低。

我们系统地总结并建立了针对两种不同成像策略的标准化方案。这里呈现的方案提供了全面且详细的实验程序。此外，实验中常见问题被总结，并提出了解决方案。我们重点展示采用低反射率策略（805 × 857.5 × 11.66 μm³）获得的小鼠皮层数据集，展示了OMLIT成像方法的独特特征和优势。

Protocol

所有动物手术均遵循中国科技大学的机构指导方针及相关国家法规进行。OMLIT成像的样品制备遵循传统EM相同的流程，我们采用的具体程序已在其他地方描述²¹。简而言之，麻醉后，小鼠依次经心灌注氯酰酸钠缓冲液、人工脑脊液（ACSF），最后使用含戊二醛和对甲醛的固定剂。大脑被小心取出，切除了约1×1 ×1立方毫米的脑组织块。样品随后经过化学定型，进行连续重金属染色，脱水后嵌入树脂中。协议的一般工作流程如 图1所示。

图1：工作流程概述。 （A）协议中提及的采集磁带（从左到右依次为聚酰亚胺、D-50和碳纳米管涂层PET）。（B）连续切片并采集截尾样本。（C）将包含收集片段的色带安装在圆形硅晶圆上。（D）光显微成像，100微米比例尺。（E）碳涂层。（F） 电子显微成像对应 图1D所示区域，比例条：10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 磁带准备

注意：以下作应在无尘室执行，以防止灰尘污染磁带。

1. 高反射率策略
   1. 选择Kapton（以下称为聚酰亚胺带，50微米厚度）或Panlite薄膜（以下称为D-50,50微米厚度）并将其安装到电动绕组系统上。这里以聚酰亚胺带为例。
      注：本研究使用了一种电动绕组装置，设计由步进电机通过Arduino板控制，通过溅射等离子锥从一个卷轴驱动磁带到另一个卷轴。为了补偿磁带在驱动盘上积累导致磁带平移速度增加、收带盘直径增加，编写了一个程序，在每旋转360°后序列调低收带盘的角速度。
   2. 利用磁控管溅射系统（双头溅射）在磁带表面沉积均匀的铬薄膜（或其他金属如铝、铝或铜）。将磁带放置在距离溅射目标80毫米的位置，以实现最佳沉积。在直流电下进行，压力为1.0 Pa，压力由99.99%氩气调节。
   3. 将磁带绕制速度设置为0.6毫米/秒，以实现金属涂层厚度达到50纳米。沉积后，在高真空下缓慢冷却至室温（RT），以最大限度减少涂层应力。
      注意：同一磁带的最佳涂层厚度会根据所用金属类型有所不同。调整磁带的平移速度，以实现多种涂层厚度，如50、70、100、150和200纳米。
   4. 使用唱针剖面仪、原子力显微镜或扫描电子显微镜评估涂层的厚度和均匀性。
   5. 用80瓦功率的等离子清洁器清洁并使磁带温度为亲水，磁带移动速度为7毫米/秒。处理后，滴落在胶带表面的水滴应迅速扩散成薄膜（见图2A）。
2. 低反射率策略
   注意：该协议允许使用D-50胶带或商业碳纳米管（碳纳米管）涂层聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）胶带。由于后者在电子显微镜成像过程中可能会引入一些背景噪声——虽然不强——因此可能影响电磁图像的分割。因此，以下描述仍将以D-50磁带为例。
   1. 准备D-50胶片，并将整张胶片剪成约7毫米宽的磁带。用一面裸露的磁带收集部分，另一面则用一层哑光膜保护，防止划痕和污染。在后续硅晶圆安装步骤中移除遮光膜。
   2. 如果要有更多段，可以把不同段的D-50磁带连接在一起。用双面胶带固定胶带段间的接缝。
      注意：粘贴胶带段时，确保主导带通过双面胶带从上到下与后面的胶带重叠。尽量减少胶粘面积，并在磁带边缘留出余缘，以防止胶水在绕带过程中挤出，避免污染磁带（见图2B）。
   3. 使用等离子体清洁剂清洁并使磁带亲水，按照相同的步骤实现上述效果。
      注意：除了金属涂层和碳溅射步骤外，两种策略中的其他步骤相同。

2. 串行超薄切片与基于磁带的采集

1. 使用小型研磨机或类似切割工具，粗略修剪样品一侧的树脂，去除周围的空白树脂以露出样品区域。
2. 将树脂嵌入的块体放入样品架，并拧紧夹具的旋钮以牢牢固定块体。
3. 将样本架安装在切片机的可动臂上。在刀架上安装一把玻璃刀或金刚石修剪刀（45°角）。在显微镜下，将样品表面修剪成金字塔形状并使其光滑。
   注意：修剪后的样品块的前后边缘应尽可能平行（见 图2C）。
4. 修剪并平滑样品块的四边，去除边缘多余的树脂，避免与钻石刀的潜在碰撞。旋转旋钮，确保修剪过的木块的前后两边水平对齐。
5. 取下修剪刀，换上一把45°角的金刚石刀。将切片机底座的倾斜角度设为6°。用旋钮慢慢移动刀架，直到金刚石刀前缘距离样品表面1-2毫米。
6. 观察样品表面与刀刃之间的明亮条纹，调整倾斜角度，使条纹从上到下和左右均匀。这有助于确保第一部分包含整个样品表面，而不仅仅是一个角落。
7. 将蒸馏水注入钻石刀的凹槽，使液体水平上升，确保刀刃湿润。然后用注射器去除部分水分，直到液体水平下降，反射呈现银白色。
8. 在控制单元中设置截面厚度（进给）、切削速度和切削窗口。将切片速度调整为0.6 mm/s，并将切片厚度设为60 nm（比速和厚度取决于样品质量）。
9. 开始分区。一旦切片组稳定运行并产生均匀切片，暂停切片过程。用细刷去除切割的部分和杂物。
10. 在自动超薄截片收集系统上安装涂层磁带卷轴和一个空的收卷盘。固定锁紧机构并进行试运行，确保磁带以恒定速度平稳移动，并正确收集到空卷轴上。
11. 将磁带收集装置的收集头浸入钻石刀的水浴中。调整收集头的位置，使其与刀刃平行，距离为样品切片长度的1.5倍，确保切割部分能平稳地收集到磁带上。在运行磁带收集设备时，确保收集设备安全并继续分段。
12. 收集足够多连续切片后，暂停切片过程。在没有收集到磁带的区域剪断磁带，并继续运行磁带收集装置，直到所有剩余磁带都收集到卷轴上。
13. 取出装有收集部分的线轴，放入电子烘干炉中。清洁磁带收集设备和切片机，并将所有配件放回原位。

图2：切片前的准备工作。 （A）D-50胶带表面在（上）和（下）亲水处理前后表面的水滴。（B）D-50磁带接点区域的顶部和侧面示意图。蓝色：D-50胶带;橙色：双面胶;绿箭头：胶带移动方向。（C） 裁剪后样品正面视图，显示平行的上下边缘。（D）自动磁带收集装置。a：用于D-50磁带输出的磁带卷轴;b：磁带卷轴用于磁带检索;红箭头：胶带移动方向。（E）自动磁带收集装置上收集头的位置。右下角的黄色框表示即将被设备收集的新切片。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 安装在硅晶圆上

注意：在接下来的步骤中，确保工作区保持清洁，以避免灰尘污染胶带。

1. 使用4英寸圆形硅晶圆，预先清洗并加水，置于等离子体处理系统中（功率80瓦，3分钟）。
2. 戴上干净的手套，将硅晶圆放在平面上，剪下一块双面导电碳带，长度合适（两端悬出2-3厘米）。撕下双面导电胶带一侧的白色保护层，从上到下涂抹在硅晶圆上。
   注意：导电带的两侧应间距约2毫米，边缘应在硅晶圆上可见。对于25毫米宽的双面导电磁带，可以在一片4英寸硅晶圆上贴上三段磁带。
3. 在工作台上画出4英寸硅晶圆的轮廓，并标记将贴在晶圆上的每段磁带的大致长度。按照之前标记的长度剪断收集各段的胶带。
   注意：切割带不应超过硅片边缘，且不得切割各片。
4. 撕下双面导电胶带上的透明保护膜，对于D-50胶带，此时将胶带背面的保护膜撕下。将胶带与双面导电胶带平行施加。每片双面导电胶带上贴上最多三段胶带。
   注意：为降低D-50磁带错位或被灰尘污染的风险，请用先前剥落的透明薄膜覆盖导电磁带的一部分，只留下一小部分导电磁带露出以连接D-50磁带末端。这使得磁带方向的调整更容易。之后，慢慢撕下剩余的透明薄膜，让剩余的D-50胶带轻轻落下并附着在导电胶带上。
5. 磁带安装后，磁带与导电磁带之间可能形成气泡，干扰后续成像过程。将硅晶圆放入真空室（或其他真空设备）并施加真空。真空过程完成后，确保气泡消失。

4. 后染色

1. 准备4%醋酸铀酰和3%柠檬酸铅，并用水浴锅预热至50°C。
   注意：醋酸铀酰具有放射性，对肝脏和肾脏具有显著毒性。柠檬酸铅可能导致铅中毒，影响神经系统、肾脏和造血系统。这些试剂的作应在排气罩内进行，并佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验室外套、丁腈手套、口罩和安全护目镜。如有皮肤或眼神接触，应立即用大量清水清洗，向实验室安全人员报告并寻求医疗帮助。
2. 将经过真空且无气泡的硅晶圆放入等离子体亲水系统中进行亲水和清洗。
3. 使用去除针头的10毫升注射器，连接0.22微米注射器过滤器，过滤4%醋酸铀酰。将溶液滴入该切片，直到硅片表面完全覆盖，然后等待3分钟。
4. 用蒸馏水洗3分钟，重复3次，然后用氮气吹干样品表面。
5. 使用去除针头的10毫升注射器，安装0.22微米注射器滤网，过滤3%柠檬酸铅。将溶液滴入该切片，直到硅晶圆上覆盖整个切片表面，然后等待5分钟。
6. 用蒸馏水洗3分钟，重复3次，然后用氮气吹干样品表面。

5. 数据采集

1. 光学显微镜
   注：本节以研究用载玻片扫描仪（VS200，奥林巴斯）为光学显微镜示例。其他显微镜，如Axio Imager.A2 Vario（德国蔡司），也适合进行本文描述的光学成像。其他光学显微镜的步骤通常相同。
   1. 将硅晶圆放置在光学显微镜的台上，并用无残留胶带固定。
   2. 使用5倍物镜拍摄硅片、磁带和样品的概览图像。
   3. 在概览图像上，勾勒出每个部分并排序，然后添加焦点和曝光点，实现整个硅晶圆所有部分的20倍或50倍自动成像。
   4. 成像完成后，保存图像，然后检查画质。如果有任何模糊或质量差的照片，请重新对焦并重新影像。
2. 电子显微镜
   注意：多种电子显微镜可以连续成像放置在硅晶圆上的超薄片。这里以多束505（蔡司）为例。
   1. 使用高真空溅射涂层机对样品表面进行碳涂层，碳厚度为5.7纳米。
      注意：对于采用高反射率策略进行金属涂层或采用碳纳米管（碳纳米管）涂层的低反射率策略的磁带，可以跳过这一步骤。
   2. 使用光学显微镜（Axio Imager.A2 Vario，蔡司）捕捉硅晶圆的光学导航图。
   3. 将硅晶圆放入SEM样品室。通过依次识别样品台上两个嵌套的L形标记，将光学导航图与电子显微镜图像关联起来。
   4. 使用显微镜软件（v3.2,64位）中的SAT模块，半自动识别光学导航图中的剖面位置和成像区域。
   5. 将图像像素尺寸设置为4纳米，停留时间为0.8微秒，聚焦点和位置，以及存储位置。
   6. 开始连续影像检查。

6. 数据处理

注意：OMLIT图像的二维拼接由软件自动执行。对于OMLIT图像的大规模三维配准和分割，还有其他更强大的AI算法可用。这里为方便大多数实验室验证该过程，演示了使用斐济（v1.54p，64位）和VAST（v1.5.0,64位）进行拼接、注册和分割。

1. 通过拖拽包含所有图片文件的文件夹进入斐济界面，打开斐济的图像数据集，并在提示时选择 虚拟堆栈 。
2. 使用 矩形工具 选择感兴趣区域（ROI），然后通过 图像 > 裁剪对数据集进行裁剪。
3. 使用寄 存器虚拟堆栈切片 插件（Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices）对齐图像栈。
4. 将对齐后的数据集保存为TIFF格式（文件> Stop As > Tiff）。
5. 通过导入 > 从 images 导入 到 的 将 TIFF 图像栈导入 VAST 22。VSV文件。
   注意：如需更详细的教程，请参阅官网：https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. 通过连接外部绘图板，使用画图 段模式 中的画笔工具开始手动分割和描摹（使用快捷键 A 和 Z 键快速切换图像切片）。
7. 使用 窗口>3D查看器>查看>更新，将分割结构可视化为3D。
8. 通过文件保存分割结果 >保存分割。

Results

该协议的整体工作流程（图1）始于准备不同的收集磁带。图1展示了协议中提到的三种磁带类型（从左到右：Kapton、D-50和碳纳米管涂层PET），它们在放置于同一背景基板上时表现出不同的光学特性。样品制备和区块修剪后，应先采集少量切片进行电子显微镜成像，以确保制备符合预期。通过自动磁带收集系统，可以收集并粘贴成千上万个磁带片段，无论是金属涂层还是未涂层磁带。这些磁带随后以特定方式排列，并在4英寸硅晶圆上排列成剖面阵列（图1B，C）。染色后，样品可用于光学显微成像。然后，通过在未涂层磁带上添加碳溅射步骤，即可对同一批样品进行多束电子显微镜成像（图1D-F），图1F中的内容对应

Discussion

在这里，我们开发了一种名为OMLIT的光学成像方法，能够实现介观成像，并兼容基于磁带的串行扫描电子显微镜工作流程。通过OMLIT方法，光学显微镜可以捕捉脑样本中的中观结构特征，包括血管、细胞体、细胞核、主要树突分支以及一些大型髓鞘轴突。此外，OMLIT可以无缝集成到串行SEM流程中，在电子显微镜成像前提供结构信息，并为后续EM采集识别感兴趣区域提供指导。我们演示了OMLIT成像过程的具体步骤，并在小鼠皮层样本中验证了其有效性。

OMLIT成像方案可分为高反射率和低反射率策略;这两者都需要仔细挑选和处理磁带。在高反射率策略中，由于OMLIT成像效果主要由多层薄膜结构的干涉决定，聚酰亚胺或D-50磁带上的金属层划痕或剥落会影响成像质量，并随机遮蔽感兴趣区域，导致数据丢失²⁵。此外，在染色后步骤中，我们发现铝容易与含铅离子²⁰的染色后溶液反应。对于低反射成像策略，尽管聚酰亚胺带常用于串行电子显微镜，但通过OMLIT成像观察到聚...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胶带	3岁月	B5005094008	双面胶
原子力显微镜	布鲁克	维度图标
自动超薄片收集系统	乐华	自动剪辑 II
导电胶带	特德·佩拉	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	布鲁克	DektakXT
用于切片的金刚石刀	硅藻类	DUJ3530	硅藻巨型刀
用于修剪的钻石刀	硅藻类	DTB90	玻璃刀
电子显微镜	蔡司	MultiSEM505	替代方案：GeminiSEM 300，蔡司
FIJI（v1.54p，64位）	开源	https://fiji.sc
玻璃修边刀	自力更生
柠檬酸铅	徕卡	T534/2
光学显微镜	奥林匹斯	VS200	替代方案：Axio 成像仪。A2 瓦里奥，蔡司
光学显微镜	蔡司	Axio Imager.A2 Vario
等离子清洁剂	Yidon科技	Hydro-S4	替代方案：Ted Pella Pelco 或其他台面等离子清洁剂
聚合物胶带	梅尔顿	卡普顿	该公司的网站现已无法访问。我们建议研究人员尝试本地可获得的KAPTON磁带。
聚合物胶带	帝人	宠物	https://www.teijin.com/
聚合物胶带	帝人	D-50	https://www.teijin.com/
硅晶圆	斋市	912303	晶圆一面是抛光的。
溅射涂层机及nbsp;	徕卡	ACE600	替代方案：双头溅射，Yujie
超切片机	徕卡	UC7	替代方案：RMC PT-PC
铀乙酸盐	急救医疗服务	22400
VAST（v1.5.0,64位）	霍华德·休斯医学研究所	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1：D32Lite 是一款免费工具，用于手动注释和分割大型三维显微镜数据集。
ZEN 软件（v3.2,64 位）	蔡司	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html