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研究文章

共刺激分子LLT1在胃癌中的表达、临床意义及其在免疫治疗疗效评估中的作用

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DOI：

10.3791/68827

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2025年10月10日

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1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

本文内容

摘要

本研究通过多组学和临床分析，探讨LLT1作为胃癌免疫治疗预测性生物标志物的作用。该研究评估了LLT1在免疫逃逸及肿瘤微环境调控中的功能，以促进精准免疫治疗策略的制定，提高治疗效果。

摘要

LLT1 是一种新型免疫检查点分子和潜在的治疗靶点。免疫治疗已改善了晚期胃癌的治疗效果；然而，许多患者并未产生应答或出现耐药，且目前缺乏有效的预测性生物标志物。LLT1 在胃癌免疫逃逸中的作用及其对免疫治疗应答的影响尚不明确。为评估这一点，本研究利用多个算法（TIMER、CIBERSORT 和 ESTIMATE）分析了癌症基因组图谱（TCGA）胃腺癌数据集中 LLT1 的表达情况，以量化肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。通过免疫组织化学（IHC）在 268 例胃腺癌样本中验证了蛋白表达，并通过多重免疫荧光（MIF）在 115 例免疫治疗后组织中进行了验证。整合转录组和蛋白质组数据，分析其与肿瘤微环境特征及临床免疫治疗结局的关联。结果显示，高 LLT1 蛋白表达与较不侵袭性的肿瘤特征显著相关（较低的浸润深度和淋巴结转移；P < 0.05），并伴随更长的总生存期（P = 0.012）。LLT1 的 mRNA 和蛋白水平与肿瘤微环境中更多的 CD8+ T 细胞和 M1 型巨噬细胞浸润以及 PD-L1 表达升高相关。在第一个包含 198 例具有预后数据患者的队列中，LLT1 高表达患者（n=117）的总生存期显著长于低表达患者（n=81）。在第二个接受联合免疫治疗与化疗的患者队列中，LLT1 高表达的肿瘤（n=48）比 LLT1 低表达的肿瘤（n=67）具有更长的无进展生存期（P = 0.014）。在免疫治疗有效的患者（n=62）中，观察到 PD-1+CD161+ 免疫细胞群体显著增加（P < 0.05），相较于治疗耐药患者（n=53）。综上所述，LLT1 表达是胃癌良好预后的潜在生物标志物。据我们所知，本研究首次证实 LLT1 表达可预测胃癌患者对联合化疗与免疫治疗的更好应答，提示其在指导免疫治疗策略中的潜在价值。

引言

胃食管癌，尤其是胃癌（GC），位居全球第五th 全球最常见的癌症形式以及第五大th 最致命的。全球统计数据显示，每年约有100万例新发病例，其中东亚地区承担了不成比例的疾病负担，贡献了全球半数以上的发病率1对于早期胃癌患者，经内镜下黏膜剥离术（ESD）或根治性手术治疗后，预后良好，5年生存率超过90%2然而，由于早期症状较为隐匿，常导致诊断时已处于局部晚期或转移阶段3,4对于处于这些晚期阶段的患者，预后极差，未经治疗者的中位总生存期（OS）仅约6个月。即使采用基于氟尿嘧啶和铂类的联合化疗方案，中位总生存期也仅延长至大约一年。5.

近年来，由于一类名为免疫检查点抑制剂的新药问世，晚期胃癌的治疗发生了显著变化。这类药物类似于针对具有特定标志物PD-L1（即联合阳性评分（CPS）至少达到1分）的癌细胞的“魔法子弹”。对于DNA高度紊乱的肿瘤——即具有高微卫星不稳定性（MSI-H）的癌症，这些疗法同样具有显著疗效。这种新方法使患者生存时间得以延长6,7。关键性临床试验表明，在PD-L1阳性人群中，CPS评分达到10或更高的个体在接受PD-1单克隆抗体治疗后，生存期的延长更为显著8,9。然而，当前的免疫治疗仍面临多项临床挑战：客观缓解率（ORR）普遍低于20%，继发性耐药率高达40%-60%，生物标志物预测系统尚不完善（现有生物标志物仅能识别出30%-40%的潜在获益者），以及免疫相关不良事件（irAEs）的管理困难10,11,12,13,14。尽管双免疫检查点阻断（如联合PD-1/CTLA-4抑制）或化疗联合免疫治疗方案可将缓解率提升至40%-60%，但仍有约一半患者无法获得持续的临床获益15。因此，基于多组学特征建立精准分类体系、发现新的预测性生物标志物以及识别新的免疫检查点，已成为提升胃癌免疫治疗临床疗效的关键研究方向。

凝集素样转录物1（LLT1）是一种C型凝集素相关蛋白，其已知的结合伴侣为自然杀伤（NK）细胞受体家族的成员CD161。CLEC2D基因负责LLT1的合成，通过选择性剪接跳过某些外显子，产生五种不同的异构体。其中，变体1即LLT1，已被证实是唯一存在于细胞膜上的异构体16,17。LLT1的表达主要见于多种免疫细胞类型，如B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞（DCs）、特定T细胞亚群（包括活化T细胞和调节性T细胞）、单核细胞和巨噬细胞，同时也可在某些恶性细胞及炎症发作期间被检测到18。初步研究表明，在Toll样受体（TLR）刺激后，DCs和B细胞中的LLT1表达上调。LLT1与CD161的结合已被证明可抑制NK细胞介导的细胞毒性，提示其在调节免疫应答中的作用18。在B细胞中，病毒感染或炎症刺激可上调LLT1的表达。当B细胞作为抗原呈递细胞（APCs）时，LLT1-CD161相互作用表现出双重免疫调节效应：一方面抑制NK细胞功能，另一方面共刺激T细胞增殖或干扰素-γ（IFN-γ）的产生19。

LLT1 存在于多种癌细胞中，包括三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤。该蛋白可与自然杀伤细胞（NK细胞）上的CD161受体结合，有效阻断NK细胞对癌细胞的杀伤能力，从而帮助肿瘤逃避免疫应答20,21,22。在人乳头瘤病毒（HPV）阴性的口咽部鳞状细胞癌中，LLT1呈现可变表达；免疫组织化学研究表明，当LLT1在三级淋巴结构（TLS）中高表达时具有良好的预后意义，而当其在肿瘤细胞上表达时则与较差的临床结局相关23。此外，在非小细胞肺癌（NSCLC）中，LLT1在肿瘤细胞本身中未被检测到，而是存在于肿瘤微环境（TME）中，且其mRNA表达水平与较好的预后相关24。

正如 Mathewson 等人在胶质瘤研究中所证实，阻断 CD161 可增强 T 细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用 体外 并增强其抗肿瘤功能 体内，强调了CD161作为免疫检查点靶点的治疗潜力25鉴于LLT1是CD161的典型配体18，其作为免疫治疗靶点的作用值得认真考虑。类似于免疫治疗中PD-1与PD-L1之间的关键相互作用，探究LLT1在胃癌中的生物学功能及其与免疫治疗疗效的相关性具有重要的临床价值。

本研究对胃癌肿瘤微环境中LLT1的表达模式进行了全面分析，整合了mRNA和蛋白质水平的检测结果。系统评估了LLT1作为晚期胃癌预后生物标志物的潜力，并探讨其对免疫治疗疗效的预测价值。这些发现有助于深入理解LLT1在临床转化中的潜在应用意义。

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方案

本研究涉及人类受试者，已由苏州大学附属第一医院伦理委员会审查并批准（批准号：2019026）。苏州大学附属第一医院伦理审查委员会已批准或豁免了本数据使用的伦理审查。此外，所有参与者均签署了知情同意书。

生物信息学数据分析
在对TCGA和肿瘤免疫估计资源（TIMER）数据库进行系统的泛癌表达分析后，研究了LLT1在多种癌症类型中的表达特征，尤其聚焦于胃癌。利用TISIDB数据库探究LLT1表达水平与胃癌不同分子亚型之间的相关性。进一步通过R语言编程分析TCGA数据中患者临床特征与LLT1表达的相关性。采用GO和KEGG分析以探讨LLT1在胃癌发生过程中的功能作用。此外，应用ESTIMATE（基于表达数据估算肿瘤组织中基质细胞和免疫细胞含量）算法，根据LLT1的表达模式量化肿瘤组织中免疫细胞和基质细胞的浸润水平。进一步利用CIBERSORT算法分析LLT1表达水平与肿瘤微环境中特定免疫细胞浸润模式之间的相关性。使用TCGA数据集及R统计编程（v4.4.1）开展全面的生物信息学分析，以探究LLT1表达谱与免疫调节生物标志物之间的潜在关联。最后，利用TCIA（癌症免疫组图谱）数据库分析LLT1表达是否可预测患者对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗的应答情况。

胃腺癌标本及组织微阵列（TMA）构建
两组组织微阵列数据的生成方法如下：

第一组研究回顾性分析了2011年接受手术治疗的268例胃腺癌（GAC）患者的标本。病理学家筛选出石蜡包埋块，确定肿瘤核心区域，并构建组织微阵列。每个独立的样本位点均被分配一个唯一的标识符，以精确追踪相关的临床参数，包括性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、癌症进展阶段、浸润深度、淋巴结受累情况以及是否存在远处转移。总生存期（OS）定义为从治疗开始至死亡发生或截至2017年12月截尾日期的时间间隔。需要强调的是，完整的OS数据仅适用于其中198名参与者子集。

第二组包括115名未经治疗的晚期胃癌患者，这些患者于2016年至2023年间在苏州大学第一附属医院接受了手术或内镜下切除。病理学家对石蜡包埋组织块进行评估，并构建了组织微阵列，同时对疾病进展进行了密切随访。值得注意的是，所有标本均在任何术前治疗之前采集，术后治疗主要为PD-1单克隆抗体联合化疗。

所有手术切除标本均取自胃窦。所有样本均用中性缓冲甲醛固定，并包埋于石蜡中。根据苏木精-伊红（H&E）染色切片的评估结果，两名资深病理学家独立确定了石蜡包埋标本中最具代表性的组织区域。组织微阵列（TMA）采用自动组织芯片仪构建，按照预设模块将组织芯精确地排列在TMA蜡块中。最后，由经验丰富的组织技术员将完成的TMA蜡块切成4 µm厚的切片。

免疫组织化学（IHC）和多重免疫荧光（mIHC）
免疫组织化学和多重免疫荧光检测在构建的组织微阵列上进行。免疫组织化学染色按照先前建立的方法进行。26第一组微阵列石蜡切片转移至载玻片上，并在72 °C下烘烤1小时。切片经二甲苯脱蜡，并依次用浓度递增的乙醇溶液水化后，加入过氧化物酶阻断液作用30分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。抗原修复通过将载玻片置于柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）中，于110 °C煮沸3分钟完成。用5% BSA封闭缓冲液封闭后，切片在4 °C下与以下一抗孵育过夜：小鼠抗人CLEC2D单克隆抗体、小鼠抗人CD3单克隆抗体（即用型）、小鼠抗人CD4单克隆抗体（即用型）、兔抗人CD8单克隆抗体（即用型）、小鼠抗人CD11c单克隆抗体（1:50）、小鼠抗人CD19单克隆抗体（即用型）、小鼠抗人CD31单克隆抗体（即用型）、小鼠抗人CD56单克隆抗体（即用型）、小鼠抗人CD68单克隆抗体（即用型）、兔抗人Foxp3单克隆抗体（1:50）、小鼠抗人IL-17单克隆抗体（1:50）、小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体（1:50）、小鼠抗人Ki67单克隆抗体（1:50）、小鼠抗人PD-L1单克隆抗体（即用型）27,28载玻片随后经洗涤，并在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗（抗小鼠和抗兔）孵育30分钟。孵育后，样本再次洗涤，采用EnVision检测系统进行免疫检测。显微镜下观察，当芯片上出现棕黄色区域时需仔细观察，一旦棕黄色区域不再增加，应立即终止显色反应。载玻片用Mayer苏木精复染，并用中性树胶封片。阴性对照中，以小鼠或兔IgG替代一抗；阳性对照采用人扁桃体组织。第二组组织微阵列切片用于多重免疫组化（mIHC）。重复使用前述抗原修复和封闭条件，抗体组合的光谱优化如下：PD-L1（480 nm）、CD161（520 nm）、LLT1（570 nm）、PD-1（620 nm）、CD8（690 nm）和PAN-CK（780 nm）。一抗孵育条件与原始方案相同。29 （PANCK 和 CD161 为新引入的抗体除外），均按推荐的 1:100 稀释比例孵育，随后进行酪胺信号放大（TSA）荧光染色。每轮荧光染色完成后，需进行抗体剥离，接着重复抗原修复、内源性过氧化物酶阻断以及非特异性靶点阻断，然后孵育下一种一抗。进行多重免疫组化时，有三个关键点：每种荧光染料均需预先开展预实验，高表达的抗体应与弱荧光信号配对，而低表达的抗体则应与强荧光信号配对；每完成一种荧光标记的染色后，必须在避光条件下于显微镜下观察染色结果。完成第 6 种标记染色后th 荧光染料，应用DAPI复染以标记细胞核，然后封片。最后，所有组织微阵列均使用数字病理扫描仪进行扫描，并通过人工智能驱动的数字病理图像分析软件进行分析。

IHC/mIHC 染色评估
染色结果由两名经验丰富的病理学家以双盲方式解读。他们使用高倍物镜（200倍放大）或相应的荧光设置（200倍）评估染色强度，评分范围为0（无染色）至3（强染色）。胃癌样本中LLT1阳性细胞的比例被分为四个等级：0（<5%）、1（5–25%）、2（26–50%）和3（>50%）。免疫反应性评分（IRS）由染色强度评分与LLT1阳性细胞比例评分相乘得出。评分为0的样本被视为阴性，评分1–4表示弱表达，5–7为中等表达，8–9为强表达；该标准同样用于评估其他标志物（如Ki67和CD3）的表达水平。根据上述评估与分组方法，样本被标记为强表达（IRS 8–9）、中等表达（IRS 5–7）、弱表达（IRS 1–4）或无表达（IRS 0）。评分最低的患者（IRS ≤ 4）被归入低表达组，评分较高的患者（IRS ≥ 5）被归入高表达组。

然而，对于PD-L1标志物，采用了不同的方法，即使用CPS。该评分通过PD-L1阳性细胞（包括肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞）与存活肿瘤细胞总数的比值乘以100来确定。CPS超过5的个体被归入高表达组，而CPS为5或低于5的个体则被归入低表达组。

免疫治疗反应分组
根据实体瘤疗效评价标准1.1版（RECIST 1.1），患者靶病灶的疗效评估分为以下四个明确类别：（a）完全缓解（CR）：所有靶病灶完全消失，且所有病理学淋巴结（包括靶病灶和非靶病灶）的短轴直径均小于10 mm；（b）部分缓解（PR）：所有可测量靶病灶的直径总和较基线水平减少至少30%；（c）疾病进展（PD）：靶病灶的直径总和较研究期间记录的最小值增加至少20%（若基线值为最小值，则以基线为参考），且绝对增加值不少于5 mm；此外，出现新病灶也归类为疾病进展（PD）；（d）疾病稳定（SD）：靶病灶的直径总和在研究期间既未达到PR的缩小标准，也未达到PD的增大标准。本研究采用了两种分层方法。第一种方法根据患者的治疗反应状态进行分组，其中PD患者（n=53）和SD患者（n=46）被归为无应答组（n=99），而PR患者（n=15）和CR患者（n=1）则构成应答组（n=16）。第二种方法根据疾病是否进展进行分类，将CR、PR和SD患者归为免疫治疗有效队列（n=62），PD患者归为免疫治疗无效队列（n=53）。

统计分析
采用 R 计算平台（版本 4.4.1）和 SPSS 统计软件包（版本 27.0）进行实证评估。通过卡方列联表分析检验各研究队列之间的差异。采用 Spearman 非参数相关分析方法探究变量间关联的强度与方向。通过构建 Kaplan-Meier 估计量并结合对数秩检验评估生存时间的差异。随后，采用 Cox 比例风险回归模型识别可能影响患者生存结局的因素。统计学显著性预先定义为双侧 p 值阈值 <0.05。为确保研究结果的稳健性，进行了全面的敏感性分析以评估潜在的混杂变量，并对多变量模型进行相应调整。此外，对风险比进行了明确解释，以促进临床理解，强调所识别风险因素对患者预后的实际意义。

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结果

关联性 CLEC2D mRNA表达与胃癌亚分类/临床参数
利用TCGA数据集并通过TIMER数据库辅助进行的初步综合性癌症分析，揭示了显著升高的水平 CLEC2D 不同癌组织中的转录水平，如图所示 图1A这一观察结果表明 CLEC2D 可能作为参与多种癌症发病机制与演进过程的普遍致癌因子。对各项指标的细致比较 CLEC2D 利用TCGA-STAD数据集对胃癌与非癌胃组织间的mRNA水平进行了分析。对408例非配对样本的评估显示，mRNA水平存在统计学上显著升高 CLEC2D 肿瘤标本与其正常对应组织相比的mRNA表达水平（P < 0.01, 图1B）。为了验证这些结果，对27对匹配的肿瘤-正常样本对进行了Wilcoxon符号秩检验，结果证实了显著增强的 CLEC2D 胃癌组织中的表达（P

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讨论

我们的研究显示，肿瘤组织中 CLEC2D mRNA 的表达水平高于正常组织。胃癌的免疫组化结果表明，肿瘤组织中 LLT1 蛋白的高表达与较好的预后相关，并且与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润呈正相关。对接受免疫治疗的胃癌患者组织进行分析显示，LLT1 高表达可预测更佳的免疫治疗反应。本研究探讨了 LLT1 在胃癌组织中的表达及其临床意义，为胃癌的临床免疫治疗提供了一个新的评估标志物。

CLEC2D mRNA 表达水平与相应蛋白水平之间存在差异。这种不一致可能归因于 CLEC2D 基因存在五种选择性剪接变体，其中仅有一种编码功能性 LLT1 蛋白。其余四种非编码剪接变体的存在可能导致 mRNA 丰度与蛋白表达之间相关性不完善。此外，翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）以及泛素介导的蛋白质降解途径也可能在不依赖转录活性的情况下独立调控 LLT1 蛋白水平。

生物信息学分析显示，CLEC2D 高表达组具有更高的免疫评分以及更显著的免疫细胞浸润水平。大量文献表明，肿瘤组织中免...

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披露

作者声明无潜在利益冲突。

致谢

感谢TCGA数据库提供数据支持。本研究得到国家自然科学基金（项目编号：81974375）和苏州市科技发展计划（SKY2022129）的资助。本研究遵循ARRIVE指南。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5% BSA 封闭缓冲液Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.,ChinaSW3015
anti-CD11c ZSGB-BIO,China5D11
抗 CD161Abcam,Cambridge, UKab302564
anti-CD19  ZSGB-BIO,ChinaEPl69
anti-CD3 ZSGB-BIO,ChinaLNl0
抗 CD31ZSGB-BIO,China UMAB30
抗 CD4ZSGB-BIO,ChinaUMAB64
anti-CD56 ZSGB-BIO,ChinaUMAB83
anti-CD68 ZSGB-BIO,ChinaKP1
抗 CD8ZSGB-BIO,ChinaEP334
抗 CLEC2DAbcam,Cambridge, UKab197341
抗 Foxp3R&D Systems, USA1054C
抗 IFN-γ Santa Cruz Biotechnologysc-74108
抗 IL-17R&D Systems, USA MAB317 
抗 Ki67 ZSGB-BIO,China8H5
抗泛细胞角蛋白 Abcam,Cambridge, UKab7753
抗 PD-1Abcam,Cambridge, UKab137132
抗 PD-L1DAKO,Denmark22C3
全自动组织芯片仪Estigen OU, Tartu, EstoniaBeecher ATA 27该仪器主要用于构建组织微阵列。
柠檬酸抗原修复液Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd , ChinaC752119
DAB 显色试剂盒 AiFang Biological,ChinaAFIHC004
数字病理扫描仪Ningbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd,ChinaKF-FL-020该仪器主要用于扫描免疫组织化学和多重免疫组织化学芯片。
GraphPad Prism 10GraphPad Software,USAv10.0.3该软件用于绘制 Kaplan-Meier 曲线（含 log-rank 统计分析）、科学数据可视化及图像制备。
PBSAladdin Biochemical Technology Co., Ltd , ChinaP743267
过氧化物酶封闭液AiFang Biological,ChinaAFIHC012
聚合物-HRP 标记的羊抗小鼠/兔二抗AiFang Biological,ChinaAFIHC001
六色七标记多重免疫荧光染色试剂盒AiFang Biological,ChinaAFIHC037该试剂盒专为多重免疫组织化学（mIHC）设计。
SPSSIBM Corporation,USAIBM SPSS Statistics 27该软件用于数据的统计分析。
R 项目R Core TeamV4.4.1所有 R 包、相关代码和原始文件均已上传至公共数据库。
VISIOPHARM 软件Visiopharm,Denmark2025.02.2.18022 x64该软件主要用于病理图像的定量分析。

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