探究β-榄香烯介导LINC00511调控抑制肺癌顺铂耐药的机制

摘要

顺铂（DDP）耐药性限制了肺癌化疗的疗效。本研究旨在阐明β-榄香烯（β-Ele）通过下调LINC00511在A549/DDP细胞中逆转耐药性的机制。体外实验和RNA测序分析表明，该调控作用可抑制有氧糖酵解和Wnt/β-catenin信号通路，为克服化疗耐药性提供了潜在策略。

摘要

顺铂耐药性显著限制了非小细胞肺癌化疗的疗效，因此亟需开发新的策略以克服这一障碍。 体外 研究旨在阐明β-Ele逆转肺腺癌细胞顺铂耐药性的机制 通过 LINC00511介导的糖酵解和Wnt/β-catenin信号通路。通过质粒转染建立LINC00511过表达或敲低的顺铂耐药人肺腺癌细胞系（A549/DDP）。采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LINC00511表达水平，以评估转染效率。评估 通过 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）检测表明，β-榄香烯显著抑制了A549/DDP细胞的增殖。进一步的RNA测序分析显示，β-榄香烯对顺铂耐药性的抑制作用与干扰细胞糖酵解及抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关。对葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、丙酮酸激酶M2型（PKM2）、乳酸脱氢酶A（LDHA）、β-catenin和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等关键蛋白的Western blot分析表明，β-榄香烯通过下调LINC00511表达，抑制有氧糖酵解并阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而逆转顺铂耐药性。综上所述，这些结果表明，β-榄香烯通过靶向LINC00511及其相关的有氧糖酵解/Wnt/β-catenin通路，克服肺癌中的顺铂耐药性。该发现为未来的临床前及临床研究建立了理论框架，同时揭示了潜在的治疗靶点。

引言

在全球恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率极高，其特征是支气管上皮细胞发生恶性转化并呈现侵袭性生长^1,2根据组织病理学特征，肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。³值得一提的是，非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85%^4,5作为非小细胞肺癌的一线化疗标准药物，顺铂（DDP）在临床上不可或缺。⁶然而，临床观察发现，肿瘤细胞可能产生耐药性 通过 多种机制，主要涉及免疫逃逸通路的激活、药物靶点基因的突变以及药物代谢通路的失调^7,8,9.

长链非编码RNA（lncRNA）是指长度超过>200个核苷酸（nt）且不具备蛋白质编码能力的转录本¹⁰。越来越多的证据表明，lncRNA可通过多种机制逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药性，例如作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miRNA，从而释放其靶基因

方案

1. 溶剂配制

1. 制备A549/DDP细胞培养基溶液：在Ham's F-12K完全培养基（详见材料表）中培养A549/DDP细胞，添加10%胎牛血清（FBS，详见材料表）、1%青霉素-链霉素溶液（P/S，详见材料表）和2 μg/mL顺铂（DDP，详见材料表）。
   1. 完全培养基溶液的制备：向500 mL Ham's F-12K培养基中加入50 mL FBS和5 mL P/S，充分混匀，制备完全培养基溶液。
   2. 含顺铂的完全培养基溶液的制备：称取1 mg顺铂粉末（DDP，详见材料表），溶于1 mL双蒸水（ddH₂O）中，配制母液。取200 μL母液加入100 mL完全培养基（按步骤1.1.1制备）中，充分混匀，得到含2 μg/mL顺铂的工作浓度完全培养基。
      注意：由于顺铂为细胞毒性物质，所有操作均应在通风橱或生物安全柜中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜等防护装备。
2. β-细辛脑给药溶液：本研究所用药物浓度基于本研究团队前期实验结果^20,21。将1 mg β-细辛脑（详见

结果

β-El能显著抑制A549/DDP细胞的增殖

在本实验中，β-Ele和DDP的给药浓度是根据我们先前研究的结果确定的^20,21。A549/DDP细胞分别接受β-Ele单独处理或联合DDP处理，以分析其对DDP化疗耐药性的影响。EdU分析（图1）结果显示，与空白组相比，24 µM和48 µM的DDP显著抑制了A549/DDP细胞的增殖（P < 0.01，d = 23.52）。

进一步比较表明，β-Ele（40 µg/mL）与DDP（24 µM和48 µM）联用对A549/DDP细胞增殖的抑制作用显著强于.......

讨论

本研究聚焦于肺癌中顺铂耐药这一重要的临床问题。肺癌是全球癌症死亡人数最多的疾病，其五年生存率至今仍低于20%^29,30。顺铂作为铂类化疗药物的基石，是一种高效、广谱的抗癌药物，通过抑制DNA复制发挥其抗肿瘤作用³¹。然而，在长期临床应用中发现，约有一半的患者会产生获得性耐药，导致治疗失败和疾病进展¹⁶。因此，寻找有效策略以提高肺癌对顺铂的敏感性，对于改善患者的生存率和预后具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）作为肿瘤多药耐药的多功能调控因子，近年来其在肺癌细胞耐药机制中的作用受到越来越多关注^32,33。大量研究已证实，lncRNA在肺癌耐药形成过程中发挥调控作用。例如，Sun等人的研究表明，A549/DDP细胞中lncRNA-XIST表达升高。敲低XIST可通过miR-17/ATG7轴相互作用增强化疗敏.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549/DDP 细胞	Procell	CL-0519	网址：https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
超净工作台	苏州安泰空气技术	SW-CJ-2FD	网址：http://www.sz-antai.com
BCA 蛋白浓度检测试剂盒	Solarbio	PC0020	网址：https://www.solarbio.com
台式离心机	Thermo	Pico17	网址：https://www.thermofisher.com
细胞培养箱	Thermo	3111	网址：https://www.thermofisher.com
细胞培养皿	BIOFIL	TCD000100	网址：http://www.biofil.com.cn
化学发光分析仪	秦翔仪器	4300	网址：https://www.clinx.cn/about_us
顺铂	阿拉丁	C295225-250mg	网址：https://www.aladdin-e.com/
DNBSEQ-T7 基因测序仪	华大智造科技有限公司	T7	网址：https://www.mgitech.cn/
EasyPure 微量基因组 DNA 提取试剂盒	全式金生物	EE181-01	网址：https://www.transgen.com/
ECL 显色液	Solarbio	PE0010	网址：https://www.solarbio.com
EDU 检测试剂盒	碧云天	C0071S	网址：https://www.beyotime.com
酶标仪	德泰生物设备	HBS-1096A	网址：https://www.detiebio.cn/
胎牛血清（FBS）	CLARK	FB15015	网址：https://zn.clarkbio.com/
Frag/Prime Buffer	翊圣生物	11277ES	网址：https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper 软件 6	Thermo	Version 6	片段分析软件。网址：https://www.thermofisher.cn/
GenReader 平台	北京阅微基因技术有限公司	https://yyigou.com/product/detail/0000037250.html	用于毛细管电泳的自动化基因分析仪
葡萄糖检测试剂盒	建成生物	A154-1-1	网址：http://www.njjcbio.com
GLUT1 多克隆抗体	Proteintech 集团	21829-1-AP	网址：https://www.ptglab.com
GraphPad Prism	GraphPad 软件公司	Version 8.0.2	网址：https://www.graphpad.com
GSK-3β 抗体	Affinity	AF5016	网址：https://www.affbiotech.com
Ham's F-12K 培养基	Procell	PM150910	网址：https://www.procell.com.cn/
Hieff NGS DNA 分选磁珠	翊圣生物	12601ES	网址：https://www.yeasen.com/products/detail/939
HieffNGS mRNA 分离纯化试剂盒	翊圣生物	12603ZH	网址：https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP 标记山羊抗兔 IgG	赛维尔生物	GB23303	网址：https://www.servicebio.cn
乳酸检测试剂盒	建成生物	A019-2-1	网址：http://www.njjcbio.com
LDHA 特异性多克隆抗体	Proteintech 集团	19987-1-AP	网址：https://www.ptglab.com
Light Cycler 96	罗氏	LC96	网址：https://lifescience.roche.com
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	网址：https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEM 培养基	Gibco	31985-070	网址：https://www.thermofisher.com/gibco
青霉素-链霉素（P/S）	碧云天	BL505A	网址：https://www.biosharp.cn/
PKM2 特异性多克隆抗体	Proteintech 集团	15822-1-AP	网址：https://www.ptglab.com
PMSF	碧云天	ST506	网址：https://www.beyotime.com
PrimeScript RT 试剂盒（完美实时）	TaKaRa	RR037A	网址：https://www.takarabio.com
RIPA 裂解液	碧云天	P0013B	网址：https://www.beyotime.com
测序平台	华大基因（BGI）	DNBSEQ-T7	网址：https://www.bgi.com/global
TB Green Premix Ex Taq	TaKaRa	RR420A	网址：https://www.takarabio.com
微量核酸检测仪	奥盛仪器	Nano-100	网址：http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaI	康为世纪生物	CW0597S	网址：https://www.canvaxbiotech.com
胰蛋白酶	碧云天	BL501A	网址：https://www.biosharp.cn/
超纯 RNA 提取试剂盒（DNase I）	康为世纪生物	CW0597S	网址：https://www.canvaxbiotech.com
β-Actin 抗体	Proteintech 集团	60008-1-Ig	网址：https://www.ptglab.com
β-catenin 抗体	Affinity	DF6794	网址：https://www.affbiotech.com
β-榄香烯	Sigma	63965-25MG	网址：https://www.sigmaaldrich.com