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方法文章

超高信息量化学成像结合宽带相干反斯托克斯拉曼与双光子荧光寿命显微技术

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DOI：

10.3791/68845

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2025年10月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了一种多模态成像平台，该平台结合了宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）、双光子激发荧光（TPEF）和双光子荧光寿命成像显微技术（2p-FLIM），可实现超高信息含量的化学生物成像。

摘要

拉曼指纹光谱与荧光寿命成像正成为研究生物样本代谢特征的新兴工具。拉曼指纹光谱可检测反映样品分子组成及化学环境的内在分子振动，而荧光寿命成像则可测量对微环境敏感的荧光团激发态寿命的变化。本文介绍一种多模态成像平台，结合宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）与双光子荧光寿命成像（2p-FLIM）显微技术，能够获取具有生物学意义的拉曼指纹光谱与荧光寿命信号 在体 并且同时进行。通过对空间共定位的BCARS和2p-FLIM图像获取的大量化学信息，我们能够表征亚细胞区室之间的细微差异，并验证仅依靠荧光成像可能产生的假阳性结果。这一点通过直接比较从活体完整细胞中同一染料标记的细胞器上同时获得的BCARS、2p-FLIM以及双光子激发荧光（TPEF）信号得以证明。 秀丽隐杆线虫 表达绿色荧光蛋白（GFP）标记。在本研究中，我们介绍了BCARS/2p-FLIM/TPEF的系统构建方案、图像采集步骤、数据处理方法以及代表性结果，表明这种多模态成像方法能够实现对样品的严格表征和 体内 亚细胞分辨率检测。本方案提供了一种同时进行化学成像与荧光寿命成像的框架，以提高在复杂生命系统中生物学解释的准确性。

引言

生物学研究中的一个挑战是准确检测生物体在天然状态下以及完整细胞和组织结构中的生物构建材料。拉曼光谱在检测生物样本内源性代谢物和化学物质方面展现出前所未有的潜力，近年来已被认为是一种新兴的生物样本代谢谱分析工具1。通过分析拉曼指纹光谱中各种代谢基团的峰位，越来越多的证据表明，这些指纹特征可用于检测癌症2,3,4、心脏疾病5,6和神经退行性疾病7,8等疾病的早期阶段，并特别适用于解决基本的生物学问题9,10，包括无需任何标记干扰即可成像细胞内结构11、区分不同细胞状态12,13以及细胞类型分类14,15,16。拉曼光谱中编码的大部分化学信息（> 90%）位于指纹区（500 至 1800 cm-1），使得该区域迄今为止在区分生物样品化学组成方面最为有用17。然而，该频率范围内微弱的拉曼信号使得拉曼指纹光谱在生物学研究中的应用面临挑战，尤其是对活体、完整的生物样本而言尤为困难1。

相干拉曼成像（CRI）技术显著缩短了拉曼信号的采集时间，但大多数此类方法仅获取相对较窄的光谱片段，并且主要针对2800 - 3100 cm-1范围内的强CH伸缩振动信号进行优化。窄带CARS和受激拉曼散射（SRS）（图1A、B）采用两束皮秒激光脉冲，通常用于采集强CH信号中较窄的一部分18,19,20,21,22,23。多路复用CRI方法，例如多路复用CARS（图1C），则结合一束皮秒脉冲和一束约100飞秒（fs）的脉冲，以获得中等宽度的光谱范围（通常≤ 400 cm-1），且通常仍局限于CH振动区域24,25,26,27,28,29,30。使用这些成像方法在每个像素点上采集完整的生物相关拉曼光谱（600 - 3200 cm-1）通常是不可行的，因为大多数指纹区信号的强度比CH伸缩振动信号弱10至100倍31。与大多数CRI方法不同，宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）专为单次激发下的宽带信号采集而设计，可覆盖指纹区和CH伸缩振动区域31,32,33。BCARS利用约10 fs激光脉冲内部的脉冲间相互作用，高效激发低频（指纹区）振动模式（图1D），同时采用与多路复用CARS相同的机制，即通过飞秒脉冲与皮秒脉冲的组合，在CH伸缩振动区域产生振动相干性（图1C）32,33。此外，由于BCARS信号与非共振背景（NRB）之间存在固有的相互作用，其信号具有内在校准特性，从而能够在每个像素点上每发激光脉冲均获得定量、不受仪器影响的完整拉曼光谱31，并具备从细胞、完整组织以及活体生物体中快速获取高信息含量数据的能力32,34,35,36,37,38,39。

所获得的原始宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）光谱包含一个强烈的所谓"非共振背景"（NRB）。NRB 来源于激光脉冲引发的电子响应，不具有化学特异性。该非共振背景与振动共振信号发生相干干涉，起到外差放大器的作用32。NRB 还会扭曲底层的拉曼光谱（图 2A），但只要采集到足够宽且连续的光谱区域，便可恢复出原始拉曼光谱。目前尚无可用的后处理方法能够利用窄带 CARS 技术将共振 CARS 信号与非共振成分分离。而从宽带 CARS 信号中恢复拉曼信号则可通过时域克拉默-克勒尼希关系（或希尔伯特变换）33,40（图 2B）、最大熵法41,42，或机器学习方法43,44,45,46,47,48 实现。需要注意的是，前两种方法通过解析方式从原始 BCARS 光谱中恢复相位信息（即共振拉曼信号），而机器学习方法可能高度依赖于仪器配置和训练模型。

尽管BCARS显微技术能够实现对生物样本代谢谱的无标记表征，但本研究中用于BCARS信号生成的同一超连续谱激光器（波长范围为950–1200 nm）也可激发多种染料，例如罗丹明类、Bodipy类、Alexa Fluor类和氰基染料，以及包括GFP和mCherry在内的多种荧光蛋白49,50。与使用可见光连续波（CW）激光器的单光子激发相比，采用近红外（NIR）光的多光子荧光显微技术，如双光子荧光寿命成像显微术（2p-FLIM）和双光子激发荧光显微术（TPEF），具有更深的样品穿透深度、固有的三维层析能力、高对比度图像以及可与最先进的共聚焦显微技术相媲美的分辨率，因此成为生物研究中极具吸引力的工具51,52。荧光寿命成像显微术（FLIM）采用时间相关单光子计数（TCSPC）方法，通过时间调制的激光源反复激发，检测荧光衰减信号53,54。特定荧光团的荧光光谱可能随溶剂极性等环境因素发生变化，但这些变化通常较为微弱。相比之下，荧光寿命在环境变化（如pH值55、黏度56、极性57、离子种类浓度58,59）、结合相互作用、淬灭剂存在或结构改变53,54）下常会变化两倍甚至更多。荧光寿命的这一独特性质为荧光成像提供了额外的信号对比度，已成功用于解决细胞和组织成像中的自发荧光干扰问题60，通过光谱分辨FLIM方法实现多种荧光团的解混61，癌症诊断与治疗监测62，无标记检测细胞异质性63,以及代谢变化的检测64,65。

在本研究中，我们介绍了一种结合了相干反斯托克斯拉曼散射显微（BCARS）、双光子荧光寿命成像（2p-FLIM）和双光子激发荧光（TPEF）的多模态成像平台。据我们所知，这是首次报道可同时实现BCARS与2p-FLIM/TPEF成像的成像平台。我们展示了该平台的 体内 利用一种广泛使用的遗传可操作模式生物，对该仪器的成像能力进行评估， 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫我们展示了可以同时获取BCARS光谱、尼罗红（一种重要的脂质染料）的2p-FLIM衰减信号以及报告脂质标记物（DHS-3::GFP）的双光子荧光GFP信号。 体内 来自经尼罗红染色的蠕虫。本文所介绍成像方法的实用指南包括：（i）样品应具有光学透明性，且厚度通常小于100 µm；（ii）染色条件可能因染料和样品的不同而有所差异。在尼罗红染色过程中 秀丽隐杆线虫 此处所示结果中，尼罗红的浓度约为 µM 水平，染色时间可从数小时至过夜不等66；（iii）需要一个黑暗的样品环境，以避免可见光泄漏到2p-FLIM/TPEF探测器中。这些成像条件与大多数非线性光学和荧光显微镜的成像条件相同。此外，通过引入另一台覆盖700–950 nm波长范围的钛宝石飞秒激光器用于双光子荧光激发，本研究中展示的系统还可进一步应用于检测除尼罗红和GFP之外的其他染料和荧光报告分子。因此，本方案中描述的代表性结果为 体内 染料染色成像 秀丽隐杆线虫 表达GFP的超高清信息化学生物成像平台具有广泛而深远的应用前景。

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方案

1. C . elegans 样品制备与尼罗红活体染色

注意：由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）具有全身透明的特性，已被广泛用于多种成像技术。其内部器官和组织可在完整动物体内直接成像，无需解剖。此外，涉及C. elegans的研究无需伦理审批，因为它们不属于脊椎动物，不受啮齿类等高等动物所适用的相同伦理法规约束。本部分描述了C. elegans线虫的同步化处理以及尼罗红染色样品的制备，用于荧光成像。通过两代产卵方案获得同步化的一日龄成虫，并使用新鲜配制的尼罗红-OP50平板进行染色。

  1. 在接种了OP50细菌的标准线虫生长培养基（NGM）平板上，于20 °C条件下培养 C. elegans 品系（例如N2、LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::dhs-3::GFP + unc-76(+)]）。
  2. 同步化线虫
    1. 挑选10–20只性成熟成虫至新制备的接种OP50的NGM平板上。
    2. 将平板置于20 °C孵育1–3小时，以允许产卵。
    3. 移除所有成虫，仅保留新产下的卵。
    4. 将平板在20 °C继续孵育，直至线虫发育至一日龄成虫阶段。
    5. 重复上述步骤一次，以进一步提高同步化精度。
  3. 制备尼罗红储存液
    1. 将15.92 mg尼罗红溶解于10 mL DMSO中，终浓度为5 mM。
    2. 如需要，超声处理10–30分钟以促进溶解。
  4. 制备尼罗红-OP50染色平板
    1. 将OP50菌液与尼罗红储存液充分混合，使每块NGM平板中尼罗红终浓度为5 µM。例如，取10 µL尼罗红储存液与20 µL OP50菌液混合，立即均匀涂布于未接种的6 cm（约含10 mL体积）NGM琼脂平板上，以获得每平板5 µM的终浓度。
    2. 将混合物均匀涂布于未接种的6 cm NGM平板上。
    3. 将平板避光、室温放置过夜，以促进细菌生长和染料吸收。
  5. 对同步化线虫进行染色
    1. 将30–50只同步化的一日龄成虫转移至每块已制备的尼罗红-OP50染色平板上。
    2. 在20 °C避光孵育1–2小时后进行成像。
  6. 固定线虫以进行成像
    1. 在载玻片上的2%琼脂糖垫上滴加一滴100 mM叠氮化钠溶液（约20只线虫使用10–15 µL）。
    2. 将染色后的线虫转移至麻醉剂（叠氮化钠）液滴中，并在显微镜观察前加盖盖玻片。
      注：在产卵同步化的第一步中，将10–20只性成熟成虫转移至新制备的NGM OP50平板时，仅转移成虫，避免带入任何散在的卵或幼虫。这是为了确保平板上保留的所有卵均来自所挑选的成虫，并在1–3小时的产卵窗口期内产出。此外，叠氮化钠属于危险化学品，尽管用于线虫麻醉的用量极小，其使用和废弃物处置必须严格遵守所在机构环境健康与安全部门的相关规定。

2. 探测光束的产生

注意：本方案描述了使用自制的光参量振荡器（OPO）产生皮秒（ps）探测光束，随后通过二次谐波产生（SHG）的过程 一个自制的信号反馈回路系统，用于稳定探测光束的输出功率。

  1. 开启1030 nm OPO泵浦激光器（图3A）或近1 ps、约3 W的OPO泵浦激光器（如图4所示），并至少等待2小时以达到热平衡。稳定的输出对OPO运行至关重要。
  2. 将输出光引导至OPO谐振腔
    1. 在OPO周期性极化铌酸锂（PPLN）（图3A）晶体上选择合适的极化周期，以匹配目标信号波长。
    2. 将光束导入第一个曲面镜（CM）（图3A），构成线性谐振腔的一部分。
    3. 确保光束穿过OPO周期性极化铌酸锂（PPLN）晶体（图3A），以实现光学参量下转换（图3B）。
    4. 确保光束经第二个曲面镜（CM）反射后，再由端镜（EM）（图3A）反射，形成谐振腔回路。
    5. 配置输出耦合器（OC）（图3A），以从谐振腔中提取生成的信号光束。
  3. 使用温度控制器（TC）（图3A）调节OPO PPLN晶体的温度，以选择信号波长。典型信号波长为1530 nm，在1064 nm泵浦功率为3 W时，对应输出功率约为0.8 W。
  4. 优化OPO准直
    1. 调节两个CM和EM的位置与倾斜角度，以最大化输出功率和光束质量。
    2. 调节谐振腔长度，使信号光谱移动至目标频率。
  5. 将OPO信号光束通过一组准直和聚焦光学元件，引导进入SHG阶段。
    1. 在SHG PPLN晶体（图3A）上选择合适的极化周期，以匹配目标信号波长。
    2. 使用温度控制器精确控制晶体温度，以最大化SHG效率。
    3. 将光束导入SHG PPLN晶体进行二次谐波产生，将1530 nm的OPO信号转换为765 nm（图3C）。在最佳准直条件下，典型的SHG转换效率约为30%。
    4. 在SHG PPLN晶体后插入一个1300 nm短通滤光片（SPF，见图3A，参数见材料表），以去除残余的1530 nm基频光。
    5. 使用适当的透镜（如图3A中的L）对产生的765 nm光束进行准直。
  6. 实施功率稳定化
    1. 使用楔形窗（WW）对SHG光束进行取样，并将其引导至光电二极管（PD）。
    2. 确保反馈回路将光电二极管信号（PD，见图3A）与参考值进行比较，并驱动端镜（EM）上的皮米电机（Picomotor），实时调节OPO谐振腔长度，从而稳定SHG输出功率。
      注：为确定参考值，首先使用皮米电机扫描EM位置，同时记录SHG输出功率。在该曲线中识别出峰值强度，然后将参考值设为峰值的90%。此选择可确保反馈校正方向明确，使系统能够补偿功率上升和下降趋势，从而有效实现长时间输出功率的稳定。

3. 用于宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）的超连续谱（SC）生成

注意：基于BCARS的多模态系统的简化示意图如图4所示。本方案描述了SC光束的生成过程。

  1. 调节飞秒（fs）脉冲输出（1030 nm，150 fs，约1 W）的预啁啾（群延迟色散，GDD），以获得足够宽的超连续谱（SC）带宽，覆盖指纹区信号（SC带宽 ≥ 1800 cm−1）。通过调节光栅对的间距（见图4）实现，从而精确控制色散。
    注意：应用预补偿的GDD对于生成所需脉冲并优化超连续谱产生至关重要。所需GDD值可能因所用激光系统的具体特性而异。
  2. 使用两个焦距相同的透镜组成光束望远镜，以调节泵浦光束的发散角。
    注意：当光束在进入展宽光纤前传播数米时，精确控制光束发散角变得至关重要。在此距离内保持准直光束对于确保高效的超连续谱生成至关重要。
  3. 使用配备压电致动器的运动学镜架搭建自动对准装置（见图4），用于光束导向。将这些镜架与光学楔形镜和位置敏感探测器（PSD）结合，以主动监测并校正光束对准。
  4. 布置各组件，使从楔形镜到第一面反射镜的距离等于从楔形镜到第一个PSD的距离。这种对称结构可确保进入展宽光纤的光束指向稳定性。
    注意：主动对准对于最大化光谱展宽效率并最小化光纤输入端损伤风险至关重要。
  5. 在光束耦合进入光纤前，使用半波片（HWP）和偏振分束器（PBS）控制激光功率。旋转HWP以调节相对于PBS的偏振角度，从而调节透射功率。尽管这些组件未在图4中显示，但它们对于安全对准和功率控制至关重要。
  6. 使用光纤耦合器将约1 W的激光功率耦合进一段10 cm长的大模场保偏光子晶体光纤（LMA-PM-5，PCF）。耦合步骤如下：
    1. 首先，在初始对准时将激光功率降低至约20–50 mW，以避免光纤损伤。
    2. 将准直光束导入光纤，确保部分光从另一端出射。通过调节光束位置优化光路，以最大化输出功率。
    3. 插入非球面透镜（见图4），再次微调光束以最大化输出功率。
    4. 调节非球面透镜的z方向位置，确保光束精确聚焦于光纤端面。
    5. 反复迭代调整对准和聚焦，以最大化耦合效率。
    6. 将激光功率提升至1 W进行工作。
  7. 使用焦距f = 15 mm的离轴抛物面（OAP）反射镜对PCF输出的宽带超连续谱（SC）进行准直，如图4所示。
    注意：对于宽带光束，优先选用反射式光学元件（如OAP镜），以最小化折射元件引入的色差。
  8. 将准直后的宽带超连续谱（SC）光束导入由一对Schott Flint（SF10）棱镜组成的棱镜压缩器（见图4）。
    1. 将SC光束导入第一块棱镜的顶点，以启动光谱色散。
    2. 布置第二块棱镜，使色散后的光束从其顶点进入。
    3. 将两块棱镜安装在导轨系统上，以实现棱镜间距的粗调。沿导轨移动第二块棱镜以调节光程长度和整体压缩效果。本系统的棱镜间距为44 cm。
    4. 将第一块棱镜安装在精密线性平移台上。调节第一块棱镜的插入深度，以精细调节色散补偿。
    5. 迭代调节棱镜间距和第二块棱镜的插入深度，以实现SC脉冲的最佳时间压缩。通过将实验观测到的简并四波混频（DFWM）信号与考虑群延迟色散（GDD）和三阶色散（TOD）的模拟结果进行比对，确定最佳时间压缩状态。该方法包括对超连续谱生成过程进行模拟，纳入GDD和TOD的影响，从而为最优压缩SC脉冲的预期时域和光谱特性提供参考。随后，迭代调节棱镜压缩器参数，补偿系统中存在的GDD和TOD，直至实验DFWM信号与模拟预测结果一致。典型的SC光谱轮廓如图5所示。
      注意：适当的色散补偿可增强SC的光谱相干性。在最佳对准时，SC输出功率约为150 mW，中心波长约为1060 nm，光谱范围从950 nm至1200 nm（对应1800 cm−1）。这些数值可能因对准状态和光纤耦合效率略有变化。
  9. 使用二向色镜（见图4中的DM）合并非共线的探测光束与超连续谱光束。利用一对针孔对两者进行对准，确保两束光共线。将合束后的光聚焦到一个高频光电二极管（带宽1 GHz）上。为获得最佳信号质量，两束光必须在空间和时间域均实现重叠。具体步骤如下：
    1. 将光电二极管输出连接至高频示波器（带宽500 MHz），并以激光触发信号作为参考时钟。
    2. 遮挡探测光束，测量SC脉冲，并记录SC脉冲与激光参考信号之间的时间差。
    3. 遮挡SC光束，测量探测脉冲。调节机械延迟线（见图4），使探测脉冲在时间上与SC脉冲重叠，确保两束光同时达到峰值。
    4. 移除光电二极管，使光束继续进入显微镜。
      注意：上述步骤描述了光束重叠的粗调过程。更精确的对准优化将在步骤6.1至6.9中进一步说明。

4. 设置双光子荧光寿命成像（2p-FLIM）和双光子激发荧光（TPEF）的荧光检测，并引入额外的钛宝石飞秒激光器

  1. 打开钛宝石激光器，并使其达到热平衡。等待约2小时，以确保输出功率和光束指向稳定。
    注意：本研究中，TPEF 和 FLIM 成像采用 SC 光源进行，该光源具有宽光谱覆盖范围和足够的输出功率，可有效激发 GFP 和 Nile Red 等荧光团。系统中还配备了 Ti:Sapphire 激光器，作为可选激发光源，用于激发双光子吸收峰低于 950 nm 的荧光团，此类荧光团可能无法被 SC 光源高效激发。
  2. 激活钛宝石激光器的锁模机制。确认锁模状态稳定 通过 内置显示器
  3. 使用棱镜压缩器对钛宝石激光脉冲进行预啁啾，以在样品处实现最佳的时间压缩。将棱镜排列成与步骤3.8中所述相似的构型，并调节第二个棱镜的插入深度以精细调节脉冲持续时间。
    注意：适当的时域压缩可确保在样品平面上实现峰值强度和高效的双光子激发。
  4. （可选）若激光器位于独立的光学平台上，可将钛宝石激光束耦合至保偏单模光纤。调节输入端耦合光学元件，并监测光纤输出，以最大限度减少耦合损耗。
  5. 使用二向色镜将钛宝石激光束与超连续谱（SC）和探测光束合并（参见图中PBS所示的合并点） 图3）。仔细调整光束，确保在二向色镜处实现空间重叠，并共同传播至显微镜。
  6. 将合并后的光束引导至显微镜，并精细调节其空间重叠。使用荧光样品（例如含有1 µm荧光聚苯乙烯微球的载玻片）验证Ti:Sapphire光束相对于BCARS激发光路的准直情况。调节Ti:Sapphire光束的准直反射镜，确保荧光发射与BCARS焦点在相同成像视野内共定位。通过同时采集的BCARS与TPEF图像观察两者重叠情况，以确认共定位效果，空间偏移应小于一个像素。
    注意：实现荧光信号与BCARS信号之间的空间重叠对于多模态图像配准至关重要。
  7. 在显微镜输入端前插入二向色镜，以将背向散射的荧光反射至检测光路。选择具有合适截止波长的二向色镜，以有效分离荧光信号与激发光束。
  8. 在发射光路的下游插入第二块二向色镜，将荧光信号分成两个检测通道：
    1. 将波长 ≥ 550 nm 的发射光传输至 FLIM 探测器。
    2. 将波长 ≤ 550 nm 的反射光导向光电倍增管（PMT），用于模拟双光子激发荧光（TPEF）检测。
      注意：在每个检测支路中安装带通滤光片，以阻断残余的激发光并分离特定的发射波段。
  9. 将PMT输出连接至前置放大器，并将放大后的模拟信号输入数据采集（DAQ）设备。将来自现场可编程门阵列（FPGA）的全局同步触发信号与DAQ共享，以确保不同成像模式之间的时间对齐图7).
  10. 将FLIM探测器输出端连接至时间相关单光子计数（TCSPC）模块。
    1. 将FLIM探测器信号连接至TCSPC模块的启动输入端。
    2. 将钛宝石激光器（或BCARS SC）的同步输出连接到TCSPC模块的参考输入端。
    3. 将全局相机触发信号（由FPGA生成）连接到TCSPC模块的帧同步输入端，以与线扫描图像采集同步。

5. 设置BCARS检测光路

注意：本方案描述了用于线扫描高光谱成像的去扫描检测光路的设置。一维振镜沿 y 轴扫描激发光束，每个像素点的驻留时间为 2–4 ms，以实现充分的信号积分。每次完成一行扫描后，样品台沿 x 轴前进一个步长。在快速光束扫描过程中，使用同步的次级振镜进行去扫描至关重要，可确保光谱信号在相机上的空间位置保持一致，消除相邻像素间的信号串扰，并保持空间-光谱保真度39。

  1. 将超连续谱（SC）和探测光束引入一维（1D）振镜扫描器（如图4所示，更多细节见参考文献39）。将振镜位置设置为与聚焦物镜的后光瞳共轭，以实现对视场范围内的精确光束扫描。
  2. 使用反射式扩束器（如图4所示）对每束光进行扩束，使其匹配激发物镜的后光瞳尺寸。这可确保在样品平面上实现最佳聚焦和最高空间分辨率。
    注意：使用反射式光学元件以最小化色差，并保持SC光束的宽带光谱特性。
  3. 在激发物镜的后光瞳平面放置一个对准目标。调节SC光束和探测光束，使两者均通过目标中心，确保沿光轴方向共线对准。
    注意：精确的空间重叠可最大化BCARS信号强度，并确保在焦点处获得最高空间分辨率。
  4. 使用倒置显微镜上安装的高数值孔径（NA）激发物镜（例如，1.2 NA，60倍水浸物镜）将光束聚焦到样品上。
  5. 通过将一滴水夹在两片盖玻片之间制备对准样品，形成密封的显微镜载片。将制备好的载片置于显微镜载物台上，并调节焦距使样品清晰可见。
  6. 使用位于激发光路对面的收集物镜，以透射方式收集产生的反斯托克斯信号。
  7. 构建一个4f去扫描系统（如图4所示），以保持反斯托克斯信号在探测器固定行上的空间映射。
    1. 使用4f光学系统将收集物镜的后焦平面（BFP）中继到去扫描振镜的轴线上。该系统由两个精密管镜（见材料表）组成，布置方式如下：
      1. 第一个透镜放置在收集物镜后焦平面后方一个焦距（200 mm）处。
      2. 第二个透镜放置在振镜前方一个焦距处。
    2. 使用FPGA控制的波形发生器同步去扫描振镜与扫描振镜。
    3. 在FPGA控制系统中集成一个7位数字电位器，以调节去扫描振镜的振幅。
      注意：去扫描振镜用于补偿主扫描振镜引入的角度偏转。通过动态同步调节其角度，可抵消光束移动，确保反斯托克斯信号始终沿通向光谱仪的光轴对准。这种稳定性对于维持探测器上的空间对应关系、防止扫描过程中光谱图像发生横向位移至关重要。
  8. 配置FPGA系统（见材料表），以同步振镜扫描和相机触发。
    1. 为扫描和去扫描振镜生成模拟输出信号。
    2. 接收来自位移台的触发输入信号，标记每一行扫描的起始点。
    3. 在每个扫描位置向科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机输出帧捕获触发信号。
    4. 独立控制去扫描振幅，以适配不同的收集物镜。
      注意：典型的FPGA脉冲序列包括扫描振镜驱动信号、去扫描振镜驱动信号、位移台触发输入以及用于同步帧时序的像素时钟。
  9. 使准直的反斯托克斯信号依次通过两个短通滤光片，以阻挡残余的泵浦光和SC激发光。
  10. 将滤波后的反斯托克斯信号聚焦通过光谱仪的入射狭缝并投射到sCMOS探测器上。调节扫描和去扫描振镜的角度，确保光束沿狭缝的长轴方向扫描，使光学像平面与狭缝对齐。这种精确对准可最大化光谱分辨率，并最小化探测器各行之间的横向信号串扰。
  11. 配置光谱仪，使反斯托克斯光谱在相机行方向垂直色散。选择合适的光栅（例如，300线/mm，闪耀波长700 nm），以实现最佳光谱覆盖范围。

6. 信号优化与光谱分辨率校准

  1. 启动自主开发的采集软件，开始从sCMOS相机实时监测信号。该采集软件基于Python 3.8+（Windows 10）自主开发，依赖Hamamatsu DCAM-API和Measurement Computing Universal Library驱动程序，数据以HDF5格式输出。软件可向通讯作者在合理请求下提供。
  2. 通过在两张盖玻片之间滴加一滴苯甲腈制备光谱校准样品，形成密封的载玻片。将载玻片置于显微镜载物台上，并使用激发物镜将其调至焦点。
  3. 在sCMOS相机上定位BCARS信号。调节收集物镜的z轴位置，以最大化反斯托克斯信号强度。
  4. 调节收集物镜的横向位置，确保反斯托克斯光正确聚焦通过光谱仪的入射狭缝。此对准可确保光谱仪的最佳耦合效果并提高光谱保真度。
  5. 优化超连续谱（SC）光束与探测光束在样品平面的空间重叠。通过调节探测光束光路中的反射镜，精细调整其横向位置和入射角度。
  6. 移动探测光束光路中的光学延迟线，确保其与SC脉冲实现时间重叠。监测信号强度并进行调节，直至反斯托克斯信号达到最大，确认实现正确的时间同步。
  7. 在sCMOS图像上识别苯甲腈中的一个强而尖锐的拉曼峰（例如，1002 cm-1）。
  8. 记录探测光波长及其在相机上的对应像素位置。利用瑞利线（探测波长处的0 cm-1）以及已知的苯甲腈拉曼峰（1002 cm-1 和 3073 cm-1），建立覆盖sCMOS探测器的线性像素-波数映射关系。瑞利线提供零波数参考点，苯甲腈峰则确定每像素对应的波数增量。
    注意：由于分析仅需相对波数信息（像素位置与拉曼位移之间的映射），无需使用发射灯进行绝对波长校准。
  9. 将像素-波数映射关系输入采集软件。除非对光路、光谱仪光栅设置或对准进行了更改，此校准应持续有效。

7. 信号采集

  1. 将步骤 1.1 至 1.6 中制备的 C. elegans 样品装载到显微镜载物台上。使用激发物镜定位感兴趣区域并调焦。
  2. 在载玻片上选择一个无拉曼活性信号的区域（如水背景或裸露的玻璃盖玻片），作为非共振背景（NRB）参考。
  3. 在 sCMOS 探测器上定位 BCARS 信号。微调收集物镜的 z 轴位置，以最大化反斯托克斯信号强度。
  4. 调整收集物镜的横向位置，确保反斯托克斯光正确对准光谱仪入口狭缝。
  5. 使用 FPGA 启动同步扫描与去扫描的振镜。通过数字电位器调节去扫描振镜的振幅，直至完全补偿主扫描引起的角偏转。在整个扫描范围内，反斯托克斯信号应被限制在相机上约 12 行之内。
  6. 定义时间采集序列
    1. 通过延迟探测脉冲，获取超连续谱（SC）脉冲与探测脉冲之间的互相关信号。为此，绘制积分后的三色 BCARS 信号随探测脉冲时间延迟的变化曲线。当 SC 与探测脉冲在时间上重叠时（时间为 0），信号最强。
      注：由于 FLIM 和 TPEF 检测系统与 BCARS 共享同一触发信号，因此在此时间点可同步采集其信号。
    2. 在探测光束的较晚延迟时间（例如 1–2 ps）采集 BCARS 信号，并在 SC 光束的较晚延迟时间采集非共振背景信号（见图 6A 中的 NRB 谱）。当对窄带脉冲（探测脉冲）施加时间延迟时，三色 CARS 信号中的 NRB 可被有效抑制，从而提高信噪比67。
    3. 在 SC 与探测脉冲无时间重叠时采集暗图像，以获取探测器的基线噪声（暗参考）。
    4. 将所有 BCARS、NRB 和暗图像及其元数据保存为单个 h5 文件。
  7. BCARS 信号处理流程
    1. 打开 CRIkit2 软件68。
    2. 使用 Open HDF 工具加载所有必要数据集（如图 6B 所示）：加载 BCARS 高光谱数据、NRB 参考数据和暗参考数据。使用Freq Window 工具选择 BCARS 信号生成带宽内的频率范围（本示例中 BCARS 系统的范围为 400 cm-1 至 ≥ 3200 cm-1）。
    3. 执行预处理步骤：
      1. 使用Anscombe 工具（如图 6B 所示）对 BCARS 和 NRB 数据集进行方差稳定化处理。
      2. 使用De-noise 工具执行奇异值分解（SVD）：根据视觉判断保留主成分。保留空间分布与样品形态一致的成分，剔除以无结构噪声或散斑噪声为主的成分。该去噪步骤可提高信噪比（SNR），尤其有助于增强弱光谱特征。
      3. 使用Inverse Anscombe 工具将数据恢复至原始域。
        注：若在采集过程中进行实时处理，可跳过上述步骤。
    4. 使用克拉默-克勒尼希（Kramers-Kronig, KK）变换获取类拉曼光谱：
      1. 打开KK 工具（如图 6B 所示）。
      2. 启用Norm to NRB，以确保光谱参考归一化的正确性。
      3. 设置参数，包括 NRB 偏置、填充因子和边缘像素平均。
      4. 执行 KK 变换，获得重建的拉曼光谱。
    5. 执行 KK 变换后的误差校正
      1. 使用 Savitzky-Golay 平滑法校正相位误差：打开phase error correction 工具（图 6B）。调整平滑窗口大小和多项式阶数。使用preview 面板检查校正前后的光谱差异。
      2. 校正尺度误差：打开scale error correction 工具（图 6B）。对光谱进行归一化，以校正数据集中相对强度的尺度偏差，确保空间和光谱维度上的一致性。
    6. 校准光谱轴（可选，若存在错位）：打开calibration 工具（图 6B）。将测得的波数与已知参考峰进行比较，并应用修正后的斜率/截距重新对齐光谱轴。
    7. 定义并提取感兴趣区域（ROI）的数据
      1. 使用ROI Spect. 或Pt Spect. 工具（图 6B）在 BCARS 图像中标记空间感兴趣区域或感兴趣点。
      2. 可视化并比较不同 ROI 的光谱内容。
      3. 导出重建的光谱，用于进一步的定量或化学计量学分析。

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结果

图5 显示了用于BCARS激发的窄带探针光和宽带超连续谱（SC）脉冲的实测光谱。探针脉冲通过自制光学参量振荡器（OPO，图3）输出的约1530 nm信号光经二次谐波产生（via second harmonic generation）获得，中心波长为764.2 nm，半高全宽（FWHM）为0.2 nm，可在所得拉曼光谱中提供约6.8 cm-1的光谱分辨率。SC脉冲通过将预啁啾的飞秒1030 nm激光脉冲耦合至一段10 cm长的光子晶体光纤（PCF）（见材料表）产生，光谱范围从约950 nm延伸至1200 nm（≥ 1800 cm-1），覆盖了整个生物相关的拉曼光谱区域（400 至 ≥ 3200 cm-1），包括指纹区（通过脉冲内三色激发）、沉默区（三色与二色激发混合）以及CH/OH伸缩振动区（通过脉冲间二色激发）。这两种光束共同作用，实现了具有高光谱特异性和宽泛振动覆盖范围的有效相干拉曼激发。

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讨论

本研究详细展示了宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）与双光子荧光寿命成像/双光子激发荧光（2p-FLIM/TPEF）成像平台的系统架构。尽管当前系统采用的是双输出1030 nm激光器，但大多数高功率飞秒1030 nm光纤激光器均可作为构建BCARS显微镜的主激光光源。通过精心选择OPO/SHG PPLN晶体的长度和周期，利用亚皮秒级OPO 1030 nm泵浦光产生数皮秒宽的探测脉冲是可行的。尽管本文展示的是相对较高的激光重复频率（100 MHz）或相对较低的脉冲峰值功率，但通过结合脉冲内与脉冲间激发（三色与两色信号生成）的BCARS信号激发方案，仍可有效生成BCARS信号。代表性结果中展示的活体秀丽隐杆线虫（in vivo C. elegans）图像进一步验证了使用自行搭建的超连续谱/探测光BCARS激光源进行生物成像的可行性。尽管我们此前已证明可通过样品台扫描方法实现BCARS光谱生物成像32,34，但采用本文所示的一维振镜扫描与descan光路结构，同样可实现同等质量的光谱与空间分辨率。最后，我...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露，且无竞争性经济利益。

致谢

W-W.C. 感谢美国国立卫生研究院（NIH，项目编号 R21AG086974）的支持。M.T.C. 感谢美国能源部（DOE BERDE-SC0022121）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
相机HamamatsuORCA-FusionsCMOS，2304×2304 像素
收集物镜 Olympus LUMPLFLN60XW 水浸，1.0 数值孔径
数据采集卡 Diligent MCC USB-1208HS 数据采集卡
延迟线 Newport DL225 用于探测脉冲的机械延迟
二向色镜 Semrock FF925-Di01 组合探测光与超连续谱光
二向色镜 Semrock FF705-Di01 用于检测背向荧光信号
二向色镜 Thorlabs DMLP550R 分离FLIM信号与双光子激发荧光信号
激发物镜 Olympus UPLSAPO60XWIR 水浸，1.2 数值孔径
滤光片 Semrock FF01-1326/SP-25 二次谐波产生后滤除基频激光
滤光片 Semrock FF01-758/SP 在BCARS相机前滤除基频激光
滤光片 Thorlabs FESH0650 在荧光模态前滤除基频激光
FLIM光电倍增管 PicoQuant PMA Hybrid FLIM单光子探测器
FPGA Redpitaya STEMlab 125-14 扫描同步与触发
振镜 Thorlabs GVS101 用于扫描与去扫描
光栅 Coherent LightSmyth 1040nm 1000 条/毫米，用于超连续谱的预啁啾
半波片 Thorlabs AHWP05M-980 偏振控制
K-cube Thorlabs KPA101 用于自动对准系统的PSD驱动器
激光器 Prospective Instruments FSX-Dual 双输出飞秒激光器
激光器 Coherent Mira-900 用于荧光激发的飞秒激光器
偏振分束器 Thorlabs PBS255 用于超连续谱与探测光的光束组合
光子晶体光纤 Thorlabs LMA-PM-5 10 cm长光子晶体光纤，用于超连续谱产生
光电探测器 Thorlabs PDA100A2 OPO反馈回路
压电镜架 Thorlabs POLARIS-K1S2P 用于自动对准系统的压电调节器
前置放大器 EdmundOptics 59-179 双光子激发荧光前置放大器
棱镜 Lambda Research optics EQP-30SF10 超连续谱压缩
位置敏感探测器 Thorlabs PDQ80A 用于自动对准系统的位置敏感探测器
光谱仪 Teledyne Princeton Instruments IsoPlane 160 300 线/毫米光栅，中心波长700 nm
载物台 ASI MS-2000 电动三轴载物台
时间相关单光子计数系统 PicoQuant MultiHarp 150 用于FLIM的光子计数设备
双光子激发荧光光电倍增管 Hamamatsu H9305-03 双光子激发荧光探测器
管镜 Thorlabs TL200-2P2 用于去扫描系统

参考文献

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