该方法利用共聚焦反射显微镜观察玻璃体中胶原纤维的天然结构。
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本文内容
摘要
摘要
玻璃体是一种透明的凝胶，填充于晶状体与视网膜之间的空间。其结构由胶原纤维网络支撑，该网络可能影响 玻璃体的黏弹性特性，并与视网膜疾病相关。然而，由于在天然状态下对玻璃体进行成像具有挑战性，目前对该胶原网络的组织结构仍缺乏充分表征。许多应用于玻璃体的成像技术会导致脱水和形变，而基于染料的方法可能引入伪影或非特异性标记，从而难以准确研究胶原网络。本实验方案中，我们详细阐述了以下内容：1）用于成像的猪眼解剖方法；2）将眼球安装于倒置显微镜上的策略；3）利用共聚焦反射显微镜在天然状态下对玻璃体胶原网络进行成像的操作指南；以及4）对网络特征进行定量图像分析的具体步骤。我们指出了常见误区，并强调了关键技术要点。本文报道了共聚焦反射显微镜在玻璃体研究中的应用。与以往的玻璃体成像方法相比，该技术无需外源性染料，亦不会产生脱水伪影，因而能够完整保留玻璃体胶原纤维的天然结构、取向及分布。共聚焦反射显微镜可用于探究健康与疾病状态下玻璃体凝胶刚性的结构基础。
引言
玻璃体是眼球内晶状体与视网膜之间的细胞外基质。玻璃体对视网膜的牵拉在诸如视网膜脱离、黄斑裂孔和玻璃体黄斑牵拉等疾病导致的视力丧失中起着重要作用1,2,3,4。玻璃体将牵拉力传递至视网膜的能力由其凝胶刚度决定，而凝胶刚度又取决于其主要成分胶原和透明质酸的性质5。玻璃体凝胶刚度可能受到胶原纤维网络结构特征的影响，因为人工胶原凝胶的刚度正是由网络的密度、排列方向和纤维宽度等特性所驱动的6。
由于玻璃体胶原纤维网络含水量高且胶原浓度低，难以成像7，在显微镜或透射电子显微镜制样过程中容易产生人为假象。传统的组织学和透射电子显微镜技术需要对玻璃体进行硬化处理以实现薄切片。组织学包埋所需的脱水过程会导致玻璃体纤维聚集形成蜂窝状结构8，而冷冻过程中形成的冰晶会增大细胞外基质中的孔径9。尽管已采用塑料包埋8和快速冷冻10<....
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方案
1. 组织制备与解剖
注意：本研究严格遵守机构规定。在本机构，进行以下实验无需获得机构动物护理和使用委员会的批准 离体 猪眼
- 获取 离体 来自肉类加工厂的猪眼，需在动物死亡后48小时内使用。
注意：尽管玻璃体的外观不会随死后时间延长而改变，但视网膜和脉络膜会逐渐降解，导致解剖过程中细胞和色素碎片的弥散。这些碎片可能干扰纤维成像与分析。 - 去除眼球上多余的肌肉和结缔组织。
- 将三脚支架放置在立方体模具的底部，例如超大号硅胶冰格模具（图1A 和 图2).
- 将眼球置于三叉支架上，调整位置使角膜缘落在支架的三个叉上。
- 将3 g普通琼脂糖加入100 mL蒸馏水中，加热至溶解，制备3%琼脂糖凝胶。待溶液冷却至约37 °C时，倒入模具中，直至眼睛完全浸没于琼脂糖中。
注意：这将使眼球包埋于琼脂糖凝胶中，以在解剖过程中稳定眼球。 - 将琼脂糖凝胶块冷藏至少4小时。
注意：这会增强凝胶与眼球的黏附性，确保在解剖过程中眼球保持固定不动 - 冷却后，从模具中取出琼脂糖块，然后将基座从琼脂糖块上移除（....
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结果
对三只年轻成年猪（一只4月龄雌性、一只5月龄雄性、一只6月龄雌性）的各一只眼球进行成像，眼球沿下部角膜缘的轴平面切开。在X-Y切面平面上获取六个成像位置，各位置相距4 mm。在每个成像位置，获得一个连续的4 × 4网格，包含70 µm × 70 µm的图像（图8）。对于每只猪，每幅图像均针对多个参数进行单独分析（表1）。
纤维密度通过两种方法测定：1）线性结构分割后的纤维总长度；以及 2）经阈值处理后信号占据的像素比例。三头猪的纤维总长度相似（通过单因素方差分析，p = 0.19）（图9A），但三头猪之间信号占据的像素比例存在差异（p < 0.0001）（图9B）。这可能反映出猪3中纤维密度较低。分割后测得的纤维宽度范围为1.21至1.47 µm（图9C）。三头猪之间的纤维宽度存在差异（p < 0.0.......
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讨论
既往的玻璃体成像方法显示出纤维聚集的人工假象13，纤维结构、方向和位置的丢失17，或依赖于更高分辨率但视场更小的技术，限制了对纤维分布的认识10。离体新鲜组织经大体切片后进行共聚焦反射显微成像，可在保持玻璃体胶原纤维天然组织结构、方向和位置的同时，提供微米级分辨率的纤维图像。在我们的实验中，基于染料的染色方法（如台盼蓝、苦味酸天狼星红、5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素）会引入人工假象或非特异性标记，因此未予采用，以保持胶原网络的天然状态。
要成功实施本方案，有几个关键步骤需要注意。在样品制备过程中，必须确保玻璃体与盖玻片直接接触。若玻璃体与盖玻片之间存在气泡或液体，将导致玻璃体出现人为假象，应予以避免18。玻璃体纤维的反射信号相对较弱，因此在图像采集过程中优化信噪比至关重要。适当提高激光功率并降低放大倍数可能有所帮助。此外，应使用具备足够分辨率的显微镜物镜，其数值孔径至少为0.9 .......
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披露
所有作者均声明无相关利益冲突。
致谢
美国国立卫生研究院核心资助 EY014800；由纽约预防失明研究会向眼科系提供的无限制资助 & 视觉科学系，犹他大学；美国国立卫生研究院国家眼科研究所 K08 EY034549 基金；Primary Children's Hospital Foundation；E. Matilda Ziegler 基金会；我们感谢 Guillaume L. Hoareau 博士和 M. Austin Johnson 博士提供猪眼。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 I | VWR | 0710-500G | |
| 通用型透明硅胶密封胶 1 | GE | 2795576 | |
| 纤维素海绵（Weck-Cel 眼科拭子） | Beaver -Visitec | 000865 | |
| 定制三爪支架 | NA | NA | |
| 用于固定大尺寸盖玻片的定制适配器 | NA | NA | |
| 大尺寸盖玻片，1.42” x 2.36”，1 号 | Ted Pella | 260460-100 | |
| Lego（经典底板，1×8 地砖，1×8 砖块，1×6 平板） | Lego | 11023, 3008, 3666, 4162 | |
| 切片机刀片（高轮廓） | Lieca Biosystems | 14035838926 | |
| Olympus UPlanSApo 30x 硅油物镜 | Olympus | UPLSAPO30XS | |
| 硅胶大冰格模具（Samuelworld） | Amazon | 713243280060 | |
| 擦拭纸（Kimwipes） | Kimberly Clark | 34120 |
参考文献
- Sebag, J. Vitreous and vision degrading myodesopsia. Prog Retin Eye Res. 79, 100847(2020).
- Phillips, J. D., Hwang, E. S., Morgan, D. J., Creveling, C. J., Coats, B. Structure and mechanics of the vitreoretinal interface. J Mech Behav Biomed Mater. 134, 105399(2022). <....
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