基于PCR荧光探针的曲霉属、新形隐球菌和肺孢子虫的检测

Summary

本文介绍基于PCR荧光探针法的临床测试方案，用于同时检测 曲霉 属、 新形隐球菌和 肺孢子虫。

Abstract

该方案描述了一种标准化程序，用于利用基于PCR荧光探针的核酸检测试剂盒，在临床痰液样本中定性检测曲霉属、新形隐球菌和肺孢子虫。该程序包括临床样本采集、碱性液化预处理、自动核酸提取以及多重实时PCR检测。曲霉属、C. neoformans和P. jirovecii通过靶标特异性荧光探针（分别为FAM、VIC和CY5通道）检测，并集成内部对照（ROX通道）以保证质量。检测效度和样本结果解释基于定义的循环阈值（Ct）截止值。正对照必须在所有通道中表现出Ct≤ 33.7的S形放大曲线，而负对照则必须显示无放大。对于临床样本，FAM通道的Ct值为33.7≤表示曲霉属阳性，VIC通道≤36表示曲霉菌或P. jirovecii阳性。

Introduction

侵袭性真菌感染，如 曲霉 属、 隐球菌和 尘生孢子虫引起的感染，对免疫功能低下患者构成重大威胁，导致高发病率和高死亡率。及时且准确的诊断对于启动适当的抗真菌治疗和改善临床结果至关重要。¹.传统的诊断方法，包括培养、显微镜和抗原检测，存在显著的局限性。培养过程耗时且灵敏度低，显微镜缺乏物种级鉴定，依赖操作员，而抗原检测（如半乳糖单粒糖、β-D-葡聚糖）可能表现出交叉反应性和表现不一致。分子诊断，尤其是实时PCR，可以通过更快的响应时间以及高灵敏度和特异性的潜力来弥补部分这些空白。多重PCR技术的进步进一步使得从单一样本中同时检测多种病原体成为可能，提高了诊断效率。

该方案描述了一种多重荧光探针PCR测定法，通过靶向18S rRNA基因（曲霉属）、ITS基因（C. neoformans）和mtLSU rRNA基因（P. jirovecii）的保守区域，定性检测来自曲霉属（Aspergillus spp.）、C. neoformans 和 P. jirovecii 的 D2 核糖菌（P. jirovecii）。 该方法的关键特征包括明确的分析灵敏度：曲霉属、....

Protocol

临床样本的使用已获得相关伦理委员会批准（批准号：ZYS-GCP-2025006）。所有参与者均对其数据和标本在研究中使用提供了广泛的知情同意。本协议中使用的所有试剂和消耗品均列于材料的T能力中。

1. 样本采集

1. 在无菌容器中采集3–5毫升痰液或支气管肺泡洗涤液，并及时提交检测。

2. 试剂制备

注意：这些步骤是在试剂准备室完成的。

1. 将检测套件从-28°C冷冻室取出，在室温（25–30°C）完全解冻30分钟。
2. 计算反应总数（N）：N = 测试样本数 （n） + 阳性/阴性对照组 （2） + 1
3. 在无菌微离心管中准备反应混合物。单次反应：35微升核酸扩增混合物+5微升引子-探针混合物，彻底涡旋，短暂离心。
4. 将40微升反应混合物按试剂盒制造商的协议放入每个PCR管，并转移到样品处理室的通透窗口。

3. 样品处理

注意：这些步骤是在....

Results

使用该多重荧光探针PCR测定获得的代表性放大曲线如 图1 和 图2所示。检测有效性基于预先定义的对照标准确定。在有效运行中，正对照在FAM、VIC、CY5和ROX通道中产生了特征性的S形放大曲线，所有检测通道的周期阈值（Ct）值≤33.7（见图1A）。阴性对照组显示任何通道均无S形放大曲线，Ct值报告为“未确定”（见图1B）。实验运行被视为有效，必须满足这两个对照条件。

为临床样本解读，评估病原体特异性荧光信号（见图2）。FAM通道中显示S形放大曲线、Ct≤值为33.7的样本被解释为曲霉属阳性。无放大曲线或FAM通道Ct值>33.7的样本被解释为阴性。同样，一个样本显示VIC通道中具有S形放大曲线，Ct≤值为36，则被解.......

Discussion

本研究建立的多重实时PCR协议为临床痰液样本中三种关键入侵真菌病原体（曲霉属、新形隐球菌和肺孢子虫）提供了标准化检测程序。该方法能够直接检测临床样本中的病原体DNA。与传统的诊断方法如培养、显微镜或血清抗原检测不同，这种分子方法不受这些技术固有限制，包括培养处理时间较长、显微镜的敏感性和操作员依赖性，以及抗原检测中可能出现交叉反应。

该协议的成功实施依赖于多个关键阶段的严格质量控制。充分的样本预处理，包括碱性液化和离心进行富集，对于获得高质量真菌DNA至关重要。液化不完全可能损害细胞壁破坏，降低核酸释放效率。使用自动提取系统的核酸纯化步骤同样重要，因为它去除了痰液样本中的PCR抑制剂，如黏液和血液成分，从而确保了稳定且可重复的扩增。此外，分区化的实验室工作流程结合dUTP-UDG防污染系统，对于防止假阳性和保持检测特异性至关重要。这在涉及高拷贝数人类内源对照基因样本的高灵敏度检测环境中尤为重要。

关于干扰抵抗性和结果可靠性，验证数据表明该方法对常见干扰物质具有.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 & mu;L型滤嘴无菌延长移液器（架式）	晓睿生物技术	S20221126
1000 & mu;L无菌移液器头	江苏新康医疗器械有限公司	241101
200 & mu;L 型扩展过滤器无菌移液器尖端	晓睿生物技术	241001
裂解管	北京ZC生物科学与科技公司	F1040
曲霉、Cryptococcus neoformans和Pneumocystis jirovecii	北京ZC生物科学与科技公司	CT8143-48T
核酸提取试剂	北京ZC生物科学与科技公司	CN8053-B40T
样品稀释缓冲液	北京ZC生物科学与科技公司	SP7065