可用于野外的无透镜成像平台用于自然杀伤细胞活化的快速无标记分析

摘要

本方案描述了一种基于无透镜阴影成像技术的无标记方法，用于快速进行自然杀伤（NK）细胞数量和活性的单细胞分析。该方法通过计算机分析单个NK细胞的衍射图样，量化其形态学变化。

摘要

自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的重要效应细胞，能够清除病毒感染细胞和恶性细胞。监测NK细胞活性对于评估免疫功能至关重要。然而，传统的检测方法（如流式细胞术）费时且操作繁琐。本实验方案介绍了一种基于无透镜阴影成像技术（LSIT）的无标记、快速分析自然杀伤（NK）细胞活性的方法。从外周血中分离的NK细胞经专有激活剂刺激后，可在5分钟内通过LSIT平台进行分析。LSIT平台通过捕获光与NK细胞相互作用产生的干涉形成的全息图像（即阴影图像），并分析阴影参数的变化，从而监测其活化状态。从阴影图像中提取的关键参数，包括峰间距（PPD）和次级极大值宽度的标准差（WSM-SD），可定量反映细胞形态和内部复杂性。这些参数被整合为联合阴影参数（CSP）和先天免疫指数（I³），以基于细胞形态变化对NK细胞活性进行综合评估与量化。I³定义为激活后CSP的百分比变化，可作为NK细胞活性的直接衡量指标。健康个体的NK细胞I³值始终显著高于免疫功能低下个体。LSIT平台可实现快速、低成本的免疫谱型分析，适用于即时检测（point-of-care diagnostics）。

引言

细胞形态正成为分子机制的关键指标。它不仅提供了细胞结构的可视化表征，还能深入揭示单个细胞的内在过程及其功能¹。在单细胞水平上分析免疫细胞的形态、大小和活性，对于理解其行为特征、异质性以及在健康与疾病中的作用具有重要意义^2,3,4,5,6。

在这些关键细胞中，自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的核心组成部分^7,8。它们通过释放细胞因子清除病毒感染细胞和癌细胞，并调节适应性免疫应答^9,10,11。癌症、病毒感染和免疫缺陷常导致NK细胞数量减少并损害其功能^12,13,14。因此，NK细胞的活化状态可作为重要的生物标志物，反映免疫系统的整体健康状况。因此，对NK细胞活化进行快速的单细胞评估对于预后判断、疾病诊断、病情监测和患者分层至关重要^15,16,17,18。

目前，NK细胞活性的评估主要基于其细胞毒作用能力（杀伤靶细胞的能力）和细胞因子的产生^19,20,21,22。用于检测细胞介导的细胞毒作用的传统方法²³，如铬-51（⁵¹Cr）释放实验^24,25、流式细胞术检测^26,27，以及酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测NK细胞受刺激后分泌的干扰素-γ（IFN-γ）^28,29,30，均存在若干局限性。这些局限性包括缺乏标准化、实验流程耗时较长（例如ELISA需过夜孵育）、依赖细胞标记以及仪器成本高昂^31,32,33。这些挑战凸显了对创新方法的需求，即能够提供快速结果、成本效益高、无需标记且通量高的检测手段。此外，在单细胞水平上评估NK细胞的活化状态，有助于深入理解细胞群体的异质性以及单个细胞对刺激的响应特性。

在旨在克服这些局限性的新兴技术中，无透镜阴影成像技术（LSIT）是一种尤为有效的解决方案^34,35,36。LSIT 是一种简化的数字同轴全息技术（DIH），可实现对自然杀伤细胞（NK细胞）活化的快速、无标记、高通量单细胞水平分析^37,38,39。DIH 通过数字传感器捕获激光散射光与共线参考光束之间的干涉图样，从而重建微观物体的三维（3D）信息^40,41。LSIT 通过采用部分相干LED光源、微针孔和CMOS传感器，简化了该方法，用于捕获细胞的衍射图样（即阴影图像）^42,43,44,45。该技术的原理基于以下观察：免疫细胞的活化常引起形态学变化，包括细胞大小、形状、胞质颗粒度以及核结构的改变^{46,47,48,49,50}。LSIT 对这些变化高度敏感，而这些变化会直接影响衍射图样^51,52,53。

基于LSIT对这些形态学变化及其对衍射图样影响的高灵敏度，本实验方案介绍了一种利用Cellytics NK平台（下文简称LSIT平台）在单细胞水平上快速、准确地定量自然杀伤（NK）细胞数量和功能活性的新方法⁵⁴。如图1A所示，LSIT平台将样本处理、细胞激活和阴影成像整合为一个紧凑的多通道工作流程。从全血中分离NK细胞后，使用特制的激活刺激剂混合物（ASC）进行刺激，并加载至专用检测芯片上。ASC在暴露1小时内即可诱导NK细胞发生形态学变化，例如细胞体积增大和内部结构复杂性增加，这些变化可通过LSIT平台精确检测^55,56。

LSIT 平台采用 LED 光源和 CMOS 传感器来捕获单个细胞的 DIH 图案（阴影）（图 1B）。随后，一种特殊算法分析这些阴影图案，并提取关键参数，例如与细胞大小相关的峰-峰距离（PPD），以及与细胞质复杂性和不规则性相关的次级最大值宽度的标准差（WSM-SD）（图 1C、D）。通过比较刺激前后的数值，该平台计算出综合指数：联合阴影参数（CSP = PPD × WSM-SD）和先天免疫指数（I³），后者反映激活后 CSP 的百分比变化。引入 CSP 的原因是免疫激活同时涉及细胞增大和细胞质复杂性的增加。仅依赖两个标准中的一个可能会遗漏临界激活状态，或受到碎片或照明不均等噪声的影响。CSP 通过要求两个指标均发生一致变化，从而提高了分类准确性。这些指数可在无需荧光标记或复杂样本处理的情况下，对不同细胞群体的激活状态进行分类。

该方案对于需要快速、定量且无需标记即可监测免疫细胞活化诱导的形态学变化的研究人员和临床医生尤为有用。它适用于基础免疫学研究、临床前药物筛选以及免疫疗法的评估，并可在需要快速评估免疫状态的临床环境中用作诊断或预后工具。该方法需要分离的细胞群体、LSIT 平台的使用权限，以及特定的自然杀伤（NK）细胞活化混合剂。

方案

所有研究均遵循机构指南，并经韩国高丽大学安岩医院机构审查委员会批准（批准编号：2021AN0040）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 样本采集与处理

注意：处理所有人血样本时，应采用标准的生物安全防护措施和适当的个人防护装备。

1. 使用无菌肝素管无菌采集患者的外周全血。
2. 轻轻倒置试管8–10次，使抗凝剂与血液充分混匀。
3. 采集后应立即分析血样。若需延迟分析，应将样本置于肝素化试管中，于2–8 °C保存，并在48小时内使用。
   注意：切勿冷冻全血。请使用新鲜样本以保持细胞完整性。

2. NK 细胞的分离与激活

注意：本方案提供了一种优化且全面的工作流程，用于直接从人全血中分离并活化自然杀伤细胞（NK细胞），所用试剂盒为NK Prep Kit，包含用于细胞分离的NK Sep Kit和用于刺激活化的NK Activation Kit。该试剂盒结合了基于磁珠的阴性筛选与细胞刺激技术，可实现对NK细胞表型的快速评估 通过 一种无透镜成像细胞分析平台。

1. 预实验准备
   1. 从冰箱中取出试剂盒，并恢复至室温（15-28 °C）。
      注意：NK Sep 试剂盒包含以下组分：
      (a) 绿色盖子：含有抗体混合液的反应管。
      (b) 红色盖子：分离管1，内含稀释介质中的磁性颗粒（1.5 mL）。
      (c) 紫色盖子：分离管2，内含磁性颗粒。
      (d) 灰色盖子：回收管（洁净且空置）。
      NK 激活试剂盒包含以下组分：
      (a) 对照液：密封铝袋中的八个透明管。
      (b) ASC：密封铝袋中的八个黄色管。
      仅从密封袋中取出所需试管。未使用的组分需重新密封并冷藏保存。
   2. 准备必要设备：磁性分离器、带无菌吸头的移液器，以及设定在 37 °C 的校准孵育箱或加热块。
2. NK 细胞分离步骤
   1. 将 0.5 mL 全血加入含有抗体混合液的绿色盖反应管中。轻轻翻转混匀 2-3 次，孵育 5 分钟。
   2. 将全部内容物转移至红色盖的分离管1中。轻轻混匀 2-3 次。
   3. 将管子置于磁性分离器上，在室温下孵育 10 分钟。
   4. 保持磁铁吸附状态，将约 1.5 mL 上清液转移至紫色盖的分离管2中。轻轻混匀 2-3 次。
   5. 将第二个分离管置于磁力架上，孵育 10 分钟。
   6. 磁铁仍保持吸附状态下，将约 1.0 mL 上清液转移至灰色盖的回收管中。小心混匀。
3. NK 细胞激活
   1. 将 100 µL 分离得到的 NK 细胞悬液加入对照液管中，另取 100 µL 加入 ASC 管中
   2. 仔细混匀两管中的内容物。
   3. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
      注意：使用经校准的加热块以维持恒定的孵育温度。

3. 使用 LSIT 平台进行成像与分析

注意：细胞应在孵育后立即进行分析。若无法立即分析，请将孵育后的细胞置于 2-8 °C 保存，并在 6 小时内完成分析。LSIT 平台利用数字全息成像技术（DIH）对人血液样本中的细胞形态和数量进行评估。为分析免疫活性，将未刺激和ASC刺激的NK细胞加载到特制载玻片上，插入设备后自动成像。

1. 设备设置与校准
   注意：分析样本前务必执行背景校准。
   1. 开启 LSIT 平台。确保 LED、风扇和摄像头正常工作。
   2. 启动 LSIT Capture 软件。输入您的 ID 和密码进行登录。
   3. 进入 设置 菜单并选择 校准。
   4. 按下触摸屏上的“打开”按钮或使用物理滑动门按钮打开门。当抽屉弹出后，取出校准玻片并妥善存放。
   5. 确保无检测玻片存在。关闭抽屉。
      注意：仅可使用光学擦拭布清洁玻片表面。
   6. 点击 设置背景 以校准光学强度。
   7. 重新放入校准玻片，并关闭抽屉。
   8. 点击 开始校准。
      注意：若液体洒落在设备上，请立即关闭电源，擦拭干净。切勿拆卸设备。
2. 检测玻片的制备与加载
   1. 从包装袋中取出一张检测玻片，用样本信息进行标记，并将其放置在洁净、平整的表面上。
   2. 用移液器将 10 µL 载体（未刺激）样本加入通道 A 和 B 中。
   3. 用移液器将 10 µL ASC 刺激后的样本加入通道 C 和 D 中。
      ​注意：避免产生气泡或过度填充。
   4. 按下 打开 按钮弹出抽屉，取出校准玻片并放入储存盒中。
   5. 插入已准备好的检测玻片，然后按下 关闭。
3. 图像采集：测试菜单 1 — NK 细胞活性
   注意：若图像采集失败，请检查照明条件和样本体积。必要时重新校准。
   1. 登录 LSIT 系统，在主屏幕上选择 NK 细胞活性测试。
   2. 输入样本 ID 或使用条形码扫描仪。
      注意：如需从存档列表中检索样本 ID，请使用“检索”按钮。
   3. 按下 采集 以开始记录。 
   4. 完成图像采集后，点击 分析。
   5. 检查屏幕上显示的 NK 细胞活性（%）和细胞计数。
      注意：有效结果将以数值形式显示。若 I³ 低于范围，则显示“≤100%"；若高于范围，则显示">300%"。
   6. 通过触摸屏菜单将结果下载至 USB 设备或打印。
4. 图像采集：测试菜单 2 — 细胞计数
   1. 在主界面的测试菜单 2 下选择 细胞计数 选项。
   2. 将 10 µL 样本加载到新的检测玻片通道中。
   3. 插入玻片，关闭抽屉，并输入样本 ID。
   4. 如适用，请输入稀释因子。
   5. 按下 计数。
      注意：若结果在测试范围内，系统屏幕将以数值形式显示 NK 细胞数量；对于低于测试范围的结果，显示为“≤ 10 cells/µL"”，高于范围的结果则显示为“> 1,000 cells/µL"”。
   6. 以 cells/µL 为单位显示结果。
      注意：切换黑色结果区域可查看图像中的实际细胞计数。
   7. 审核结果并下载或打印。
      注意：请确保输入正确的稀释因子以获得准确结果。

4. 分析后清理

1. 使用打开按钮或物理拨动开关打开抽屉。
2. 取出已使用的载片。
3. 将校准载片放回抽屉中以保护传感器。
4. 关闭抽屉。
5. 按照实验室废弃物处理规定处置使用过的试管、枪头和载片。

结果

通过本方案，LSIT平台能够基于自然杀伤（NK）细胞形态学变化，实现对NK细胞活化的定量、无标记评估。图2A展示了健康供体来源的原代NK细胞在有或无ASC条件下孵育2小时后，经Hema-3染色的细胞涂片结果。与对照组（未刺激）相比，ASC刺激导致细胞发生显著变化，主要表现为细胞体积增大以及内部复杂性或颗粒度增加。这些形态变化以阴影衍射图谱的形式被记录，并由LSIT平台通过集成软件分析，提取每个细胞的关键形态计量参数（图2B）。本方案可有效区分不同的NK细胞活化状态，并可用于评估整体先天免疫功能。

为了评估阴影参数的可重复性，我们在载体处理和ASC刺激条件下分析了超过900个单独的NK细胞。ASC激活的NK细胞在刺激30分钟和2小时后，其阴影图像显示出比载体对照组更高的衍射复杂性、更大的尺寸和更强的不规则性。ASC刺激增加了PPD和WSM-SD，导致CSP水平升高，而IL-2/12刺激则产生中等效应（图2C...

讨论

本方案介绍了一种标准化的无标记自然杀伤细胞（NK细胞）活化定量方法，该方法结合使用NK细胞分离与活化试剂盒（NK Prep Kit）进行细胞分离和活化，并进行后续分析 通过 LSIT 平台。它为传统检测方法（如 ⁵¹Cr释放、流式细胞术和ELISA。该方案专为配备LSIT平台的实验室设计，通过阴影图像分析NK细胞和I的数量，提供简单明了的结果³其单细胞分辨率可提供基于ELISA等群体检测方法无法实现的详细信息。

该实验流程中的一个关键环节是通过阴性磁选法精确地进行细胞分离，并对试剂进行标准化操作。自然杀伤细胞（NK细胞）制备物的质量和纯度会影响阴影图像的清晰度以及参数的提取效果。为了尽量减少变异并保持细胞在ASC刺激过程中的完整性，应在采血过程中避免溶血，快速处理样本，并确保试剂处于室温。将样本准确加载到载片上，避免产生气泡并使用正确的体积，同样至关重要。保持系统的校准状态和传感器的清洁，是确保分析结果准确的关键。为了计算I³ 并可靠地解读细胞活化状态，每个经ASC刺激的样本都必须配有相应...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 微量离心管	AXYGEN	MCT-175-C	无菌，无 DNase/RNase
检测用载玻片	Metaimmunetech	AS050-G	Cellytics 系统专用载玻片 每盒 50 片
带软件的 Cellytics 系统	Metaimmunetech	CS001	无透镜阴影成像平台
离心机（摆桶转子）	LABOGENE	1580R	300–500 × g 范围
CMOS 图像传感器	包含于 Cellytics 设备中	集成式	用于衍射成像
细胞离心涂片机	Nasco korea	TXT3 Cyto Centrifuge	用于细胞离心涂片染色
数字加热模块（37 °C）	Daihan Scientific	DH.WHB00349	用于细胞孵育
ELISA 试剂盒（IFN-γ）	R&D system	DIF50C	人 IFN-γ ELISA 试剂盒
Guava easyCyte 流式细胞仪	Millipore	0500-5005	用于 CD107a 表达分析
Hema 3 Stat Pack	ThermoFisher	122-911	用于细胞离心涂片染色
IL-12（重组人源）	R&D system		ASC 的组分
IL-2（重组人源）	Peprotech	200-02	ASC 的组分
磁力分离架	Metaimmunetech	M13R8	用于磁珠分离
显微镜载玻片	Marienfeld	1000612	用于细胞离心涂片制备
NK 细胞激活试剂盒	Metaimmunetech	MIT2301V, MIT2301A	用于 NK 细胞激活
NK Sep 试剂盒	Metaimmunetech	MIT2301-500	用于 NK 细胞分离
PE 小鼠抗人 CD107a，100 次检测	BD biosciences	555801	用于 CD107a 表达分析
针孔光阑	包含于 Cellytics 设备中	集成式	用于 LSIT 照明光路
移液器（2–20 µL，20–200 µL）	AXYGEN	T-200-Y	可调体积
阴影校准载玻片	Metaimmunetech	AS050-G	用于设备校准。 每盒检测载玻片中含 1 片校准载玻片
涡旋混合器	Merck	SI-0246A	用于重悬