该方法利用共聚焦反射显微镜观察玻璃体中胶原纤维的天然结构。
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摘要
摘要
玻璃体是一种透明的凝胶，填充于晶状体与视网膜之间的空间。其结构由胶原纤维网络支撑，该网络可能影响 玻璃体的黏弹性特性，并与视网膜疾病相关。然而，由于在天然状态下对玻璃体进行成像具有挑战性，目前对该胶原网络的组织结构仍缺乏充分表征。许多应用于玻璃体的成像技术会导致脱水和形变，而基于染料的方法可能引入伪影或非特异性标记，从而难以准确研究胶原网络。本实验方案中，我们详细阐述了以下内容：1）用于成像的猪眼解剖方法；2）将眼球安装于倒置显微镜上的策略；3）利用共聚焦反射显微镜在天然状态下对玻璃体胶原网络进行成像的操作指南；以及4）对网络特征进行定量图像分析的具体步骤。我们指出了常见误区，并强调了关键技术要点。本文报道了共聚焦反射显微镜在玻璃体研究中的应用。与以往的玻璃体成像方法相比，该技术无需外源性染料，亦不会产生脱水伪影，因而能够完整保留玻璃体胶原纤维的天然结构、取向及分布。共聚焦反射显微镜可用于探究健康与疾病状态下玻璃体凝胶刚性的结构基础。
引言
玻璃体是眼球内晶状体与视网膜之间的细胞外基质。玻璃体对视网膜的牵拉在诸如视网膜脱离、黄斑裂孔和玻璃体黄斑牵拉等疾病导致的视力丧失中起着重要作用1,2,3,4。玻璃体将牵拉力传递至视网膜的能力由其凝胶刚度决定，而凝胶刚度又取决于其主要成分胶原和透明质酸的性质5。玻璃体凝胶刚度可能受到胶原纤维网络结构特征的影响，因为人工胶原凝胶的刚度正是由网络的密度、排列方向和纤维宽度等特性所驱动的6。
由于玻璃体胶原纤维网络含水量高且胶原浓度低，难以成像7，在显微镜或透射电子显微镜制样过程中容易产生人为假象。传统的组织学和透射电子显微镜技术需要对玻璃体进行硬化处理以实现薄切片。组织学包埋所需的脱水过程会导致玻璃体纤维聚集形成蜂窝状结构8，而冷冻过程中形成的冰晶会增大细胞外基质中的孔径9。尽管已采用塑料包埋8和快速冷冻10等方法以尽量减少假象，但仍可能存在一定程度的残留假象。相差显微镜是一种无需切片的成像方法，已被应用于玻璃体研究，但该方法需从眼球中取出一小块玻璃体组织，从而丧失了纤维网络原有的位置和取向信息11。近年来，定量偏振光显微镜已被用于绘制大体切开的猪眼球中纤维平均取向的图谱，但无法分辨单根纤维12。此外，基于染料的标记方法（如台盼蓝、苦味酸天狼星红、5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素）可能引入假象或非特异性标记，因此为保持胶原网络的天然状态而避免使用。
我们采用了Filas等人用于偏振光显微镜研究的样品制备方法，即在琼脂糖块中进行大体解剖12，并使用共聚焦反射显微镜对样本进行成像，该方法此前尚未应用于玻璃体。通过此方法，我们获得了处于水合、接近生理状态下的玻璃体胶原纤维网络图像。与以往的方法相比，该方法具有多项优势，包括相较于冰冻断裂或脱水法可显著减少人为假象10,13。本实验方案需要配备浸没式物镜的倒置共聚焦显微镜，物镜放大倍数至少为30倍，数值孔径大于0.9，工作距离大于200 µm。我们提供了样品制备和图像采集的关键操作指导，以实现纤维结构的清晰分辨。通过维持玻璃体胶原基质接近天然的状态，该方法使研究人员能够对纤维的取向、密度和空间分布等参数进行定量分析——这些参数对于理解玻璃体刚度及其病理变化可能至关重要。该技术特别适用于关注玻璃体胶原网络、其结构特征以及玻璃体视网膜疾病发病机制的研究人员。
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方案
1. 组织制备与解剖
注意：本研究严格遵守机构规定。在本机构，进行以下实验无需获得机构动物护理和使用委员会的批准 离体 猪眼
- 获取 离体 来自肉类加工厂的猪眼，需在动物死亡后48小时内使用。
注意：尽管玻璃体的外观不会随死后时间延长而改变，但视网膜和脉络膜会逐渐降解，导致解剖过程中细胞和色素碎片的弥散。这些碎片可能干扰纤维成像与分析。 - 去除眼球上多余的肌肉和结缔组织。
- 将三脚支架放置在立方体模具的底部，例如超大号硅胶冰格模具（图1A 和 图2).
- 将眼球置于三叉支架上，调整位置使角膜缘落在支架的三个叉上。
- 将3 g普通琼脂糖加入100 mL蒸馏水中，加热至溶解，制备3%琼脂糖凝胶。待溶液冷却至约37 °C时，倒入模具中，直至眼睛完全浸没于琼脂糖中。
注意：这将使眼球包埋于琼脂糖凝胶中，以在解剖过程中稳定眼球。 - 将琼脂糖凝胶块冷藏至少4小时。
注意：这会增强凝胶与眼球的黏附性，确保在解剖过程中眼球保持固定不动 - 冷却后，从模具中取出琼脂糖块，然后将基座从琼脂糖块上移除（图1B).
- 使用1×8乐高积木、底板和瓷砖，按照琼脂糖块的相同尺寸搭建一个三面框架（图3).
注意：这将固定住琼脂糖块，并在解剖过程中为刀片提供切割引导。乐高框架的高度决定了眼球的切割位置，该位置可通过半透明的琼脂糖凝胶进行观察。 - 将冷却的琼脂糖块放入乐高框架中。用手握住高轮廓切片刀的钝边，将刀片与乐高框架顶部对齐。轻轻向下施压于琼脂糖块顶部，同时缓慢前后拖动切片刀，使刀片完全穿过琼脂糖块及其中包埋的眼球。图1C).
注意：这将形成一段包埋在琼脂糖中的眼组织，该组织将被称为 "眼罩".
2. 成像样品的制备
- 使用切片刀从琼脂糖块切割面的整个表面修剪掉约 1 mm 的琼脂糖（图 4A）。
注意：这将使一小部分眼杯组织突出于琼脂糖块的切割表面之上 - 使用擦拭纸或小型三角形纤维素海绵将琼脂糖块切割表面干燥，尤其注意眼杯边缘附近区域。
- 取约一茶匙通用型硅胶密封胶放入一个小的塑料自封袋中，并在袋子的一个底部角落剪开一个直径约 3 mm 的小孔，制成用于挤出密封胶的注胶袋。
- 使用注胶袋沿眼杯边缘在琼脂糖块的切割表面均匀挤出一条细密的硅胶线，围绕样本形成防水边界（图 4B），以防止玻璃体凝胶从眼杯中渗出。
- 将一块大尺寸盖玻片覆盖在眼杯上，并轻轻按压，确保眼杯的切割面与盖玻片完全接触，且无气泡或液体残留（图 4C）。确认硅胶线与盖玻片之间形成连续的密封。
注意：若硅胶密封不连续，可能导致玻璃体液渗漏并使空气进入样本。暴露于空气中会使玻璃体收缩，导致纤维变得更亮、更密集，并出现无纤维的液化区域。若玻璃体未与盖玻片充分接触，将难以进行成像。 - 手持琼脂糖块，将样本翻转后放置于倒置显微镜的大尺寸盖玻片适配器上，用于成像（图 4D 和 图 5）。
3. 图像采集
- 使用倒置共聚焦显微镜，但不要使用转盘式类型。使用水镜物镜（以水或眼用润滑凝胶作为耦合介质），或使用数值孔径至少为0.90、放大倍数在30x至60x之间、工作距离至少为200 µm的油镜物镜。
- 调整共聚焦显微镜的光路设置以获取反射成像。在荧光成像中用于重定向激发光并透射发射光的二向色镜位置，应确保使用一个分光镜，该分光镜可将部分照明激光重定向，并透射部分反射光。
注意：玻璃体胶原纤维的反射信号较弱，因此背景噪声可能影响纤维成像能力。使用473 nm波长时观察到信噪比有所改善，但我们在405 nm至635 nm波长范围内均成功实现了玻璃体胶原纤维的成像。 - 将检测波长设置为包含照明激光的波长。
- 为确定样品内的Z轴位置，将激光功率调至最低设置，并识别盖玻片表面反射光的闪光。该闪光将出现在盖玻片的底部和顶部（图6）。
注意：在盖玻片附近，背景中存在较强的反射信号。远离盖玻片后，来自胶原纤维的反射光信号减弱。 - 调整Z轴位置，使其位于盖玻片上表面之上且处于样品内部。
- 将激光功率提高到高于通常用于荧光应用的水平。
注意：成像视野中心会出现一个环形反射伪影。结合放大视野和偏移成像区域中心的方法，有助于排除此伪影（图7）。 - 在图像采集设置中使用线平均并增加像素驻留时间，这是共聚焦显微镜中提高信噪比的标准方法。
4. 使用 CT-FIRE 进行纤维宽度的图像分析 14
- 按照此网站上的说明安装 CT Fire： https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF)。
注意：此处使用的版本为 "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" 和 MATLAB 运行环境 "MCR-2018b-win64"。为使软件正常运行，两者均需下载。 - 将图像转换为 8 位 tif 格式，并在 CT-FIRE 中打开这些 8 位 tif 图像。
- 确保软件在右上角设置为 CT-Fire，然后选择 运行。
- CT-FIRE 将自动将分析结果上传至与原始图像所在文件夹相同的目录下名为 "ctfireout" 的文件夹中。通过将文件名以 "OL_ctFIRE" 开头的文件与原始图像进行比较，检查提取结果的质量。为遵循本实验方案，请使用以下默认图像分割参数（即识别纤维）：thresh_im2: 5；s_xlinkbox: 8；thresh_ext: 70；thresh_dang_L: 15；thresh_short_L: 15；s_fiberdir: 4；thresh_linkd: 15；thresh_linka: -150；thresh_flen: 15
- 若纤维未能被准确识别，可点击右上角 参数 部分下方的 更新 按钮调整参数。
注意：有关如何调整参数的指导信息，请参见位于 CTFIRE 应用程序文件夹中的 CT-FIRE 手册第 20 页第 "3 Notes" 节。更多提示可参考 Liu 等人文章的第 3.5.2 节15。
- 若纤维未能被准确识别，可点击右上角 参数 部分下方的 更新 按钮调整参数。
- 可根据需要调整输出设置，以限制输出图像中显示的纤维。为遵循本实验方案，请使用以下默认设置：最小纤维长度 [像素]：30；图像分辨率 [dpi]：300；纤维线宽 [0–2]：0.5；最大纤维宽度 [像素]：15
- 为将宽度单位从像素转换为 µm，请在 Fiji 中打开原始图像。利用显示窗口左上角出现的图像尺寸（同时以像素和 µm 表示）计算比例系数。
使用 TWOMBLI 进行纤维密度、曲率、取向、空隙度、菌丝生长单位和分形维度的图像分析16
- 从以下地址下载 TWOMBLI： https://github.com/wershofe/TWOMBLI
- 按照文件 TwombliDocumentation 中的说明进行操作 "安装与依赖项".
- 打开 TWOMBLI_v1/programs 文件夹，将 AnamorfProperties.xml 文件替换为 AnamorfPropertiesEH.xml 文件（补充文件 1).
- 在 TWOMBLI_v1/programs 文件夹中，将 Twombli_v1.ijm 文件替换为 Twombli_v2.ijm 文件（补充文件 2).
- 创建一个包含名为的空文件夹的文件夹 "测试 HDM，" "测试口罩，" "HDM" 和 "口罩".
- 将图像转换为8位tif格式。
- 放置3-5张图像到一个 "测试集输入" 文件夹
- 将所有待分析的图像放入一个名为且不含子文件夹的单一文件夹中 "符合条件的".
- 在 Fiji 中，单击 插件 | 宏 | 运行 | 在 twombli/Programs 中选择 Twombli_v2.ijm。
- 按照提示运行 TWOMBLI。遵循本方案时，请使用以下参数：对比度饱和度 0.35；最小线宽 3；最大线宽 3；最小曲率窗口 40；最大曲率窗口 40；最小分支长度 10；最大显示 HDM 100；最小间隙直径 0
注意：图像参数可能需要调整。软件将引导用户选择参数，更多说明见随程序提供的文件 TwombliDocumentation.docx。
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结果
对三只年轻成年猪（一只4月龄雌性、一只5月龄雄性、一只6月龄雌性）的各一只眼球进行成像，眼球沿下部角膜缘的轴平面切开。在X-Y切面平面上获取六个成像位置，各位置相距4 mm。在每个成像位置，获得一个连续的4 × 4网格，包含70 µm × 70 µm的图像（图8）。对于每只猪，每幅图像均针对多个参数进行单独分析（表1）。
纤维密度通过两种方法测定：1）线性结构分割后的纤维总长度；以及 2）经阈值处理后信号占据的像素比例。三头猪的纤维总长度相似（通过单因素方差分析，p = 0.19）（图9A），但三头猪之间信号占据的像素比例存在差异（p < 0.0001）（图9B）。这可能反映出猪3中纤维密度较低。分割后测得的纤维宽度范围为1.21至1.47 µm（图9C）。三头猪之间的纤维宽度存在差异（p < 0.0...
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讨论
既往的玻璃体成像方法显示出纤维聚集的人工假象13，纤维结构、方向和位置的丢失17，或依赖于更高分辨率但视场更小的技术，限制了对纤维分布的认识10。离体新鲜组织经大体切片后进行共聚焦反射显微成像，可在保持玻璃体胶原纤维天然组织结构、方向和位置的同时，提供微米级分辨率的纤维图像。在我们的实验中，基于染料的染色方法（如台盼蓝、苦味酸天狼星红、5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素）会引入人工假象或非特异性标记，因此未予采用，以保持胶原网络的天然状态。
要成功实施本方案，有几个关键步骤需要注意。在样品制备过程中，必须确保玻璃体与盖玻片直接接触。若玻璃体与盖玻片之间存在气泡或液体，将导致玻璃体出现人为假象，应予以避免18。玻璃体纤维的反射信号相对较弱，因此在图像采集过程中优化信噪比至关重要。适当提高激光功率并降低放大倍数可能有所帮助。此外，应使用具备足够分辨率的显微镜物镜，其数值孔径至少为0.9 ...
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披露
所有作者均声明无相关利益冲突。
致谢
美国国立卫生研究院核心资助 EY014800；由纽约预防失明研究会向眼科系提供的无限制资助 & 视觉科学系，犹他大学；美国国立卫生研究院国家眼科研究所 K08 EY034549 基金；Primary Children's Hospital Foundation；E. Matilda Ziegler 基金会；我们感谢 Guillaume L. Hoareau 博士和 M. Austin Johnson 博士提供猪眼。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 I | VWR | 0710-500G | |
| 通用型透明硅胶密封胶 1 | GE | 2795576 | |
| 纤维素海绵（Weck-Cel 眼科拭子） | Beaver -Visitec | 000865 | |
| 定制三爪支架 | NA | NA | |
| 用于固定大尺寸盖玻片的定制适配器 | NA | NA | |
| 大尺寸盖玻片，1.42” x 2.36”，1 号 | Ted Pella | 260460-100 | |
| Lego（经典底板，1×8 地砖，1×8 砖块，1×6 平板） | Lego | 11023, 3008, 3666, 4162 | |
| 切片机刀片（高轮廓） | Lieca Biosystems | 14035838926 | |
| Olympus UPlanSApo 30x 硅油物镜 | Olympus | UPLSAPO30XS | |
| 硅胶大冰格模具（Samuelworld） | Amazon | 713243280060 | |
| 擦拭纸（Kimwipes） | Kimberly Clark | 34120 |
参考文献
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