超高信息量化学成像结合宽带相干反斯托克斯拉曼与双光子荧光寿命显微技术

摘要

本文展示了一种多模态成像平台，该平台结合了宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）、双光子激发荧光（TPEF）和双光子荧光寿命成像显微技术（2p-FLIM），可实现超高信息含量的化学生物成像。

摘要

拉曼指纹光谱与荧光寿命成像正成为研究生物样本代谢特征的新兴工具。拉曼指纹光谱可检测反映样品分子组成及化学环境的内在分子振动，而荧光寿命成像则可测量对微环境敏感的荧光团激发态寿命的变化。本文介绍一种多模态成像平台，结合宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）与双光子荧光寿命成像（2p-FLIM）显微技术，能够获取具有生物学意义的拉曼指纹光谱与荧光寿命信号 在体 并且同时进行。通过对空间共定位的BCARS和2p-FLIM图像获取的大量化学信息，我们能够表征亚细胞区室之间的细微差异，并验证仅依靠荧光成像可能产生的假阳性结果。这一点通过直接比较从活体完整细胞中同一染料标记的细胞器上同时获得的BCARS、2p-FLIM以及双光子激发荧光（TPEF）信号得以证明。 秀丽隐杆线虫 表达绿色荧光蛋白（GFP）标记。在本研究中，我们介绍了BCARS/2p-FLIM/TPEF的系统构建方案、图像采集步骤、数据处理方法以及代表性结果，表明这种多模态成像方法能够实现对样品的严格表征和 体内 亚细胞分辨率检测。本方案提供了一种同时进行化学成像与荧光寿命成像的框架，以提高在复杂生命系统中生物学解释的准确性。

引言

生物学研究中的一个挑战是准确检测生物体在天然状态下以及完整细胞和组织结构中的生物构建材料。拉曼光谱在检测生物样本内源性代谢物和化学物质方面展现出前所未有的潜力，近年来已被认为是一种新兴的生物样本代谢谱分析工具¹。通过分析拉曼指纹光谱中各种代谢基团的峰位，越来越多的证据表明，这些指纹特征可用于检测癌症^2,3,4、心脏疾病^5,6和神经退行性疾病^7,8等疾病的早期阶段，并特别适用于解决基本的生物学问题^9,10，包括无需任何标记干扰即可成像细胞内结构¹¹、区分不同细胞状态^12,13以及细胞类型分类^14,

方案

1. C . elegans 样品制备与尼罗红活体染色

注意：由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）具有全身透明的特性，已被广泛用于多种成像技术。其内部器官和组织可在完整动物体内直接成像，无需解剖。此外，涉及C. elegans的研究无需伦理审批，因为它们不属于脊椎动物，不受啮齿类等高等动物所适用的相同伦理法规约束。本部分描述了C. elegans线虫的同步化处理以及尼罗红染色样品的制备，用于荧光成像。通过两代产卵方案获得同步化的一日龄成虫，并使用新鲜配制的尼罗红-OP50平板进行染色。

1. 在接种了OP50细菌的标准线虫生长培养基（NGM）平板上，于20 °C条件下培养 C. elegans 品系（例如N2、LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::dhs-3::GFP + unc-76(+)]）。
2. 同步化线虫
   1. 挑选10–20只性成熟成虫至新制备的接种OP50的NGM平板上。
   2. 将平板置于20 °C孵育1–3小时，以允许产卵。
   3. 移除所有成虫，仅保留新产下的卵。
   4. 将平板在20 °C继续孵育，直至线虫发育至一日龄成虫阶段。
   5. 重复上述步骤一次，以进一步提高同步化精度。
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结果

图5 显示了用于BCARS激发的窄带探针光和宽带超连续谱（SC）脉冲的实测光谱。探针脉冲通过自制光学参量振荡器（OPO，图3）输出的约1530 nm信号光经二次谐波产生（via second harmonic generation）获得，中心波长为764.2 nm，半高全宽（FWHM）为0.2 nm，可在所得拉曼光谱中提供约6.8 cm^-1的光谱分辨率。SC脉冲通过将预啁啾的飞秒1030 nm激光脉冲耦合至一段10 cm长的光子晶体光纤（PCF）（见材料表）产生，光谱范围从约950 nm延伸至1200 nm（≥ 1800 cm^-1），覆盖了整个生物相关的拉曼光谱区域（400 至 ≥ 3200 cm^-1），包括指纹区（通过脉冲内三色激发）、沉默区（三色与二色激发混合）以及CH/OH伸缩振动区（通过脉冲间二色激发）。这两种光束共同作用，实现了具有高光谱特异性和宽泛振动覆盖范围的有效相干拉曼激发。

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讨论

本研究详细展示了宽带相干反斯托克斯拉曼散射（BCARS）与双光子荧光寿命成像/双光子激发荧光（2p-FLIM/TPEF）成像平台的系统架构。尽管当前系统采用的是双输出1030 nm激光器，但大多数高功率飞秒1030 nm光纤激光器均可作为构建BCARS显微镜的主激光光源。通过精心选择OPO/SHG PPLN晶体的长度和周期，利用亚皮秒级OPO 1030 nm泵浦光产生数皮秒宽的探测脉冲是可行的。尽管本文展示的是相对较高的激光重复频率（100 MHz）或相对较低的脉冲峰值功率，但通过结合脉冲内与脉冲间激发（三色与两色信号生成）的BCARS信号激发方案，仍可有效生成BCARS信号。代表性结果中展示的活体秀丽隐杆线虫（in vivo C. elegans）图像进一步验证了使用自行搭建的超连续谱/探测光BCARS激光源进行生物成像的可行性。尽管我们此前已证明可通过样品台扫描方法实现BCARS光谱生物成像^32,34，但采用本文所示的一维振镜扫描与descan光路结构，同样可实现同等质量的光谱与空间分辨率。最后，我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
相机	Hamamatsu	ORCA-Fusion	sCMOS，2304×2304 像素
收集物镜	Olympus	LUMPLFLN60XW	水浸，1.0 数值孔径
数据采集卡	Diligent	MCC USB-1208HS	数据采集卡
延迟线	Newport	DL225	用于探测脉冲的机械延迟
二向色镜	Semrock	FF925-Di01	组合探测光与超连续谱光
二向色镜	Semrock	FF705-Di01	用于检测背向荧光信号
二向色镜	Thorlabs	DMLP550R	分离FLIM信号与双光子激发荧光信号
激发物镜	Olympus	UPLSAPO60XWIR	水浸，1.2 数值孔径
滤光片	Semrock	FF01-1326/SP-25	二次谐波产生后滤除基频激光
滤光片	Semrock	FF01-758/SP	在BCARS相机前滤除基频激光
滤光片	Thorlabs	FESH0650	在荧光模态前滤除基频激光
FLIM光电倍增管	PicoQuant	PMA Hybrid	FLIM单光子探测器
FPGA	Redpitaya	STEMlab 125-14	扫描同步与触发
振镜	Thorlabs	GVS101	用于扫描与去扫描
光栅	Coherent	LightSmyth 1040nm	1000 条/毫米，用于超连续谱的预啁啾
半波片	Thorlabs	AHWP05M-980	偏振控制
K-cube	Thorlabs	KPA101	用于自动对准系统的PSD驱动器
激光器	Prospective Instruments	FSX-Dual	双输出飞秒激光器
激光器	Coherent	Mira-900	用于荧光激发的飞秒激光器
偏振分束器	Thorlabs	PBS255	用于超连续谱与探测光的光束组合
光子晶体光纤	Thorlabs	LMA-PM-5	10 cm长光子晶体光纤，用于超连续谱产生
光电探测器	Thorlabs	PDA100A2	OPO反馈回路
压电镜架	Thorlabs	POLARIS-K1S2P	用于自动对准系统的压电调节器
前置放大器	EdmundOptics	59-179	双光子激发荧光前置放大器
棱镜	Lambda Research optics	EQP-30SF10	超连续谱压缩
位置敏感探测器	Thorlabs	PDQ80A	用于自动对准系统的位置敏感探测器
光谱仪	Teledyne Princeton Instruments	IsoPlane 160	300 线/毫米光栅，中心波长700 nm
载物台	ASI	MS-2000	电动三轴载物台
时间相关单光子计数系统	PicoQuant	MultiHarp 150	用于FLIM的光子计数设备
双光子激发荧光光电倍增管	Hamamatsu	H9305-03	双光子激发荧光探测器
管镜	Thorlabs	TL200-2P2	用于去扫描系统