优化一次性PURE与粗提核糖体的制备以实现可重复的无细胞蛋白质合成

摘要

我们介绍一种改进的“使用重组元件进行蛋白质合成”（PURE）系统及无细胞蛋白合成用粗制核糖体的OnePot制备方案，重点在于通过控制细胞生长来最小化批次间的差异。

摘要

近期的技术进步使得蛋白质合成使用重组元件（Protein synthesis Using Recombinant Elements, PURE）的无细胞系统能够在各个独立实验室中以较低成本且劳动强度更小的方式制备。然而，构成 PURE 系统的 36 种蛋白质组分及核糖体的制备仍是一项复杂的任务，存在较大的变异和出错空间。本文提供了一种基于最新发表的 OnePot 方案的详细且更新的 PURE 系统制备流程，该流程通过调控多个关键步骤实现，特别是使用光密度（OD）标准化的甘油菌种进行接种、对细胞生长的严密监测，以及对最终甘油浓度的控制。采用该方法，我们报告了来自多个生物学重复及不同操作者的可重复的 PURE 系统制备结果。本方案可作为其他实验室制备和优化自身 PURE 系统的参考与起点，从而推动 PURE 系统在多种应用中的普及化，例如生物分子系统的自下而上构建以及合成细胞的开发。

引言

无细胞蛋白质合成（CFPS）技术已发展成熟，广泛应用于生物制造、生物传感与诊断、基因与代谢元件及通路的原型构建、快速蛋白质工程以及教育等领域^1,2。采用纯化组分构建的CFPS系统，最初被称为“利用重组元件进行蛋白质合成”（PURE）系统³，相较于基于细胞裂解物的系统具有多项优势。PURE系统具有明确的组分构成，包含36种蛋白质因子、70S E. coli 核糖体，以及包括核苷三磷酸（NTPs）、氨基酸和tRNAs在内的化学底物混合物，这些组分可根据具体应用需求任意调整。因此，该系统非常适用于非天然氨基酸的掺入、机制建模以及生物分子系统和合成细胞的自下而上构建等研究¹。尽管PURE系统可从商业供应商处获得，但其成本较高（每1 µL反应约0.34–1.63美元），限制了大规模实验的应用；而自行制备PURE系统的替代策略迄今仍受限于繁琐的实验流程，需平行纯化36种蛋白质和核糖体⁴，该过程操作复杂，难以稳定且可重复地完成，尤其对缺乏经验的操作者而言更具挑战性。

近期进展推动了PURE系统的自制生产。例如，Wang等人对大肠杆菌（E. coli）菌株进行了基因工程改造，使其翻译机制上带有基因组....

方案

该方案分为三个部分。为了简洁和清晰起见，我们重点强调本研究特有的重要改动，因此，与已有其他文献中相同的部分仅作引用说明。

初步工作仅需进行一次。该部分包含四个环节：为PURE蛋白制备甘油菌种和起始培养板，以及验证并测定各菌株的表达时间。使用起始培养板可消除直接从刮取的甘油菌种接种所带来的实验变异性。在进入生产阶段之前，必须彻底完成这些工作。由于制备PURE系统涉及大量不同的甘油菌种，因此在尝试生产系统之前，验证每个菌株的质粒完整性和蛋白表达至关重要。

工作流程示意图见图1，推荐的时间安排见表1。实验所需材料及其使用步骤详见材料表，各阶段所需缓冲液和培养基的概要总结于补充图S1中。

1. 初步工作

1. 甘油菌种的制备
   注意：所有质粒均可从 Addgene 获取。
   1. 按照标准操作流程⁹，制备 表 2 中所列所有菌株的 25% w/v 甘油菌种，并将菌种分装至冻存管中，于 -80 °C 保存。
2. P....

结果

PURE 体系与核糖体制备的工作流程见图1，推荐的工作时间安排见表1。通常通过检测荧光蛋白（如 GFP 或 mCherry）的生成来监测反应，RFU 读数可通过校准转换为浓度¹¹。然而，无细胞蛋白合成（CFPS）的产量取决于所表达的具体蛋白，因此有必要根据 Thornton 等人所述方法对系统进行优化，以高效表达目标蛋白¹⁶。优化的起点是调整“基质溶液”中各组分的含量，该溶液需与能量溶液的其他组分分开配制。这些组分包括 DNA 模板、谷氨酸钾、乙酸镁和 tRNA。我们发现，采用此种方式配制溶液可快速完成反应优化，因为针对特定实验可制备多种基质溶液，而反应体系的其余组分则保持不变。此外，可在反应体系中添加最高达 4% 的聚乙二醇（以 PEG8K 形式），以提高合成产量。

讨论

我们介绍了一种详细的实验流程，该流程使我们能够在同一实验室中，由不同批次和不同操作人员获得可重复的PURE系统。要实现这一目标，需要完成若干关键步骤。

第一个重要步骤是确保36种PURE菌株的完整性：除了对所有质粒进行测序外，还必须进行表达试验，以验证所有菌株均能正确过表达，因为丢失其中任意一种菌株都可能导致无细胞蛋白合成（CFPS）活性完全丧失。我们已观察到因突变导致表达丢失的情况，也发现过一种菌种库存中存在多种菌株的污染现象。如果需要构建敲除型ΔPURE系统，则必须排除第二种情况。在今后的研究中，将PURE系统优化为更稳定的质粒和菌株（如Zhang等人¹⁰所提出）将具有显著优势：他们的方法可与我们现有的实验方案无缝结合。

我们发现，甘油菌种的标准化以及在特定光密度下收获菌株，可确保所有细胞均处于相同的生长阶段。最初我们发现，直接刮取冻存甘油菌种启动的培养物所制备的PURE体系结果不可重复，原因是不同批次间蛋白质表达存在差异；因此，本方案避免直接使用从甘油菌种刮取获得的起始培养.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2x YT	Sigma	Y2377-250G
氨基酸	Sigma	LAA21-1KT
无RNA酶乙酸铵	Thermo Scientific	AM9070G
氯化铵	Sigma	09718-1KG
氨苄青霉素	Sigma	A8351-5G
BL21(DE3) 感受态大肠杆菌	NEB	C2527H
离心瓶（Nalgene）	Thermo Scientific	3120-9500	聚丙烯共聚物瓶
玻璃瓶（Duran）250 mL、500 mL、1 L、2 L	VWR	215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Bradford 法快速起始 1x 染色试剂	Bio-Rad	5000205
离心机	Thermo Scientific	Heraeus Megafuge 16R
微量离心机	Eppendorf	5424R
层析柱	Bio-Rad	7321010
磷酸肌酸	Sigma	27920
半微量比色皿 1.6 mL	Fisherbrand	FB55147
二水合磷酸氢二钠	Fisher Chemical	S/4450/60
透析盒，Slide-A-Lyzer G3，2 kDa 截留分子量，15 mL	Thermo Scientific	A52962
无水磷酸氢二钾	Fisher Chemical	P/5240/60
DTT 无称量试剂	Thermo Scientific	A39255
离心过滤单元，3 kDa 截留分子量 Amicon Ultra 15	EMD Millipore	UFC900324
500 mL 锥形瓶	VWR	214-1133
带挡板 2.5 L 锥形瓶	Tunair	SS-5013
亚叶酸	Sigma	F7878-100MG
甘油	Sigma	G5516-1L
HCl	Fisherbrand	H/1200/PB17
HEPES 缓冲液，1 M 溶液，pH 7.3	Thermo Scientific	BP299
咪唑	Sigma	I2399-500G
培养箱	Eppendorf	New Brunswick Innova® 42
IPTG	Thermo Scientific	R0392
KOH 颗粒	Thermo Scientific	P1767-500G
L-谷氨酸半镁盐四水合物	Sigma	49605-250G
L-谷氨酸单钾盐一水合物	Sigma	49601-500G
四水合乙酸镁	Sigma	M5661-50G
氯化镁	Fluka	63020-1L
磁力搅拌装置	Stuart	US152
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA 磁珠	NEB	S1423S
Parafilm 封口膜	Sigma	P7543-1EA
多通道移液器 Eppendorf Research Plus 30–300 µL	Eppendorf	3125000052
酶标仪用板粘性密封膜	ExcelScientific	STR-SEAL-PLT (无菌)
透气性板密封膜	Starlab	E2796-3005
铝箔板密封膜	ExcelScientific	FCS-25
酶标仪	BioTek	Synergy H1
板式振荡器	Allsheng	MBI100-4A
384 孔板	Thermo Scientific	242764
96 孔深孔板 1 mL	Thermo Scientific	736-0601
96 孔深孔板 2 mL	Sarstedt	82.1972.002
96 孔 PCR 板	Sarstedt	721,978
光学 96 孔板	Thermo Scientific	10057581
氯化钾	Sigma	P5405-500G
磷酸二氢钾	Fisher Chemical	P/4800/53
蛋白提取试剂（BugBuster）	EMD Millipore	70584-3
蛋白纯化树脂（cOmplete）	Roche	5893682001
旋转振荡器	Starlab	RM-Multi 1
氯化钠	Fisher Chemical	S/3105/70
超声探头，FisherBrand 15–50 mL	Thermo Scientific	12931181
超声仪	Fisher Scientific	FB120
分光光度计	Jenway	Genova Plus
亚精胺	Sigma	S2626-1G
TCEP 0.5 M	Supelco	646547
Tris 缓冲的 Thermo Fisher NTP	Thermo Scientific	R1481
来自大肠杆菌 MRE600 的 tRNA	Roche	10109541001
胰蛋白胨	Formedium	TRP02
0.2 mL PCR 级离心管	Sarstedt	72,737,002
7 mL 聚苯乙烯 Bijoux 管（Sterilin）	Thermo Scientific	129A
锥形离心管（Falcon）15 mL	Sarstedt	62.554.502
锥形离心管（Falcon）50 mL	Sarstedt	62.547.254
微量离心管（Eppendorf）1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
微量离心管（Eppendorf）2 mL	Sarstedt	72.695.700
S100 离心管	Beckman-Coulter	355619
S30 离心管	Thermo Scientific	3118-0050
超速离心机	Beckman-Coulter	Optima XPN-100
超速离心机转子	Beckman-Coulter	70Ti 固定角转子
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermo Scientific	10977049
涡旋振荡器	VWR	444-2791
酵母提取物	Oxoid	LP0021T