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方法文章

优化一次性PURE与粗提核糖体的制备以实现可重复的无细胞蛋白质合成

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DOI：

10.3791/68826

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2025年8月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

本文内容

摘要

我们介绍一种改进的“使用重组元件进行蛋白质合成”（PURE）系统及无细胞蛋白合成用粗制核糖体的OnePot制备方案，重点在于通过控制细胞生长来最小化批次间的差异。

摘要

近期的技术进步使得蛋白质合成使用重组元件（Protein synthesis Using Recombinant Elements, PURE）的无细胞系统能够在各个独立实验室中以较低成本且劳动强度更小的方式制备。然而，构成 PURE 系统的 36 种蛋白质组分及核糖体的制备仍是一项复杂的任务，存在较大的变异和出错空间。本文提供了一种基于最新发表的 OnePot 方案的详细且更新的 PURE 系统制备流程，该流程通过调控多个关键步骤实现，特别是使用光密度（OD）标准化的甘油菌种进行接种、对细胞生长的严密监测，以及对最终甘油浓度的控制。采用该方法，我们报告了来自多个生物学重复及不同操作者的可重复的 PURE 系统制备结果。本方案可作为其他实验室制备和优化自身 PURE 系统的参考与起点，从而推动 PURE 系统在多种应用中的普及化，例如生物分子系统的自下而上构建以及合成细胞的开发。

引言

无细胞蛋白质合成（CFPS）技术已发展成熟，广泛应用于生物制造、生物传感与诊断、基因与代谢元件及通路的原型构建、快速蛋白质工程以及教育等领域1,2。采用纯化组分构建的CFPS系统，最初被称为“利用重组元件进行蛋白质合成”（PURE）系统3，相较于基于细胞裂解物的系统具有多项优势。PURE系统具有明确的组分构成，包含36种蛋白质因子、70S E. coli 核糖体，以及包括核苷三磷酸（NTPs）、氨基酸和tRNAs在内的化学底物混合物，这些组分可根据具体应用需求任意调整。因此，该系统非常适用于非天然氨基酸的掺入、机制建模以及生物分子系统和合成细胞的自下而上构建等研究1。尽管PURE系统可从商业供应商处获得，但其成本较高（每1 µL反应约0.34–1.63美元），限制了大规模实验的应用；而自行制备PURE系统的替代策略迄今仍受限于繁琐的实验流程，需平行纯化36种蛋白质和核糖体4，该过程操作复杂，难以稳定且可重复地完成，尤其对缺乏经验的操作者而言更具挑战性。

近期进展推动了PURE系统的自制生产。例如，Wang等人对大肠杆菌（E. coli）菌株进行了基因工程改造，使其翻译机制上带有基因组整合的六组氨酸标签，从而实现单步纯化5。编码所有PURE蛋白的基因已被组装到少数质粒中，同样有助于减少纯化工作量6。Villareal等人则设计了精巧的PURE菌株共培养体系，通过平衡各组分的表达水平，以获得正确比例的蛋白质，同时实现单步纯化7。

Lavickova 等人开发的创新性 OnePot PURE 系统在使用便捷性方面具有巨大潜力8,9。在该系统中，原始的 PURE 菌株被共培养，并通过单一层析步骤进行纯化。尽管无法精确定义所得 PURE 系统的组成，但作者证明了该系统的多个批次具有高度可重复性，并且通过调整每种菌株的接种体积可实现粗略水平的控制。以精确组分控制为代价换取生产便利性的权衡，对于许多用户而言是可接受的，因为 OnePot 系统的整体蛋白质合成产量与商业产品相当。然而，尽管已有详细的 OnePot 系统操作方案，其他实验室在完全重现 Lavickova 等人的结果方面仍面临挑战。例如，已观察到表达载体不稳定、菌株生长缓慢以及蛋白质降解等问题10。

在本研究中，我们介绍了一种详细且经过优化的OnePot PURE方案，该方案通过使用标准化的甘油菌种和培养基调整来控制细胞生长，提供了监测生长及收获时OD值的指导，并对最终纯化步骤中甘油的用量进行了标准化。其次，我们介绍了一种仅采用差速超速离心法优化的粗制核糖体纯化流程，该方法在核糖体活性与更复杂方法所需的成本及操作难度之间实现了平衡。

尽管这使得OnePot方案的步骤有所增加，但如果需要，用户可以更充分地对实验过程进行故障排查，并根据自身需求对其进行修改。我们通过在同一实验室中由多名操作人员完成的多次生物学重复实验，证明了该流程的可重复性。我们发现，对PURE组分和核糖体制备过程的控制对于确保该系统在无细胞蛋白表达（CFPS）中具有高效性能至关重要。

PURE 体系的制备和核糖体的制备分别需要 4 至 5 天，可由一名操作者依次完成，也可由两名操作者同时进行。PURE 体系的制备涉及 4 份 500 mL 液体培养物，每份可获得约 2 g 细胞沉淀，最终得到约 1 mL 浓度约为 15 mg/mL 的 PURE 蛋白。核糖体的制备涉及 4 × 500 mL = 2 L 液体培养物，总共可获得约 3 g 细胞沉淀，最终得到约 1 mL 浓度约为 17 µM 的粗制核糖体。本方案所制备的 PURE 体系在 2 小时的批次反应中，GFP 的合成产量可达约 100 µg/mL，mCherry 可达约 130 µg/mL11，该结果与原始的 OnePot 系统以及商业系统（约 140–160 µg/mL）相比具有良好的竞争力8,12。因此，该体系可作为进一步优化的良好起点，例如通过补充或调节盐离子、分子拥挤剂以及个别蛋白因子等敏感组分来提升性能。

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方案

该方案分为三个部分。为了简洁和清晰起见，我们重点强调本研究特有的重要改动，因此，与已有其他文献中相同的部分仅作引用说明。

初步工作仅需进行一次。该部分包含四个环节：为PURE蛋白制备甘油菌种和起始培养板，以及验证并测定各菌株的表达时间。使用起始培养板可消除直接从刮取的甘油菌种接种所带来的实验变异性。在进入生产阶段之前，必须彻底完成这些工作。由于制备PURE系统涉及大量不同的甘油菌种，因此在尝试生产系统之前，验证每个菌株的质粒完整性和蛋白表达至关重要。

工作流程示意图见图1，推荐的时间安排见表1。实验所需材料及其使用步骤详见材料表，各阶段所需缓冲液和培养基的概要总结于补充图S1中。

1. 初步工作

  1. 甘油菌种的制备
    注意：所有质粒均可从 Addgene 获取。
    1. 按照标准操作流程9，制备 表 2 中所列所有菌株的 25% w/v 甘油菌种，并将菌种分装至冻存管中，于 -80 °C 保存。
  2. PURE 起始平板的制备（过夜培养）
    1. 配制 20 mL LB 培养基，添加 100 µg/mL 氨苄青霉素（LB+AMP）。
    2. 标记 36 个无菌的 1.5 mL 微量离心管，编号为 #1 至 #36。
    3. 向每个管中加入 500 µL LB+AMP。使用移液枪头从原始甘油菌种中刮取少量菌体接种至对应编号的管中。确保甘油菌种未完全融化。充分涡旋混匀。
    4. 使用多通道移液器，将每个接种后的管中 300 µL 培养物转移至无菌 1 mL 96 孔深孔板的对应孔中，布局参照 图 2 所示。
      注意：在后续所有涉及平板的操作中，均需保持相同的孔板布局。
    5. 将该深孔板置于摇床中，37 °C、1,000 RPM 振荡培养 15 小时，过夜。
    6. 次日，准备 25 mL 添加了 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基（LB+AMP）以及 15 mL 无菌的 50% (v/v) 甘油。
    7. 使用多通道移液器，将深孔板中每种培养物各 30 µL 转移至光学 96 孔板的底部。向每个含有培养物的孔中加入 270 µL LB+AMP 培养基，使每种培养物稀释 10 倍。
    8. 使用酶标仪测定每种培养物的 OD600。计算将每种培养物接种至 650 µL 新鲜 LB+AMP 培养基中、使其起始 OD600 达到 0.2 所需的接种体积。用于辅助计算的电子表格作为 补充表 S1 提供。
    9. 准备三个新的无菌 1 mL 96 孔深孔板。在其中一个板中，向 36 个孔各加入 650 µL LB+AMP，并根据计算结果向每个孔接种相应体积的过夜培养物，使 OD600 = 0.2。
    10. 将接种后的培养物各 300 µL 分别转移至另外两个深孔板中。其中一个板用于后续培养，另一个用于监测 OD 值。将这两个板置于摇床中，37 °C、1000 RPM 振荡培养，直至培养物 OD600 达到约 1（约 1.5–2 小时）。在培养 1 小时后开始监测 OD 值，之后根据需要再次检测：从第二个板中取出 30 µL 样品，加入 270 µL LB+AMP 进行 10 倍稀释后测定。
    11. 当个别孔的培养物 OD600 达到约 1 时，将其从摇床中取出。向每种培养物中加入等体积的无菌 50% (v/v) 甘油，使最终甘油浓度为 25%，且 OD600 = 0.5。充分混匀后，将这些管置于冰上保存。这些即为 主工作菌种。
    12. 将每种主工作菌种最多分装 40 µL 至 96 孔 PCR 板中，保持原始孔位布局。根据储存能力，可分装至多个 PCR 板中。用铝箔封板膜密封后，于 -80 °C 保存这些 PURE 起始板。
      注意：这些起始板最多只能冻融 3 次。若超过此限制，应更换新板，以保持菌株的完整性和实验的可重复性。
  3. 确定起始培养物的生长时间（过夜培养）
    1. 将一块 PURE 起始板置于冰上解冻。
    2. 在无菌锥形管中，向 50 mL 无菌 LB 培养基中加入 50 µL 100 mg/mL 氨苄青霉素，配制成 LB+AMP 培养基。
    3. 标记 36 个无菌的 1.5 mL 微量离心管，编号为 #1 至 #36，每管加入 1 mL LB+AMP 培养基。
    4. 将每种甘油菌种各 10 µL 接种至对应编号的管中，充分涡旋混匀。
    5. 将每管接种后的培养物各 300 µL 转移至无菌 1 mL 96 孔深孔板的对应孔中。用透气封板膜密封后，将该培养板置于摇床中，37 °C、1000 RPM 振荡培养。测定并记录各培养物达到 OD600 ~2–3 所需时间，且确保不超过 OD600 = 3。在进行后续实验前，需先确定此参数。
      注意：在本实验室中，此过程通常需要 15 小时。
  4. PURE 菌株的表达试验
    1. 准备 38 mL LB 培养基，添加 100 µg/mL 氨苄青霉素（LB+AMP）、10 mM IPTG 储液和 1× 蛋白提取试剂。
    2. 将一块 PURE 起始板置于冰上解冻。
    3. 向无菌 2 mL 96 孔深孔板的 36 个孔中各加入 1 mL LB+AMP。每孔接种 20 µL 对应的起始培养物。将该板置于摇床中，37 °C、1000 RPM 振荡培养约 1 小时，或直至 OD600 达到 2。
    4. 通过向每孔加入 10 µL 10 mM IPTG 诱导蛋白表达，使终浓度为 0.1 mM。继续在 37 °C、1000 RPM 条件下振荡培养 3 小时。
    5. 3 小时表达结束后，将每种培养物各 700 µL 转移至 36 个无菌的 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 10 分钟。小心弃去上清液。
    6. 将每个沉淀重悬于 70 µL 1× 蛋白提取试剂中。室温下轻柔振荡孵育 30 分钟，以实现细胞裂解。
    7. 将裂解液在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟，使不溶性组分沉淀。
    8. 根据生产商说明书，使用 Ni-NTA 磁珠对每种蛋白进行小规模 His 标签蛋白纯化。
    9. 通过 SDS-PAGE 分析纯化后的蛋白，以确认各蛋白的表达情况及是否存在菌株间的交叉污染9。
      注意：表达蛋白的菌株在 SDS-PAGE 上会显示出与目标蛋白预期分子量相符的明显条带。若未检测到条带，可能表明该菌株未表达蛋白。此时应提取质粒并进行测序，以确认序列的正确性和完整性，必要时更换质粒。

2. OnePot PURE 蛋白纯化（4 天）

注意：单次PURE系统制备需要处理500 mL液体培养物。建议同时进行4次500 mL的制备，以便在一次实验中获得四个独立的PURE批次。这些批次可分别定量，或根据需要合并使用。通过将树脂孵育步骤过夜进行，可将原本4天的实验流程缩短至3天，但这会导致第3天工作时间较长。以下详细说明这两种方案。

  1. 第1天：材料准备与起始培养物的培养
    1. 按照补充表S2和补充图S1中的说明配制PURE体系制备所需的储备液和缓冲液。
      注意：在执行本方案各步骤前立即配制所需的培养基和缓冲液，并仅在规定天数内储存后使用。
    2. 将一块PURE起始培养板置于冰上解冻。
    3. 在无菌的50 mL锥形管中，向50 mL无菌LB培养基加入50 µL浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素（LB+AMP）。
    4. 标记36个1.5 mL无菌微量离心管，编号为#1至#36，每个管中加入1 mL LB+AMP。
    5. 向每个标记好的管中加入10 µL相应的甘油菌种，并通过涡旋充分混匀。
      注意：为便于追踪每种菌株的接种情况，在向每个管中加入菌种后，将移液器吸头弃入PURE起始板的对应孔中。对所有菌株重复此操作。完成后，在用铝箔和高压灭菌胶带重新密封前，小心地从板中取出所有移液器吸头，并将板储存于-80°C。
    6. 除菌株#25（EF-Tu）外，将每个管中的接种培养物各取300 µL加入无菌的1 mL 96深孔板的对应孔中。用透气封板膜密封板子。将培养板置于摇床中，在1,000 RPM、37 °C条件下培养14小时。
    7. 将管#25中的接种培养物1 mL加入含10 mL LB培养基的50 mL锥形管中，以制备EF-Tu起始培养物。将该管置于培养箱中，在260 RPM、37 °C条件下培养14小时。
      注意：菌株#25（EF-Tu）所需浓度远高于其他组分，因此需单独处理，具体方法见原始方案8。
    8. 将2 L无菌的预热2x YTP培养基放入2 L玻璃瓶中，并置于静置培养箱中于37°C过夜预热。
  2. 第2天：培养与收集菌体
    1. 准备所需试剂：
      1. 2 L无菌预热的2x YTP培养基（来自第1天）
      2. 2 mL浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素
      3. 100 mM IPTG，无菌
      4. 100 mL PBS，无菌，冰浴
      5. 10 mL LB培养基
    2. 使用多通道移液器，将起始深孔板及EF-Tu起始管中的每种起始培养物各30 µL转移至光学96孔板的底部。
    3. 向含有培养物的每个孔中加入270 µL LB培养基，使每种培养物稀释10倍。
    4. 使用酶标仪测定每种培养物的OD600。所有菌株的OD600应为2-3。
      注意：若某培养物过度生长至OD600 > 3，应使用2x YTP+AMP（补充表S1）将其稀释至OD600 = 3。过度生长的起始培养物稀释过程耗时且易出错。因此，建议根据预实验部分1.3所述，确定达到OD600 2-3所需的精确培养时间。
    5. 将500 mL预热的2x YTP培养基和500 µL浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素转移至一个无菌的2.5 L带挡板锥形瓶中（2x YTP+AMP）。
    6. 在一个无菌的15 mL锥形管中，加入起始培养板中每种培养物各55 µL，以及EF-Tu培养物1675 µL。通过涡旋充分混匀。
      注意：此即OnePot培养物，将所有PURE菌株混合在一起。在此阶段，可通过省略某些菌株来构建敲除（ΔPURE）系统，或添加其他需要共纯化的组分。
    7. 将该管内容物加入含500 mL 2x YTP+AMP的2.5 L带挡板锥形瓶中。重复步骤5-7，获得4个独立的培养物。
    8. 将锥形瓶置于260 RPM、37 °C条件下培养1.5-2小时，直至OD600达到0.2-0.3。
    9. 当OD600达到0.2-0.3时，向每个锥形瓶中加入500 µL浓度为100 mM的IPTG，使最终诱导浓度为0.1 mM IPTG。
    10. 继续在260 RPM、37 °C条件下培养3小时。
    11. 在培养期间，称重并标记四个无菌的50 mL锥形管。
    12. 根据需要将离心机预冷至4 °C，并标记和预冷四个聚丙烯共聚物离心瓶。
    13. 将四个标记好的500 mL玻璃瓶放入冰水浴中。
    14. 3小时培养结束后，小心地将每种培养物倾倒入冰上的玻璃瓶中以终止生长。
      注意：将培养物转移至冷却瓶中对快速终止生长至关重要：将热锥形瓶直接放入冰水浴中无法有效终止生长。除非另有说明，后续所有步骤均在冰上进行。
    15. 将每种培养物各250 mL加入对应的离心瓶中，在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟，同时将剩余的250 mL保留在冰水浴中。
    16. 小心倾去上清液，并用纸巾吸干。
    17. 将每种培养物剩余的250 mL加入对应的离心瓶中，再次在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    18. 小心倾去上清液，并用纸巾吸干。
    19. 向每个离心瓶中加入20 mL无菌冰浴PBS，并彻底重悬菌体沉淀。
    20. 将每种重悬液转移至准备好的50 mL锥形管中。
    21. 将管子在2,000 × g、4 °C条件下离心8分钟。
    22. 通过小心倾倒去除上清液。
    23. 再次将管子在2,000 × g、4 °C条件下离心2分钟。
    24. 用移液器吸除残留上清液，并将菌体沉淀保持在冰上。
    25. 此时每个管中含有来自单个500 mL培养物的菌体沉淀。称量每个管子，通过减去空管重量计算菌体沉淀质量（通常约为2 g），并记录。
    26. 迅速冷冻菌体沉淀，并于-80 °C储存直至裂解。
      注意：可选择继续进行裂解步骤，将本方案缩短为3天完成。
  3. 第3天：裂解、纯化与透析
    1. 准备所需试剂：
      1. 配制50 mL重悬缓冲液。
      2. 配制0.5 M TCEP。
    2. 在冰上解冻菌体沉淀。
    3. 将50 mL重悬缓冲液分装至一个50 mL锥形管中，加入100 µL 0.5 M TCEP。通过涡旋充分混匀。
    4. 按照每1 g菌体沉淀使用2 mL的比例，用含TCEP的重悬缓冲液重悬菌体沉淀。充分涡旋以完全重悬。
    5. 将细胞重悬液分装至50 mL锥形管中，每管含5 mL悬液。根据需要标记管子以区分4个独立的培养物。置于冰上储存。
    6. 在冰水浴中使用冷却的超声探头，以30%振幅、开20秒、关20秒、循环10次的方式进行超声裂解（图3A、B）。
      注意：超声过程中应向每管传递约1000 J的能量。使用固定支架确保管子位置稳定，以保证能量传递的一致性。
    7. 将裂解液分装至2 mL无菌微量离心管中，每管含1 mL裂解液。重复步骤2.3.6和2.3.7以裂解全部4个培养物。以下步骤并行处理4个裂解液。
    8. 在15,923 × g、4 °C条件下离心20分钟。
    9. 在离心过程中，清洗并平衡5 mL蛋白纯化树脂（为4个裂解液准备4个层析柱）：
      1. 将2 mL新鲜蛋白纯化树脂加入重力流层析柱中。
      2. 用30 mL无菌蒸馏水洗涤柱子两次，以去除储存用乙醇。
      3. 向30 mL重悬缓冲液中加入60 µL 0.5 M TCEP，使其终浓度为1 mM。
      4. 由于柱子体积为30 mL，直接将缓冲液倒入柱中至充满。关闭阀门后，加入30 mL含TCEP的重悬缓冲液平衡柱子。
      5. 打开阀门使约25 mL缓冲液流过，然后关闭柱阀，保留约5 mL缓冲液在树脂床上方以防止干燥。柱子现已准备就绪。
    10. 离心结束后，将每种培养物的全部澄清上清液（无沉淀）合并至4个新的50 mL锥形管中，置于冰上。
    11. 将各柱中剩余的5 mL含TCEP的重悬缓冲液中的树脂重悬，并将缓冲液和树脂加入含有裂解液上清的锥形管中。
    12. 盖紧管盖并用Parafilm密封，在4 °C条件下于旋转摇床中孵育5小时。
      注意：若裂解后立即进行此步骤，可将裂解液与树脂在4 °C孵育过夜。
    13. 准备所需试剂：
      1. 向洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中加入TCEP，使其终浓度为1 mM，并于4 °C储存至使用。
      2. 准备好20%（v/v）乙醇。
    14. 孵育结束后，在离心机中短暂离心以使树脂沉降至管底。
    15. 用移液器重悬树脂，并将树脂重新加回蛋白纯化柱中。
    16. 待树脂在柱底形成树脂床后，让缓冲液流过。
      注意：可选择性收集流穿液和洗涤液，通过SDS-PAGE分析以排查纯化过程中的问题。
    17. 用一个柱体积的含TCEP洗涤缓冲液洗涤柱子。
    18. 向柱中加入5 mL含TCEP的洗脱缓冲液，用移液器多次重悬树脂，孵育10分钟。
    19. 孵育结束后，将洗脱液收集至标记好的5 mL Bijoux管中，并置于冰上储存。
    20. 清洗并储存蛋白纯化树脂：
      1. 洗脱完成后，用30 mL洗脱缓冲液洗涤柱子，以去除任何残留的结合蛋白。
      2. 用30 mL无菌蒸馏水冲洗树脂，重复3次。
      3. 让30 mL 20%（v/v）乙醇通过柱子一次。
      4. 用20%乙醇充满柱子，并用盖子或Parafilm密封。储存于4 °C以备下次使用。
        注意：仅需清洗，切勿尝试从树脂中剥离镍离子。清洗后的树脂适用于标准PURE体系的常规制备；但对于ΔPURE体系变体，为避免交叉污染，应始终使用新鲜树脂。
    21. 将一个15 mL 2 kDa透析盒在不含TCEP的Buffer HT中浸泡10分钟。
    22. 向透析盒中加入5 mL洗脱的蛋白溶液。
    23. 在盖上盖子前，尽可能排出盒内空气。
    24. 将5 mL洗脱蛋白溶液对1 L不含TCEP的Buffer HT透析2小时，随后更换为1 L新鲜Buffer HT，在4 °C轻柔搅拌下继续透析过夜。
      注意：若合并多个纯化产物的洗脱液，最多可将10 mL洗脱液对2 L Buffer HT透析2小时，随后再对2 L Buffer HT透析过夜。若树脂孵育过夜，透析可在白天进行，采用2小时+4小时的方案，随后立即进行下述蛋白浓缩步骤。
  4. 第4天：浓缩与储存
    1. 准备所需试剂：
      1. 配制Buffer HT Refresh + TCEP。
      2. 配制Stock-60 + TCEP。
    2. 透析完成后，从透析盒中取出5 mL透析样品，分装至5个2 mL无菌微量离心管中，每管500 µL。
    3. 在14,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，以沉淀可能析出的蛋白。
    4. 合并无沉淀的上清液，加入3 kDa MWCO离心过滤装置中，并用10 mL Buffer HT Refresh + TCEP补足体积。
    5. 在3,220 × g、4 °C条件下离心30分钟，或直至样品体积减少至1.5 mL。
      注意：浓缩过程中蛋白沉淀会显著降低整体CFPS性能。每次30分钟离心后，使用1 mL移液器在离心过滤管中重悬样品，以使沉淀蛋白从滤膜底部脱离。
    6. 从离心装置中取出样品，分装至3个2 mL无菌微量离心管中，每管500 µL。
    7. 在14,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，以沉淀可能析出的蛋白。
    8. 将无沉淀的上清液合并至一个新鲜的无菌微量离心管中，置于冰上。
    9. 按照制造商说明，使用Bradford法测定溶液中蛋白浓度。
    10. 将蛋白溶液加入新的3 kDa MWCO滤膜中，在14,862 × g、4 °C条件下离心15分钟，或直至样品体积达到，最终浓度为25-30 mg/mL。
    11. 从离心装置中取出样品，分装至2 mL无菌微量离心管中，每管500 µL。
    12. 在14,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，以沉淀可能析出的蛋白。
    13. 使用Bradford法测定蛋白浓度。仅当浓度在25-30 mg/mL之间时，方可进行下一步。
    14. 将无沉淀的上清液合并至一个新鲜的微量离心管中，置于冰上。
    15. 向浓缩的蛋白溶液中加入等体积的Stock-60 + TCEP，并通过轻柔移液混匀。
    16. 使用Bradford法测定最终蛋白浓度。
      注意：此时蛋白处于含30%甘油的Buffer HT中，后续用Stock-30进一步稀释不会改变甘油浓度。
    17. 如需，可用Stock-30 + TCEP稀释样品，使最终浓度约为12.5 mg/mL。
    18. 将PURE蛋白溶液以20 µL为一份分装至PCR管中，液氮速冻后于-80 °C储存。
      注意：在加入Stock-60前必须准确测定蛋白浓度，因为含有甘油的蛋白溶液若再行浓缩，会导致最终CFPS反应中甘油含量不一致，从而影响CFPS性能的稳定性。因此，仅当确认蛋白浓度处于25-30 mg/mL的最佳范围后，才应加入Stock-60。

3. 粗制核糖体的制备（5 天）

注意：核糖体纯化方案已针对 2 L（4 个 500 mL 三角瓶）液体培养物的处理进行了优化，可获得约 3 g 细胞沉淀，最终得到约 1 mL 浓度为 15–24 µM 的粗制核糖体。

  1. 第1天：起始培养物的制备与培养
    1. 按照补充表S2和补充图S1所述方法配制核糖体提取所需的储备液和缓冲液。
      注意：在执行本方案各步骤前即时配制所需的培养基和缓冲液，且存放时间不得超过建议的最大天数。
    2. 准备两个50 mL锥形管：向其中一个加入10 mL LB培养基，另一个加入5 mL LB培养基。
    3. 从-80 °C冰箱中取出BL21(DE3)甘油菌种，并置于冰上，确保在菌种完全融化前完成后续操作。
    4. 用移液枪刮取少量甘油菌种中的细胞接种至10 mL LB培养基中，制备LB“小规模培养物”。将该培养物与另一未接种的LB培养基一同在37 °C、220 RPM条件下孵育，以检测培养基是否污染，所有培养过程均不使用抗生素。
    5. 将甘油菌种放回-80 °C冰箱保存。
    6. 将2.2 L无菌优质肉汤（TB）分装至无菌玻璃瓶中，置于静止培养箱内37 °C预热过夜。
  2. 第2天：培养与收集菌体
    1. 从培养箱中取出培养物，确认未接种的对照管及预热的TB培养基瓶中无污染后，方可继续操作。
    2. 在1 cm比色皿中，将100 µL小规模培养物加入900 µL LB培养基中，制备10倍稀释液，并使用分光光度计测定OD600（应约为4–6） 。
    3. 向一个无菌500 mL锥形瓶中加入200 mL预热的TB培养基，并根据所需体积接种小规模培养物，使初始OD600 = 0.05（参见补充表S1）。此为“中等规模培养物”（midi-culture）。
    4. 将中等规模培养物在37 °C、220 RPM条件下孵育，直至OD600 = 1，通常需1.5–2小时。
    5. 向4个无菌2.5 L带挡板的锥形瓶中各加入500 mL TB培养基，并分别接种适量中等规模培养物，使初始OD600 = 0.05（参见补充表S1）。这4个培养物即为“大规模培养物”（maxi-cultures）。
    6. 将大规模培养物在37 °C、220 RPM条件下孵育，直至OD600 = 0.7–0.8，通常需1.5–2小时。
    7. 在此期间，将4个洁净的聚丙烯共聚物离心管和4个洁净的500 mL玻璃瓶标记后置于冰上预冷。
      注意：在培养1小时后，每15分钟检测一次大规模培养物的密度，以避免OD600 超过0.7。
    8. 当OD600 = 0.7时，迅速将培养物转移至预冷的玻璃瓶中，并放入冰水浴中冷却20分钟，以终止生长。
      注意：将培养物转移至预冷瓶中是快速终止生长的关键；若直接将锥形瓶放入冰水浴中，无法有效终止生长。除非另有说明，后续所有操作均需在冰上进行。
    9. 在培养物于冰水浴中冷却的同时，预冷离心机用于收集菌体，并将500 mL PBS溶液置于冰上冷却。
    10. 20分钟后，将每份培养物各250 mL转移至对应的预冷离心管中，在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟，其余250 mL继续保留在冰上。
    11. 小心倾去上清液，并用纸巾吸干管口残留液体。
    12. 将每份培养物剩余的250 mL加入对应离心管中，再次在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    13. 倾去上清液，并用纸巾吸干管壁，然后将菌体沉淀放回冰上。
    14. 向每个离心管中加入30 mL无菌冰冻PBS，充分重悬菌体沉淀。
    15. 称重并标记4个洁净的50 mL锥形管。
    16. 将菌悬液转移至4个50 mL锥形管中。
    17. 再次在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    18. 倾去上清液，并用纸巾吸干管壁，然后将菌体沉淀放回冰上。
    19. 向每个锥形管中加入30 mL无菌冰冻PBS，通过涡旋充分重悬菌体沉淀。
    20. 再次在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    21. 倾去上清液，并用纸巾吸干管壁，然后将菌体沉淀放回冰上。
    22. 向每个锥形管中加入30 mL无菌冰冻PBS，通过涡旋充分重悬菌体沉淀。
    23. 再次在3,220 × g、4 °C条件下离心10分钟。
    24. 倾去上清液，并用纸巾吸干管壁，然后将菌体沉淀放回冰上。
    25. 最后一次在3,220 × g、4 °C条件下离心2分钟。
    26. 用移液器吸除多余的上清液。
    27. 称量并记录每个锥形管的质量。菌体沉淀质量为当前总质量与空管质量之差（应约为1 g）。
    28. 使用液氮速冻菌体沉淀，并于-80 °C保存。
  3. 第3天：裂解、超速离心及Buffer B浸泡
    1. 将菌体沉淀置于冰上解冻。
    2. 向一个洁净锥形管中加入50 mL核糖体缓冲液A（Ribosome Buffer A）。
    3. 从该锥形管中取出100 µL核糖体缓冲液A，加入至一个无称量DTT小瓶中，完全溶解DTT颗粒，得到0.5 M DTT储备液。
      注意：后续各步骤中，按相同方法使用相应缓冲液配制0.5 M DTT储备液。
    4. 将100 µL 0.5 M DTT加回50 mL锥形管中，使核糖体缓冲液A中DTT终浓度为1 mM。保持溶液在冰上。
    5. 按照每1 g菌体沉淀加入2 mL的比例，用含DTT的核糖体缓冲液A充分重悬各菌体沉淀。将所有重悬液合并至一个锥形管中，总体积应为10 mL（来自2 L培养物）。如体积不足，可用额外的含DTT核糖体缓冲液A补足至10 mL。
    6. 将悬液均分为两份，每份5 mL，分别装入两个锥形管中。
    7. 在冰水浴中使用预冷的超声探头对每管进行超声裂解，设置为30%振幅，工作20秒，间歇20秒，共10个循环（总程序时长3分20秒）（图3A，3C）。
      注意：每管超声过程中应传递约1,000 J能量。使用固定支架固定离心管，以确保能量传递的一致性。
    8. 每管裂解液用含DTT的核糖体缓冲液A补至25 mL体积，并短暂涡旋混匀。
    9. 将样品转移至两个预冷的S30离心管中。
    10. 在4 °C条件下以30,000 × g离心1小时（图3E）。
    11. 从每个S30管中回收最多75%的无沉淀上清液（避免沉淀中的膜成分污染），转移至两个洁净的预冷S30管中。
    12. 在4 °C条件下以30,000 × g离心30分钟。
    13. 回收最多75%的无沉淀上清液至两个洁净的50 mL锥形管中，并用含DTT的核糖体缓冲液A补至每管25 mL。
    14. 将样品转移至两个洁净的预冷S100管中。
      注意：超速离心前需确保离心管精确配平（对称管间质量差不超过0.01 g），且每管体积为25 mL（S100管最大容量）。
    15. 在4 °C条件下以100,000 × g离心4小时（图3F）。
    16. 在S100离心程序结束前30分钟，使用冰冻的核糖体缓冲液B按上述方法配制0.5 M DTT储备液，并制备50 mL含1 mM DTT的核糖体缓冲液B。
    17. 倾去超速离心管中的上清液。向每个含有核糖体沉淀的S100管中加入5 mL冰冻的含DTT核糖体缓冲液B。剩余的含DTT核糖体缓冲液B于4 °C保存，供次日使用。
    18. 将离心管置于冷室中的冰上孵育，使核糖体沉淀在含DTT的核糖体缓冲液B中过夜浸泡。
      注意：确保核糖体沉淀完全浸没于含DTT的核糖体缓冲液B中。可通过将离心管倾斜放置于冰中实现（图3D）。
  4. 第4天：超速离心及Buffer C浸泡
    1. 次日，向每个含有过夜浸泡核糖体沉淀的S100管中再加入5 mL冰冻的含DTT核糖体缓冲液B。
    2. 尝试用移液器轻轻重悬沉淀。用枪头轻轻刮下管壁上的沉淀并重悬。将内容物转移至两个洁净的预冷S30管中。
    3. 向每个S100管中再加入10 mL冰冻的含DTT核糖体缓冲液B，并重复上述重悬步骤。
    4. 将所有重悬液合并至之前使用的同一S30管中。
    5. 在4 °C条件下以30,000 × g离心1小时（图3G）。
    6. 回收最多75%的无沉淀上清液至两个洁净的50 mL锥形管中，并用含DTT核糖体缓冲液B补至每管25 mL。
    7. 将样品转移至两个洁净的预冷S100管中。
      注意：超速离心前需确保离心管精确配平，且每管体积为25 mL（S100管最大容量）。
    8. 在4 °C条件下以100,000 × g离心4小时（图3H）。
    9. 在S100离心程序结束前30分钟，使用冰冻的核糖体缓冲液C按上述方法配制0.5 M DTT储备液，并制备5 mL含1 mM DTT的核糖体缓冲液C。将该缓冲液置于冰上保存。
    10. 超速离心结束后，倾去上清液，并用移液器吸除残留缓冲液。操作需迅速，避免沉淀长时间暴露于无缓冲液状态。
    11. 向每个含有核糖体沉淀的超速离心管中加入400 µL冰冻的含DTT核糖体缓冲液C。
    12. 将离心管置于冷室中的冰上孵育，使核糖体沉淀在含DTT核糖体缓冲液C中过夜浸泡。
      注意：确保核糖体沉淀完全浸没于含DTT核糖体缓冲液C中。可通过将离心管倾斜放置于冰中实现。
  5. 第5天：收集
    1. 次日，使用1 mL移液器轻轻重悬核糖体沉淀，并通过轻柔摇晃使透明环状的核糖体沉淀完全溶解。
      注意：此时核糖体沉淀应完全溶解于缓冲液中，不应有不溶性沉淀残留；若存在黄色不溶性沉淀，请勿尝试重悬，仅重悬透明环状的核糖体沉淀部分。
    2. 将核糖体溶液转移至两个无菌2 mL微量离心管中，在4 °C条件下以20,000 × g离心10分钟，以沉淀任何残留的不溶物。
    3. 收集无沉淀的上清液至洁净离心管中，并置于冰上保存（图3I）。
    4. 取2 µL核糖体溶液加入198 µL核糖体缓冲液C中，制备100倍稀释液，设三个重复。
    5. 测定260 nm处的RNA浓度；稀释样品的吸光度每10个单位相当于24 µM核糖体13。
    6. 根据用户需求分装核糖体溶液（例如50 µL/管），在液氮中速冻（最高浓度不超过24 µM），并于-80 °C保存备用。
      注意：本方案通常可获得约1 mL浓度为12–18 µM的核糖体溶液。若浓度过低，可使用3 kDa截留分子量（MWCO）滤膜进行浓缩8。

4. 建立CFPS实验

  1. 初步工作
    1. 根据既定方案制备DNA模板（线性或质粒）9。
      注意：在我们的实验室中，使用基于T7p14表达系统的DNA模板，该系统已针对无细胞表达进行了优化14。纯化的PCR产物可用作线性模板。需要注意的是，质粒在小量提取后必须进行纯化处理，不同商业试剂盒所得结果可能存在差异15。
    2. 按照表3所述配制5倍能量溶液。
    3. 按照表4所述配制6倍基质溶液。
  2. 建立并监测PURE反应
    注意：本方案描述了使用主混合液进行三重重复测量的设置方法。可根据需要增加或减少反应数量，使用补充表S3提供的电子表格进行计算，但我们建议每个实验条件至少设置三个重复。
    1. 将所需量的PURE组分、核糖体、能量溶液和基质溶液置于冰上解冻。
    2. 在PCR管中配制一组三重反应的主混合液，总体积为17 µL，组分添加顺序如下：能量溶液、PURE蛋白、核糖体、基质溶液，最后用无核酸酶水补足至17 µL，具体配比见表5。
    3. 将移液器设定为5.1 µL，轻柔吸取溶液5–6次以充分混匀，确保混合均匀。
    4. 使用相同的移液器设定（5.1 µL），将主混合液分别加入光学384孔板中的三个独立孔中。操作时避免超过移液器第一停点，以防产生气泡。每个重复之间至少留出一个空孔，以最大限度减少荧光串扰。
    5. 使用粘性板封膜密封反应板。
    6. 根据需要进行后续孵育或使用酶标仪检测。
      注意：当加入含有甘油的额外组分（例如增强蛋白）时，应确保这些组分的最终体积不超过反应总体积的10%。例如，在17 µL的主混合液中，含30%甘油的组分体积应限制在1.7 µL以内。
      加样后切勿对384孔板进行离心。离心可能导致富含甘油的组分（如PURE系统）发生分离，从而引起表达水平不一致。该孔板设计适用于小体积反应，通过仔细移液即可确保液体充分沉降，无需离心。

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结果

PURE 体系与核糖体制备的工作流程见图1，推荐的工作时间安排见表1。通常通过检测荧光蛋白（如 GFP 或 mCherry）的生成来监测反应，RFU 读数可通过校准转换为浓度11。然而，无细胞蛋白合成（CFPS）的产量取决于所表达的具体蛋白，因此有必要根据 Thornton 等人所述方法对系统进行优化，以高效表达目标蛋白16。优化的起点是调整“基质溶液”中各组分的含量，该溶液需与能量溶液的其他组分分开配制。这些组分包括 DNA 模板、谷氨酸钾、乙酸镁和 tRNA。我们发现，采用此种方式配制溶液可快速完成反应优化，因为针对特定实验可制备多种基质溶液，而反应体系的其余组分则保持不变。此外，可在反应体系中添加最高达 4% 的聚乙二醇（以 PEG8K 形式），以提高合成产量。

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讨论

我们介绍了一种详细的实验流程，该流程使我们能够在同一实验室中，由不同批次和不同操作人员获得可重复的PURE系统。要实现这一目标，需要完成若干关键步骤。

第一个重要步骤是确保36种PURE菌株的完整性：除了对所有质粒进行测序外，还必须进行表达试验，以验证所有菌株均能正确过表达，因为丢失其中任意一种菌株都可能导致无细胞蛋白合成（CFPS）活性完全丧失。我们已观察到因突变导致表达丢失的情况，也发现过一种菌种库存中存在多种菌株的污染现象。如果需要构建敲除型ΔPURE系统，则必须排除第二种情况。在今后的研究中，将PURE系统优化为更稳定的质粒和菌株（如Zhang等人10所提出）将具有显著优势：他们的方法可与我们现有的实验方案无缝结合。

我们发现，甘油菌种的标准化以及在特定光密度下收获菌株，可确保所有细胞均处于相同的生长阶段。最初我们发现，直接刮取冻存甘油菌种启动的培养物所制备的PURE体系结果不可重复，原因是不同批次间蛋白质表达存在差异；因此，本方案避免直接使用从甘油菌种刮取获得的起始培养...

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披露

SL 是 Biophoundry 公司的联合创始人兼首席技术官，该公司致力于开发用于噬菌体工程的无细胞技术。

致谢

NL、SL、AB 和 NZ 受 NL 的英国研究与创新署未来领袖奖学金（UKRI Future Leaders Fellowship，项目编号 MR/V027107/1）资助。SL 还额外获得 Biophoundry 公司的支持。SY 获得爱丁堡大学达尔文信托博士生奖学金的资助。CW 获得英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC Eastbio）博士生奖学金的资助。作者感谢 A. Pompa 在使用超速离心机方面提供的帮助，该设备由惠康基金会隐藏细胞生物学发现研究平台 [226791] 提供资金支持。此外，我们感谢 B. Lavickova 和 S. J. Maerkl 在建立原始 OnePot 方案过程中提供的协助。为了实现开放获取，作者已对本提交所产生的任何作者接受手稿版本应用了知识共享署名（Creative Commons Attribution，CC BY）许可。图 1 部分使用 BioRender 绘制。Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81]。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2x YTSigmaY2377-250G
氨基酸SigmaLAA21-1KT
无RNA酶乙酸铵Thermo ScientificAM9070G
氯化铵Sigma09718-1KG
氨苄青霉素SigmaA8351-5G
BL21(DE3) 感受态大肠杆菌NEBC2527H
离心瓶（Nalgene）Thermo Scientific3120-9500聚丙烯共聚物瓶
玻璃瓶（Duran）250 mL、500 mL、1 L、2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Bradford 法快速起始 1x 染色试剂Bio-Rad5000205
离心机Thermo ScientificHeraeus Megafuge 16R
微量离心机Eppendorf5424R 
层析柱Bio-Rad7321010
磷酸肌酸Sigma27920
半微量比色皿 1.6 mLFisherbrandFB55147
二水合磷酸氢二钠Fisher ChemicalS/4450/60
透析盒，Slide-A-Lyzer G3，2 kDa 截留分子量，15 mLThermo ScientificA52962
无水磷酸氢二钾Fisher ChemicalP/5240/60
DTT 无称量试剂Thermo ScientificA39255
离心过滤单元，3 kDa 截留分子量 Amicon Ultra 15EMD MilliporeUFC900324
500 mL 锥形瓶VWR214-1133
带挡板 2.5 L 锥形瓶 TunairSS-5013
亚叶酸SigmaF7878-100MG
甘油SigmaG5516-1L
HClFisherbrandH/1200/PB17
HEPES 缓冲液，1 M 溶液，pH 7.3Thermo ScientificBP299
咪唑SigmaI2399-500G
培养箱EppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGThermo ScientificR0392
KOH 颗粒Thermo ScientificP1767-500G
L-谷氨酸半镁盐四水合物Sigma49605-250G
L-谷氨酸单钾盐一水合物Sigma49601-500G
四水合乙酸镁SigmaM5661-50G
氯化镁Fluka63020-1L
磁力搅拌装置StuartUS152
NanodropThermo ScientificNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA 磁珠NEBS1423S
Parafilm 封口膜SigmaP7543-1EA
多通道移液器 Eppendorf Research Plus 30–300 µLEppendorf3125000052
酶标仪用板粘性密封膜ExcelScientificSTR-SEAL-PLT (无菌)
透气性板密封膜StarlabE2796-3005
铝箔板密封膜ExcelScientificFCS-25
酶标仪BioTekSynergy H1
板式振荡器AllshengMBI100-4A
384 孔板Thermo Scientific242764
96 孔深孔板 1 mLThermo Scientific736-0601
96 孔深孔板 2 mLSarstedt82.1972.002
96 孔 PCR 板Sarstedt721,978
光学 96 孔板Thermo Scientific10057581
氯化钾SigmaP5405-500G
磷酸二氢钾Fisher ChemicalP/4800/53
蛋白提取试剂（BugBuster）EMD Millipore70584-3
蛋白纯化树脂（cOmplete）Roche5893682001
旋转振荡器StarlabRM-Multi 1
氯化钠Fisher ChemicalS/3105/70
超声探头，FisherBrand 15–50 mLThermo Scientific12931181
超声仪Fisher ScientificFB120
分光光度计JenwayGenova Plus
亚精胺SigmaS2626-1G
TCEP 0.5 MSupelco646547
Tris 缓冲的 Thermo Fisher NTPThermo ScientificR1481
来自大肠杆菌 MRE600 的 tRNARoche10109541001
胰蛋白胨FormediumTRP02
0.2 mL PCR 级离心管Sarstedt72,737,002
7 mL 聚苯乙烯 Bijoux 管（Sterilin）Thermo Scientific129A
锥形离心管（Falcon）15 mLSarstedt62.554.502
锥形离心管（Falcon）50 mLSarstedt62.547.254
微量离心管（Eppendorf）1.5 mLSarstedt72.690.001
微量离心管（Eppendorf）2 mLSarstedt72.695.700
S100 离心管 Beckman-Coulter355619
S30 离心管 Thermo Scientific3118-0050
超速离心机Beckman-CoulterOptima XPN-100
超速离心机转子Beckman-Coulter70Ti 固定角转子
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水Thermo Scientific10977049
涡旋振荡器VWR444-2791
酵母提取物OxoidLP0021T

参考文献

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