方法文章

探究β-榄香烯介导LINC00511调控抑制肺癌顺铂耐药的机制

DOI：

10.3791/68825

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2025年8月19日

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1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

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顺铂（DDP）耐药性限制了肺癌化疗的疗效。本研究旨在阐明β-榄香烯（β-Ele）通过下调LINC00511在A549/DDP细胞中逆转耐药性的机制。体外实验和RNA测序分析表明，该调控作用可抑制有氧糖酵解和Wnt/β-catenin信号通路，为克服化疗耐药性提供了潜在策略。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

顺铂耐药性显著限制了非小细胞肺癌化疗的疗效，因此亟需开发新的策略以克服这一障碍。 体外 研究旨在阐明β-Ele逆转肺腺癌细胞顺铂耐药性的机制 通过 LINC00511介导的糖酵解和Wnt/β-catenin信号通路。通过质粒转染建立LINC00511过表达或敲低的顺铂耐药人肺腺癌细胞系（A549/DDP）。采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LINC00511表达水平，以评估转染效率。评估 通过 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）检测表明，β-榄香烯显著抑制了A549/DDP细胞的增殖。进一步的RNA测序分析显示，β-榄香烯对顺铂耐药性的抑制作用与干扰细胞糖酵解及抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关。对葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、丙酮酸激酶M2型（PKM2）、乳酸脱氢酶A（LDHA）、β-catenin和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等关键蛋白的Western blot分析表明，β-榄香烯通过下调LINC00511表达，抑制有氧糖酵解并阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而逆转顺铂耐药性。综上所述，这些结果表明，β-榄香烯通过靶向LINC00511及其相关的有氧糖酵解/Wnt/β-catenin通路，克服肺癌中的顺铂耐药性。该发现为未来的临床前及临床研究建立了理论框架，同时揭示了潜在的治疗靶点。

引言

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在全球恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率极高，其特征是支气管上皮细胞发生恶性转化并呈现侵袭性生长1,2根据组织病理学特征，肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。3值得一提的是，非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85%4,5作为非小细胞肺癌的一线化疗标准药物，顺铂（DDP）在临床上不可或缺。6然而，临床观察发现，肿瘤细胞可能产生耐药性 通过 多种机制，主要涉及免疫逃逸通路的激活、药物靶点基因的突变以及药物代谢通路的失调7,8,9.

长链非编码RNA（lncRNA）是指长度超过>200个核苷酸（nt）且不具备蛋白质编码能力的转录本10。越来越多的证据表明，lncRNA可通过多种机制逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药性，例如作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miRNA，从而释放其靶基因11，调控细胞凋亡信号通路12，参与DNA损伤修复13，以及调节细胞自噬过程14。此外，随着肿瘤代谢重编程研究的深入，已有大量证据表明lncRNA在此过程中发挥关键调控作用。瓦伯格效应（Warburg effect），即有氧糖酵解，是恶性细胞的基本代谢特征之一15。该效应不仅为细胞快速增殖提供能量，还产生作为生物合成前体的中间代谢物，支持蛋白质和脂质的合成，以满足恶性肿瘤生长的需求16。在肺癌中，已证实lncRNA通过调控有氧糖酵解通路显著影响肿瘤进展及化疗耐药性17,18。

其中，LINC00511 是近年来被广泛研究的一种长链非编码 RNA 分子，已有报道指出其与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关19。这些发现不仅阐明了长链非编码 RNA 参与肿瘤代谢重编程的具体机制，也为靶向长链非编码 RNA 的肿瘤治疗策略提供了理论依据，开辟了潜在的治疗途径。

从莪术（Curcuma zedoaria）根茎中提取的β-榄香烯是一种具有明确抗肿瘤活性的倍半萜类化合物。前期研究表明，β-榄香烯可选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，并通过靶向肿瘤代谢与顺铂产生协同作用，在非小细胞肺癌小鼠移植瘤模型中显著抑制肿瘤生长。20后续研究表明，β-榄香烯能够抑制非小细胞肺癌细胞的有氧糖酵解 通过 miR-301a-3p/AMPKα 信号轴的调控，导致抗肿瘤效应21根据我们之前的研究结果，已证实LINC00511可减轻肺癌中顺铂的耐药性；然而，其确切的分子作用机制仍有待进一步阐明。

鉴于有氧糖酵解在肿瘤代谢重编程中的关键作用以及LINC00511在肿瘤发生和进展中的重要作用，本研究旨在探讨β-榄香烯是否可通过调控LINC00511介导的有氧糖酵解通路逆转肺癌对顺铂的耐药性。

既往研究表明，β-榄香烯可通过激活凋亡通路22、调控外泌体分泌23以及阻滞细胞周期24来逆转顺铂耐药性并增强其抗肿瘤效应。然而，这些已知机制通常作用广泛，缺乏对特定分子靶点的精确调控，从而限制了其临床转化能力。因此，迫切需要探索更具靶向性、机制明确且具有较强临床转化潜力的新型策略，以克服顺铂耐药问题。与以往侧重于β-榄香烯直接生物学作用的研究不同，本研究通过调控长链非编码RNA（lncRNA）介导的分子通路，系统表征了β-榄香烯对A549/DDP细胞中Warburg代谢及Wnt/β-catenin信号通路的影响，旨在阐明其在肺癌中逆转化疗敏感性的新机制。本文不仅揭示了β-榄香烯通过靶向lncRNA逆转化疗耐药的新途径，也为肺癌的临床干预提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。这些发现通过详细阐明特定分子靶标（LINC00511）以及关键信号通路（Warburg和Wnt/β-catenin），显著提升了其临床转化潜力，有望为提高肺癌患者的化疗敏感性、改善生活质量提供坚实的科学依据，并推动肺癌精准治疗策略的发展。

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方案

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1. 溶剂配制

  1. 制备A549/DDP细胞培养基溶液：将A549/DDP细胞培养于Ham's F-12K完全培养基中（详见材料表），并添加10%胎牛血清（FBS，详见材料表）、1%青霉素-链霉素溶液（P/S，详见材料表）和2 μg/mL顺铂（DDP，详见材料表）。
    1. 完全培养基溶液的制备：向500 mL Ham's F-12K培养基中加入50 mL FBS和5 mL P/S，充分混匀，制得完全培养基溶液。
    2. 含顺铂的完全培养基溶液的制备：称取1 mg顺铂粉末（DDP，详见材料表），溶于1 mL双蒸水（ddH2O）中，配制母液。取200 μL母液加入100 mL完全培养基（按步骤1.1.1制备）中，充分混匀，得到含2 μg/mL顺铂的工作浓度完全培养基。
      注意：由于顺铂为细胞毒性物质，所有操作均应在通风橱或生物安全柜中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜等防护装备。
  2. β-细辛脑给药溶液的制备：本研究所用药物浓度基于本研究团队前期实验结果20,21。将1 mg β-细辛脑（详见材料表）溶于20 μL二甲基亚砜（DMSO，详见材料表）中，配制母液。用完全培养基将母液稀释至25 mL，获得浓度为40 μg/mL的β-细辛脑工作溶液。
    注意：由于DMSO可增强其他物质经皮肤吸收，所有操作均应在通风橱或生物安全柜中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜等防护装备。

2. 细胞培养 

  1. 本研究使用人肺腺癌顺铂耐药细胞系（A549/DDP，Procell，详见材料表）。确认该细胞系已通过短串联重复序列（STR）分析鉴定，并成功与ATCC及其他数据库中的标准谱系匹配。
    1. 对于STR分析方法，收集约1 × 106 个细胞，使用商用基因组DNA提取试剂盒（详见材料表）提取基因组DNA。
    2. 采用经过验证的多重STR系统进行DNA分型，扩增20个STR位点以及性别决定位点。PCR扩增的热循环条件如下：95 °C 预变性2 min，随后进行29个循环（94 °C 变性30 s，59 °C 退火45 s，72 °C 延伸45 s），最后在72 °C 延伸10 min。
    3. 根据制造商说明，使用自动化遗传分析仪通过毛细管电泳分析PCR产物。via 片段分析软件（详见材料表）进行等位基因分型，峰检测阈值设定为150相对荧光单位（RFU）。
      注：将获得的20个位点STR图谱与公共数据库中A549/DDP细胞系的参考图谱进行比对，匹配率超过80%视为具有同源性。未出现额外的等位基因峰进一步证实无交叉污染。
  2. 从液氮中取出细胞，迅速置于37 °C水浴中解冻，直至液体完全融化。将细胞悬液转移至5 mL离心管中，加入两倍体积的完全培养基溶液，轻轻重悬混合。离心（358 × g，5 min，室温）后小心弃去上清液。
    注：从液氮中取出细胞冻存管时，应佩戴防冻手套及护目镜或面罩，且不要将管口朝向自己。
  3. 用1 mL完全培养基轻轻吹打重悬细胞沉淀，再加入9 mL完全培养基将悬液稀释至10 mL。将细胞接种至100 mm细胞培养皿中，在培养箱（详见材料表）中于37 °C、5% CO2条件下培养。细胞传代比例维持在1:2至1:3之间。
    注：顺铂是一种具有细胞毒性的铂类化疗药物。本方法中A549/DDP细胞在含顺铂的培养基中培养，因此需将含顺铂的废弃培养基收集至专用废液桶中，并定期送交危险废物处理公司进行专业处置。

3. 质粒转染 

  1. 采用LINC00511过表达的质粒构建体以及靶向LINC00511的基因特异性siRNA（基因编号：400619；转录本编号：NR_033876.1）进行细胞转染。所用siRNA序列见表1。
 siRNA序列
名称正义链 5'-3'反义链 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

表1：siRNA序列列表

  1. 复苏后传至第三代的A549/DDP细胞随机选取，以每孔1 × 105 个细胞的密度均匀接种于6孔板中。每个孔随机编号，并根据随机编号将孔分配至不同的实验组。
  2. 当细胞密度达到约70%时，使用转染试剂（详见材料表）进行转染。
    1. 制备siRNA转染溶液。
      1. 将250 μL优化型最低必需培养基（Opti-MEM，详见材料表）与5 μL转染试剂混合，轻轻涡旋3–5次以确保均匀，室温孵育5分钟。
      2. 将5 μL siRNA（50 nM）稀释于250 μL Opti-MEM中，轻轻涡旋3–5次使其充分混匀。将稀释后的转染试剂与siRNA溶液混合，室温孵育20分钟，形成siRNA转染复合物。
    2. 制备质粒转染溶液。
      1. 将250 μL Opti-MEM与5 μL转染试剂混合，轻轻涡旋3–5次以确保均匀，室温孵育5分钟。
      2. 将2 μg质粒稀释于250 μL Opti-MEM中，轻轻涡旋3–5次以确保充分混匀。将稀释后的转染试剂与质粒溶液混合，室温孵育20分钟，制备质粒转染溶液。
      3. 分别将siRNA转染溶液和质粒转染溶液加入6孔板中。每孔加入1,500 μL完全培养基。加样前后轻轻混匀细胞培养板，以确保分布均匀。转染后于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，随后进行分析。

4. 通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测转染效率

注意：在转染后24小时（步骤3.3）收集细胞，按照以下步骤进行qRT-PCR检测。所有实验均独立进行三次生物学重复（n = 3）。

  1. RNA 提取 
    1. 使用超纯 RNA 提取试剂盒（详见材料表）。根据试剂盒说明书弃去 6 孔板中的培养基，并用 PBS 洗涤细胞。随后，向每孔加入 500 μL 基于苯酚-胍的裂解试剂溶液，用枪头轻轻吹打使细胞充分悬浮，转移混合液至离心管中。室温静置 5 分钟，以确保细胞样本完全裂解。
    2. 加入 100 μL 苯酚-异硫氰酸胍裂解试剂，剧烈振荡 15 秒，室温静置 2 分钟。最后，小心吸取上层水相，转移至吸附柱中，在 4 °C 条件下以 13,400 x g 离心 10 分钟。
    3. 使 RNA 结合至硅胶膜上。用 Buffer RW1 和 Buffer RW2 洗涤以去除蛋白质。随后加入 DNase I 消化残留 DNA，并用 Buffer RW2 再次洗涤，确保杂质完全去除。最后，用无 RNase 水洗脱 RNA，以 13,400 x g 离心 1 分钟，收集 RNA 样品。
  2. 测定 RNA 浓度。
    1. 取每份 1.5 μL 样品 RNA 溶液，置于微量核酸检测仪中（详见材料表），读取 A260/A280 值。
      注意：若测得的 A260/A280 值在 1.8 至 2.0 范围内，且 RNA 浓度介于 20 ng/μL 至 200 ng/μL 之间，则表明 RNA 质量合格，可用于后续实验。
    2. 根据测定结果，使用焦碳酸二乙酯（DEPC）水对 RNA 溶液进行稀释，以所有样品中测得的最低 RNA 浓度为基准，使各样品 RNA 浓度保持一致，随后进行 PCR 实验。
  3. RNA 逆转录
    1. 以提取的总 RNA 作为模板，按照逆转录试剂盒说明书（详见材料表）合成 cDNA。根据试剂盒要求配制反应体系。
    2. 将提取的 RNA 溶液与反应体系加入八联管中，每组设置两个重复孔。按以下程序启动反应：37 °C 孵育 15 分钟，85 °C 热变性 5 秒，4 °C 冷却 5 分钟。
  4. PCR 反应
    1. 在实时荧光定量 PCR 系统上（详见材料表），使用基于 SYBR Green 的预混 PCR 主混合液（详见材料表）进行 PCR 扩增。以 GADPH 为内参基因，引物序列见表 2，反应体系配制如下：依次向八联管中加入 0.4 μL 对应引物、2 μL cDNA 模板及反应混合液，达到最终反应体积。
    2. 运行 PCR 扩增程序：95 °C 30 秒（1 个循环），95 °C 5 秒（40 个循环），60 °C 20 秒（40 个循环）。采用 2-ΔΔCt 法25 计算目的基因的相对表达水平。所有实验独立重复三次，以确保数据可靠性。
      注意：实验过程中产生的化学废弃物必须收集于指定的危险废物容器中，并依照机构规定由认证的危险废物管理服务机构统一处理。
引物序列
引物序列（5'-3'）
human-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
human-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

表2：PCR实验的引物序列

5. EdU 检测

  1. 使用 EdU 检测试剂盒（详见材料表）评估 LINC00511 表达改变对 A549/DDP 细胞增殖的影响。
    1. 随机选取复苏后传至第三代的 A549/DDP 细胞，以每孔 2 × 104 个细胞的密度均匀接种于 24 孔板中。
      注：本实验所有操作均进行三次独立的生物学重复（n = 3）。
    2. 对各孔进行随机编号，并根据随机编号将孔分配至以下四个实验组之一：对照组、β-Ele 组、β-Ele + LINC00511 过表达（β-Ele + OV-LINC00511）组，以及 β-Ele + LINC00511 沉默（β-Ele + si-LINC00511）组。
  2. 当细胞密度达到约 70% 时，按照步骤 3.3 进行质粒转染和干扰处理。转染 24 小时后，弃去原培养基，向药物处理组各孔中加入含 β-Ele（40 μg/mL）的培养基溶液 1 mL。
  3. 在用 40 μg/mL β-Ele 处理 24 小时后，加入 EdU 对细胞进行标记，随后用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，并用 0.5% Triton X-100 进行透化处理。
  4. 在避光条件下加入点击反应溶液（将试剂盒提供的 Click Additive 试剂一管溶于 1.3 mL 去离子水中，充分混匀后配制而成），避光反应 30 分钟。反应结束后用 PBS 洗涤细胞，再进行 Hoechst 染色 5 分钟。最后使用荧光显微镜观察结果（图 1 和 图 2）。
    注：DMSO 具有高渗透性且为易燃液体。本方案中，β-Ele 给药溶液含有 DMSO，因此使用后应将该溶液收集至专用废液桶中，并定期交由危险废物处理公司进行专业处置。

6. 葡萄糖含量检测 

注意：所有实验均在三个独立的生物学重复中进行（n = 3）。

  1. 复苏后传至第三代的A549/DDP细胞随机选取，以1 × 105 个细胞/孔的密度均匀接种于6孔板中。对每个孔进行随机编号，并根据随机数字将孔分配至不同的实验组。
  2. 当细胞密度达到约70%时，按照步骤3.3所述进行质粒转染及干扰操作。转染24小时后，用40 μg/mL的β-Ele处理给药组细胞。
  3. 药物处理24小时后，收集细胞上清液，于1000 × g 离心5分钟，收集上清。按照葡萄糖检测试剂盒说明书（详见材料表）配制反应液，并与上清液充分混匀。
  4. 将样品加入96孔板中，每组设5个复孔。轻轻振荡混匀后，于37 °C孵育10分钟。使用酶标仪在505 nm波长下测定各孔吸光度，并根据试剂盒提供的公式计算葡萄糖含量：
    葡萄糖浓度公式，光谱结果分析，吸光度测定方程
    其中，C标准 = 5.55 mmol/L，N = 稀释倍数。
    注意：实验过程中产生的化学废弃物必须收集至指定的危险废物容器中，并按照机构规定由有资质的危险废物处理机构统一处置。

7. 乳酸含量检测 

注意：所有实验均在三个独立的生物学重复中进行（n = 3）。

  1. 复苏后传至第三代的A549/DDP细胞随机选取，以每孔1 × 105个细胞的密度均匀接种于6孔板中。对各孔进行随机编号，并根据随机数字将孔分配至各实验组。当细胞密度达到约70%时，按照步骤3.3所述进行质粒转染与干扰。转染24小时后，用40 μg/mL的β-Ele处理给药组细胞。
  2. 药物处理24小时后，收集细胞上清培养液，于1000 × g 离心5分钟，收集上清液。按照乳酸检测试剂盒说明书（详见材料表）配制反应液，并与上清液充分混匀。
  3. 将总共250 μL样品加入96孔板的每个孔中，每组设置五个复孔。轻轻振荡混匀，于37 °C孵育10分钟。使用酶标仪（详见材料表）在530 nm波长下测定各孔吸光度，并根据试剂盒提供的公式计算乳酸含量：
    乳酸浓度公式，生化定量用吸光度方程
    其中，C标准 = 3 mmol/L，N = 稀释倍数。
    注意：实验过程中产生的化学废弃物必须收集至指定的危险废物容器中，并依照机构规定由有资质的危险废物处理服务机构统一处置。

8. 大量 RNA 测序

  1. 建立样本数据库
    1. 选择A549/DDP细胞用于实验，并将其分为以下组别：对照组、DDP组、β-Ele（40 μg/mL）+ DDP（48 μM）组、β-Ele + DDP + OV-LINC00511组和β-Ele + DDP + si-LINC00511组。每组设置3个样本。
    2. 从各细胞组中提取总RNA。使用基于磁珠的mRNA分离试剂盒（参见 材料表 以富集真核生物mRNA（具体细节见正文），其中Oligo(dT)包被的磁珠可选择性结合mRNA的poly(A)尾 通过 A-T 碱基配对。加入片段化缓冲液（每微克 RNA 加 1 μL，参见 材料表 （具体细节见正文）在94 °C下孵育7分钟，将mRNA片段化为短片段。
    3. 使用随机六聚体引物，按照制造商说明书进行第一链cDNA合成。对于第二链cDNA合成，加入适量的反应缓冲液、RNase H和DNA聚合酶I以完成该过程。
    4. 对双链cDNA进行末端修复和A尾添加：先在25 °C孵育30分钟（末端修复），紧接着在72 °C孵育30分钟（A尾添加）。将测序接头连接至末端修复后的片段。
    5. 使用羧基修饰的磁性二氧化硅珠纯化并进行连接产物的片段筛选（参见 材料表 最后，通过 PCR 扩增构建测序文库。
    6. 样品制备完成后，在 DNBSEQ-T7 平台分析测序文库（参见 材料表 有关详细信息，请参见相关说明）。将样品加载至图案化阵列微阵列芯片以进行测序。
      注意：该仪器利用高分辨率成像系统收集、读取和识别光信号，以确定单个碱基的序列信息。随后进行额外的测序循环，以获取后续碱基的序列。经过多次循环后，生成原始测序数据。
  2. 生物信息学分析 
    1. 在仪器上对样本进行测序以获得原始数据，即下机数据。随后使用 fastp（v 0.21.0）对测序数据进行处理，去除含有 3' 端接头序列的读段，并根据主要过滤标准剔除平均质量值低于 Q20 的低质量读段。所有下游分析均基于经清理后的高质量数据进行。
      注意：使用 fastp 对测序数据进行初步过滤。有关具体的命令行参数，请参考转录组数据集的官方文档（https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing）。
    2. 使用 FastQC（v 0.12.0）评估清洗后测序数据的质量。质量要求如下：至少 90% 的碱基质量分数需高于 Q20，残留接头序列的比例不得超过 1%。满足上述标准的数据视为合格，可用于后续分析。
      注意：根据官方指南（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/），使用 FastQC 评估清洗后测序数据的质量。
  3. 基因表达分析 
    1. 使用DESeq2软件对两个比较组之间进行差异表达分析。
      1. 首先，将数据输入软件以构建DESeq数据集。然后，过滤掉在所有样本中总计数少于10的基因。
      2. 最后，进行差异基因分析并提取结果。筛选差异表达基因的条件如下：表达倍数变化 |log2FoldChange| > 1，且显著性 padj ≤ 0.05。
        注意：有关 DESeq2 软件的详细操作步骤，请参考其官方网站上的详细说明：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html。

9. 通过蛋白质印迹（WB）检测蛋白质表达水平的变化 

注意：所有实验均在三个独立的生物学重复中进行（n = 3）。

  1. 通过蛋白质印迹法检测细胞蛋白表达水平。
    1. 随机选取复苏后传至第三代的 A549/DDP 细胞，以 1 × 10⁶ 个/孔的密度均匀接种于 6 孔板中5 细胞/孔
    2. 对每个孔进行随机编号，并根据这些随机编号将各孔分配至以下六个实验组之一：对照组、β-Ele组、OV-LINC00511组、si-LINC00511组、β-Ele + OV-LINC00511组和β-Ele + si-LINC00511组。
    3. 当细胞密度达到约70%时，按照步骤3.3所述进行质粒转染和干扰。转染24小时后，对处理组加入β-Ele（40 μg/mL）进行处理，对照组更换新鲜培养基。两组继续培养24小时。
    4. 随后，以 1675 × g 离心收集细胞沉淀 g 5分钟。将每组细胞加入500 μL含有1 mM PMSF的RIPA裂解缓冲液，于冰上裂解30分钟（见 材料表 详情请参见）。
  2. 将细胞裂解液在13,400 × g 4 °C 下离心 10 分钟，收集上清液。使用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度（参见 材料表 （详见正文）。将等量的蛋白质样品用10% SDS-PAGE分离后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上 通过 电泳
  3. 将膜浸入封闭液（5% 脱脂奶粉/含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST））中，室温下封闭 2 小时，随后在 4 °C 与抗 GLUT1、PKM2、LDHA、β-catenin、GSK-3β（1:1000）和 β-Actin（1:2000，见 材料表 详情请参见）。
    1. 第二天，在室温下用TBST轻轻振荡洗涤膜3次，每次5分钟。
  4. 次日，将膜与二抗溶液（HRP标记的山羊抗兔IgG，1:2000）孵育，在室温下轻轻振荡1小时。
  5. 最后，加入 0.1 mL/cm2 使用市售ECL显色溶液完全覆盖PVDF膜。室温孵育1分钟，随后进行曝光。利用增强型化学发光系统观察和分析条带（见 材料表 详情请参见 图4C 和 图5B.
    注意：实验过程中产生的化学废弃物必须收集在指定的危险废物容器中，并根据机构规定，由经认证的危险废物管理服务机构处置。

10. 统计分析 

注意：所有实验均在三个独立的生物学重复中进行（n = 3）。

  1. 按组整理实验数据，并将其输入 GraphPad Prism 软件（版本 8.0.2；详见材料表）。根据软件指南进行数据可视化和统计学显著性分析。测量数据以均值 ± 标准差表示。组间统计学差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行评估，并计算 η²（eta-squared）效应量，随后进行 Tukey 多重比较检验26。认为 **P < 0.01 具有统计学显著性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-细辛脑显著抑制 A549/DDP 细胞的增殖

在本实验中，β-Ele 和 DDP 的给药浓度是根据我们先前研究的结果确定的20,21。A549/DDP 细胞分别接受 β-Ele 单独处理或联合 DDP 处理，以解析其对 DDP 化疗耐药性的影响。EdU 分析（图 1）结果显示，与空白组相比，24 µM 和 48 µM 的 DDP 显著抑制了 A549/DDP 细胞的增殖（P < 0.01，d = 23.52）。

进一步比较表明，β-Ele（40 µg/mL）与DDP（24 µM和48 µM）联用对...

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讨论

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本研究聚焦于肺癌中顺铂耐药这一重要的临床问题。肺癌是全球癌症死亡人数最多的疾病，其五年生存率至今仍低于20%29,30。顺铂作为铂类化疗药物的基石，是一种高效、广谱的抗癌药物，通过抑制DNA复制发挥其抗肿瘤作用31。然而，在长期临床应用中发现，约有一半的患者会产生获得性耐药，导致治疗失败和疾病进展16。因此，寻找有效策略以提高肺癌对顺铂的敏感性，对于改善患者的生存率和预后具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）作为肿瘤多药耐药的多功能调控因子，近年来其在肺癌细胞耐药机制中的作用受到越来越多关注32,33。大量研究已证实，lncRNA在肺癌耐药形成过程中发挥调控作用。例如，Sun等人的研究表明，A549/DDP细胞中lncRNA-XIST表达升高。敲低XIST可通过miR-17/ATG7轴相互作用增强化疗敏...

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披露

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所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

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本研究由吉林省自然科学基金资助，项目编号为YDZJ202401058ZYTS。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A549/DDP 细胞ProcellCL-0519网址：https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
超净工作台苏州安泰空气技术SW-CJ-2FD网址：http://www.sz-antai.com
BCA 蛋白浓度检测试剂盒SolarbioPC0020网址：https://www.solarbio.com
台式离心机ThermoPico17网址：https://www.thermofisher.com
细胞培养箱Thermo3111网址：https://www.thermofisher.com
细胞培养皿BIOFILTCD000100网址：http://www.biofil.com.cn
化学发光分析仪秦翔仪器 4300网址：https://www.clinx.cn/about_us
顺铂阿拉丁C295225-250mg网址：https://www.aladdin-e.com/
DNBSEQ-T7 基因测序仪华大智造科技有限公司T7网址：https://www.mgitech.cn/
EasyPure 微量基因组 DNA 提取试剂盒全式金生物EE181-01网址：https://www.transgen.com/
ECL 显色液SolarbioPE0010网址：https://www.solarbio.com
EDU 检测试剂盒碧云天C0071S网址：https://www.beyotime.com
酶标仪德泰生物设备HBS-1096A网址：https://www.detiebio.cn/
胎牛血清（FBS）CLARKFB15015网址：https://zn.clarkbio.com/
Frag/Prime Buffer 翊圣生物11277ES网址：https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper 软件 6ThermoVersion 6片段分析软件。网址：https://www.thermofisher.cn/  
GenReader 平台北京阅微基因技术有限公司https://yyigou.com/product/detail/0000037250.html用于毛细管电泳的自动化基因分析仪
葡萄糖检测试剂盒建成生物A154-1-1网址：http://www.njjcbio.com
GLUT1 多克隆抗体Proteintech 集团21829-1-AP网址：https://www.ptglab.com
GraphPad PrismGraphPad 软件公司Version 8.0.2网址：https://www.graphpad.com
GSK-3β 抗体AffinityAF5016网址：https://www.affbiotech.com
Ham's F-12K 培养基ProcellPM150910网址：https://www.procell.com.cn/
Hieff NGS DNA 分选磁珠翊圣生物12601ES网址：https://www.yeasen.com/products/detail/939
HieffNGS mRNA 分离纯化试剂盒翊圣生物12603ZH网址：https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP 标记山羊抗兔 IgG赛维尔生物GB23303网址：https://www.servicebio.cn
乳酸检测试剂盒建成生物A019-2-1网址：http://www.njjcbio.com
LDHA 特异性多克隆抗体Proteintech 集团19987-1-AP网址：https://www.ptglab.com
Light Cycler 96罗氏LC96网址：https://lifescience.roche.com
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019网址：https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEM 培养基Gibco31985-070网址：https://www.thermofisher.com/gibco
青霉素-链霉素（P/S）碧云天BL505A网址：https://www.biosharp.cn/
PKM2 特异性多克隆抗体Proteintech 集团15822-1-AP网址：https://www.ptglab.com
PMSF 碧云天ST506网址：https://www.beyotime.com
PrimeScript RT 试剂盒（完美实时）TaKaRaRR037A网址：https://www.takarabio.com
RIPA 裂解液碧云天P0013B网址：https://www.beyotime.com
测序平台华大基因（BGI）DNBSEQ-T7网址：https://www.bgi.com/global
TB Green Premix Ex TaqTaKaRaRR420A网址：https://www.takarabio.com
微量核酸检测仪奥盛仪器Nano-100网址：http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaI康为世纪生物CW0597S网址：https://www.canvaxbiotech.com
胰蛋白酶碧云天BL501A网址：https://www.biosharp.cn/
超纯 RNA 提取试剂盒（DNase I）康为世纪生物CW0597S网址：https://www.canvaxbiotech.com
β-Actin 抗体Proteintech 集团60008-1-Ig网址：https://www.ptglab.com
β-catenin 抗体 AffinityDF6794网址：https://www.affbiotech.com
β-榄香烯Sigma63965-25MG网址：https://www.sigmaaldrich.com

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