本研究通过多组学和临床分析，探讨LLT1作为胃癌免疫治疗预测性生物标志物的作用。该研究评估了LLT1在免疫逃逸及肿瘤微环境调控中的功能，以促进精准免疫治疗策略的制定，提高治疗效果。
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本研究通过多组学和临床分析，探讨LLT1作为胃癌免疫治疗预测性生物标志物的作用。该研究评估了LLT1在免疫逃逸及肿瘤微环境调控中的功能，以促进精准免疫治疗策略的制定，提高治疗效果。
LLT1 是一种新型免疫检查点分子和潜在的治疗靶点。免疫治疗已改善了晚期胃癌的治疗效果；然而，许多患者并未产生应答或出现耐药，且目前缺乏有效的预测性生物标志物。LLT1 在胃癌免疫逃逸中的作用及其对免疫治疗应答的影响尚不明确。为评估这一点，本研究利用多个算法（TIMER、CIBERSORT 和 ESTIMATE）分析了癌症基因组图谱（TCGA）胃腺癌数据集中 LLT1 的表达情况，以量化肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。通过免疫组织化学（IHC）在 268 例胃腺癌样本中验证了蛋白表达，并通过多重免疫荧光（MIF）在 115 例免疫治疗后组织中进行了验证。整合转录组和蛋白质组数据，分析其与肿瘤微环境特征及临床免疫治疗结局的关联。结果显示，高 LLT1 蛋白表达与较不侵袭性的肿瘤特征显著相关（较低的浸润深度和淋巴结转移；P < 0.05），并伴随更长的总生存期（P = 0.012）。LLT1 的 mRNA 和蛋白水平与肿瘤微环境中更多的 CD8+ T 细胞和 M1 型巨噬细胞浸润以及 PD-L1 表达升高相关。在第一个包含 198 例具有预后数据患者的队列中，LLT1 高表达患者（n=117）的总生存期显著长于低表达患者（n=81）。在第二个接受联合免疫治疗与化疗的患者队列中，LLT1 高表达的肿瘤（n=48）比 LLT1 低表达的肿瘤（n=67）具有更长的无进展生存期（P = 0.014）。在免疫治疗有效的患者（n=62）中，观察到 PD-1+CD161+ 免疫细胞群体显著增加（P < 0.05），相较于治疗耐药患者（n=53）。综上所述，LLT1 表达是胃癌良好预后的潜在生物标志物。据我们所知，本研究首次证实 LLT1 表达可预测胃癌患者对联合化疗与免疫治疗的更好应答，提示其在指导免疫治疗策略中的潜在价值。
胃食管癌，尤其是胃癌（GC），位居全球第五th 全球最常见的癌症形式以及第五大th 最致命的。全球统计数据显示，每年约有100万例新发病例，其中东亚地区承担了不成比例的疾病负担，贡献了全球半数以上的发病率1对于早期胃癌患者，经内镜下黏膜剥离术（ESD）或根治性手术治疗后，预后良好，5年生存率超过90%2然而，由于早期症状较为隐匿，常导致诊断时已处于局部晚期或转移阶段3,4对于处于这些晚期阶段的患者，预后极差，未经治疗者的中位总生存期（OS）仅约6个月。即使采用基于氟尿嘧啶和铂类的联合化疗方案，中位总生存期也仅延长至大约一年。5.
近年来，由于一类名为免疫检查点抑制剂的新药问世，晚期胃癌的治疗发生了显著变化。这类药物类似于针对具有特定标志物PD-L1（即联合阳性评分（CPS）至少达到1分）的癌细胞的“魔法子弹”。对于DNA高度紊乱的肿瘤——即具有高微卫星不稳定性（MSI-H）的癌症，这些疗法同样具有显著疗效。这种新方法使患者生存时间得以延长6,7。关键性临床试验....
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本研究涉及人类受试者，已由苏州大学附属第一医院伦理委员会审查并批准（批准号：2019026）。苏州大学附属第一医院伦理审查委员会已批准或豁免了本数据使用的伦理审查。此外，所有参与者均签署了知情同意书。
生物信息学数据分析
在对TCGA和肿瘤免疫估计资源（TIMER）数据库进行系统的泛癌表达分析后，研究了LLT1在多种癌症类型中的表达特征，尤其聚焦于胃癌。利用TISIDB数据库探究LLT1表达水平与胃癌不同分子亚型之间的相关性。进一步通过R语言编程分析TCGA数据中患者临床特征与LLT1表达的相关性。采用GO和KEGG分析以探讨LLT1在胃癌发生过程中的功能作用。此外，应用ESTIMATE（基于表达数据估算肿瘤组织中基质细胞和免疫细胞含量）算法，根据LLT1的表达模式量化肿瘤组织中免疫细胞和基质细胞的浸润水平。进一步利用CIBERSORT算法分析LLT1表达水平与肿瘤微环境中特定免疫细胞浸润模式之间的相关性。使用TCGA数据集及R统计编程（v4.4.1）开展全面的生物信息学分析，以探究LLT1表达谱与免疫调节生物标志物之间的潜在关联。最后，利用TCIA（癌症免疫组图谱）数据库分析LLT1表达是否可预测患者对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗的应答情况。
胃腺癌标本及组织微阵列（TMA）构建
两组组织微阵列数据的生成方法如下：
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关联性 CLEC2D mRNA表达与胃癌亚分类/临床参数
利用TCGA数据集并通过TIMER数据库辅助进行的初步综合性癌症分析，揭示了显著升高的水平 CLEC2D 不同癌组织中的转录水平，如图所示 图1A这一观察结果表明 CLEC2D 可能作为参与多种癌症发病机制与演进过程的普遍致癌因子。对各项指标的细致比较 CLEC2D 利用TCGA-STAD数据集对胃癌与非癌胃组织间的mRNA水平进行了分析。对408例非配对样本的评估显示，mRNA水平存在统计学上显著升高 CLEC2D 肿瘤标本与其正常对应组织相比的mRNA表达水平（P < 0.01, 图1B）。为了验证这些结果，对27对匹配的肿瘤-正常样本对进行了Wilcoxon符号秩检验，结果证实了显著增强的 CLEC2D 胃癌组织中的表达（P
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我们的研究显示，肿瘤组织中 CLEC2D mRNA 的表达水平高于正常组织。胃癌的免疫组化结果表明，肿瘤组织中 LLT1 蛋白的高表达与较好的预后相关，并且与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润呈正相关。对接受免疫治疗的胃癌患者组织进行分析显示，LLT1 高表达可预测更佳的免疫治疗反应。本研究探讨了 LLT1 在胃癌组织中的表达及其临床意义，为胃癌的临床免疫治疗提供了一个新的评估标志物。
CLEC2D mRNA 表达水平与相应蛋白水平之间存在差异。这种不一致可能归因于 CLEC2D 基因存在五种选择性剪接变体，其中仅有一种编码功能性 LLT1 蛋白。其余四种非编码剪接变体的存在可能导致 mRNA 丰度与蛋白表达之间相关性不完善。此外，翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）以及泛素介导的蛋白质降解途径也可能在不依赖转录活性的情况下独立调控 LLT1 蛋白水平。
生物信息学分析显示，CLEC2D 高表达组具有更高的免疫评分以及更显著的免疫细胞浸润水平。大量文献表明，肿瘤组织中免.......
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作者声明无潜在利益冲突。
感谢TCGA数据库提供数据支持。本研究得到国家自然科学基金（项目编号：81974375）和苏州市科技发展计划（SKY2022129）的资助。本研究遵循ARRIVE指南。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5% BSA 封闭缓冲液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.,China | SW3015 | |
| anti-CD11c | ZSGB-BIO,China | 5D11 | |
| 抗 CD161 | Abcam,Cambridge, UK | ab302564 | |
| anti-CD19 | ZSGB-BIO,China | EPl69 | |
| anti-CD3 | ZSGB-BIO,China | LNl0 | |
| 抗 CD31 | ZSGB-BIO,China | UMAB30 | |
| 抗 CD4 | ZSGB-BIO,China | UMAB64 | |
| anti-CD56 | ZSGB-BIO,China | UMAB83 | |
| anti-CD68 | ZSGB-BIO,China | KP1 | |
| 抗 CD8 | ZSGB-BIO,China | EP334 | |
| 抗 CLEC2D | Abcam,Cambridge, UK | ab197341 | |
| 抗 Foxp3 | R&D Systems, USA | 1054C | |
| 抗 IFN-γ | Santa Cruz Biotechnology | sc-74108 | |
| 抗 IL-17 | R&D Systems, USA | MAB317 | |
| 抗 Ki67 | ZSGB-BIO,China | 8H5 | |
| 抗泛细胞角蛋白 | Abcam,Cambridge, UK | ab7753 | |
| 抗 PD-1 | Abcam,Cambridge, UK | ab137132 | |
| 抗 PD-L1 | DAKO,Denmark | 22C3 | |
| 全自动组织芯片仪 | Estigen OU, Tartu, Estonia | Beecher ATA 27 | 该仪器主要用于构建组织微阵列。 |
| 柠檬酸抗原修复液 | Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd , China | C752119 | |
| DAB 显色试剂盒 | AiFang Biological,China | AFIHC004 | |
| 数字病理扫描仪 | Ningbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd,China | KF-FL-020 | 该仪器主要用于扫描免疫组织化学和多重免疫组织化学芯片。 |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad Software,USA | v10.0.3 | 该软件用于绘制 Kaplan-Meier 曲线（含 log-rank 统计分析）、科学数据可视化及图像制备。 |
| PBS | Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd , China | P743267 | |
| 过氧化物酶封闭液 | AiFang Biological,China | AFIHC012 | |
| 聚合物-HRP 标记的羊抗小鼠/兔二抗 | AiFang Biological,China | AFIHC001 | |
| 六色七标记多重免疫荧光染色试剂盒 | AiFang Biological,China | AFIHC037 | 该试剂盒专为多重免疫组织化学（mIHC）设计。 |
| SPSS | IBM Corporation,USA | IBM SPSS Statistics 27 | 该软件用于数据的统计分析。 |
| R 项目 | R Core Team | V4.4.1 | 所有 R 包、相关代码和原始文件均已上传至公共数据库。 |
| VISIOPHARM 软件 | Visiopharm,Denmark | 2025.02.2.18022 x64 | 该软件主要用于病理图像的定量分析。 |
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