机械刺激对髌下脂肪垫干细胞软骨形成功能的增强作用

Summary

本研究重点开发一种将循环拉伸机械刺激（10% 应变，1 Hz）与髌下脂肪垫衍生干细胞（IPFP-SCs）疗法相结合的多模态技术，研究它们对促进 IPFP-SCs 软骨成形成分化的协同作用，并建立更高效的软骨组织工程再生策略。

Abstract

髌下脂肪垫 （IPFP） 是膝关节前室内的一种特殊纤维脂肪结构，其特点是具有独特的微结构，具有散布的胶原蛋白束和脂肪小叶，共同建立了其粘弹性生物力学特性。新出现的证据强调了 IPFP-SC 独特的转录谱，特别是它们在骨关节炎进展过程中与软骨降解介质的关联。最近的研究表明，动态压缩和静水压力可有效增强骨髓来源和 IPFP 来源的间充质干细胞的软骨形成分化，同时抑制钙化沉积。本研究利用细胞拉伸系统模拟膝关节的循环机械应力环境，表明动态拉伸刺激（10% 应变，1 Hz）显着增强了 IPFP-SC 的软骨生成分化能力。这种增强表现为软骨形成标志物（包括SOX9和COMP）的表达上调，证实关节特异性机械微环境在间充质干细胞的终末分化中起着关键的调节作用。这些结果为软骨组织再生策略提供了重要的实验证据，强调了生物力学调节在软骨修复再生疗法中的重要性。

Introduction

软骨组织的再生和修复是骨关节炎治疗的核心挑战，因为由于微环境调节不足，传统细胞疗法通常无法重建功能性软骨基质。近年来，将物理机械刺激与细胞治疗相结合的多模态策略成为研究热点¹，旨在通过模拟 体内 生物力学微环境来增强干细胞的软骨分化潜力。本研究重点开发一种将循环拉伸机械刺激（10% 应变，1 Hz）与 IPFP-SCs 疗法相结合的多模态技术，研究它们对促进 IPFP-SCs 软骨分化的协同作用，并建立更有效的软骨组织工程再生策略。

本研究的核心目标是通过动态拉伸刺激增强 IPFP-SC 的软骨形成能力。先前的研究表明，机械信号可以通过调节细胞骨架重组，离子通道激活（例如，Piezo1）和下游信号通路（例如，YAP-SOX9^轴）来驱动间充质干细胞（MSC）的软骨分化2。现有文献为多模态刺激的协同效应提供了重要的见解。Buckley 和 Kelly 等人证实，周期性静水压力通过增强 sGAG 和 II 型胶原蛋白沉积来稳定软骨形成表型³。郭等报道，动态培养结合适当的机械刺激有助于祖细胞的有效扩增，从而能够产生临床相关的关节软骨细胞以修复软骨缺损。然而，与静态条件相比，仅剪切应力导致 hMSC 的软骨形成分化较差，而额外的压缩载荷上调了软骨形成标志物，例如 Sox9、聚集蛋白聚糖和 II 型胶原蛋白⁴。值得注意的是，仅剪切应力无法诱导显着的软骨特异性基因表达⁵。Zhang等人进一步证明，将机械刺激与外源性因素（例如SOX-9）相结合可显着提高分化效率⁶。研究表明，动态压缩诱导软骨分化，而抑制 ERK1/2 通路则消除了这种反应。相反，动态压缩下的ERK1 / 2抑制增强了成骨分化，其特征是碱性磷酸酶（ALP），I型胶原蛋白（COLI）和骨钙素（OCN^）的表达增加7。基于这些发现，本研究采用拉伸刺激作为核心干预措施，探索其与IPFP-SCs中内源性信号通路的协同作用（例如，Piezo1介导的钙调神经磷酸酶激活）²。这种方法更符合关节运动的多模态力学环境。此外，最近强调机械刺激⁸ 的时空特异性的研究为本研究中分阶段加载方案的设计提供了信息。

与传统的静态培养相比，该技术在两个关键方面进行了创新。首先，实施延迟刺激方案，以避免机械负荷对分化的早期抑制作用。例如，Luo等人证明，在细胞封装后21天施加的动态压缩可显着增强^{BMSCs 9}的软骨生成，这一原理已集成到当前的加载方案中。其次，精密机械刺激系统能够精确控制拉应力参数（强度、频率和持续时间），复制生理相关的生物力学条件。精确的参数控制对于获得可靠的结果至关重要，因为过大的机械负荷可能会导致细胞损伤¹⁰，而过度简化的机械环境可能会产生适得其反的结果¹¹。受先进的多机械耦合系统⁵ 的启发，开发的设备可确保稳定和可重复的刺激，并具有转化应用的高可扩展性。此外，利用 IPFP-SC 的独特优势，包括它们与关节软骨的发育同源性和高软骨形成潜力³，增强了该技术的临床可行性。

这项研究推进了对 IPFP-SC 软骨发生机制的了解，并支持临床软骨修复策略的发展。通过将多模式机械刺激与细胞疗法相结合，该技术解决了传统方法的局限性，并为术后生物力学康复方案提供了见解。综上所述，通过拉伸刺激与IPFP-SCs疗法的创新融合，本研究旨在建立一种高效、可控的软骨再生策略。其设计广泛借鉴了先前的机械生物学研究，同时为组织工程技术的临床转化开辟了新途径。

Protocol

该研究按照机构指南进行，并经内蒙古自治区人民医院伦理委员会批准（SC-07/01KT2024008）。所使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. IPFP-SC的解冻和扩容

1. 解冻 IPFP-SC。
   1. 在37°C水浴中快速解冻冷冻保存的IPFP-SC（P2-P5）。
   2. 将细胞转移到含有预热完全生长培养基（α-DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素）的 15 mL 离心管中。
   3. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于新鲜生长培养基中。
2. 展开单元格。
   1. 将细胞接种到两个 10 cm 培养皿中，密度为 5,000-8,000 个细胞/cm²。将细胞在37°C下与5%CO₂一起孵育。
   2. 每 2-3 天更换一次培养基，直到细胞达到 80-90% 汇合度。
   3. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 传代细胞并维持在培养物中以进行后续步骤。

2. 用于软骨分化的接种细胞

1. 制备细胞悬液。
   1. 当细胞达到80%-90%汇合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下消化细胞5分钟。
   2. 以 1：1 的比例加入完全培养基以终止消化。
   3. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于新鲜生长培养基中。
2. 播种细胞。
   1. 使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
   2. 将重悬的细胞稀释至专用培养皿的每个腔室 4 ×^{10 5} 个细胞的密度。
   3. 将腔室置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中 12-16 小时，以允许完全细胞附着。

3. 软骨形成预培养

1. 启动预分化。
   1. 从腔室中取出生长培养基。
   2. 用 1× DPBS（预热至 37 °C）冲洗细胞两次，以去除残留的血清和碎屑。
   3. 用预混合的软骨诱导培养基（不含生长因子）洗涤细胞两次。
   4. 用完全软骨诱导培养基替换洗涤培养基。
   5. 将培养物在37°C下以5%CO₂ 保持3天。
2. 监测细胞形态。
   1. 使用显微镜检查细胞粘附和早期聚集。

4. 循环拉伸机械刺激（第 7 天）

1. 准备机械刺激装置。
   1. 用 75% 乙醇对设备和培养室进行消毒，然后进行紫外线照射。
   2. 校准单轴电池拉伸系统，以 10 Hz 的频率提供 1% 的应变。
2. 启动刺激。
   1. 连续 7 天每天施加循环拉伸应力（10% 应变，1 Hz），持续 1 小时。
   2. 在整个增产期间，将环境条件保持在 37 °C，含 5% CO₂ 。
   3. 每72小时更换一次软骨诱导培养基。
3. 控制设置
   1. 包括在相同培养条件下无机械刺激的平行静态控制室。

5.免疫荧光染色

1. 样品制备和切割
   1. 用无菌手术剪刀或手术刀切割机械刺激的细胞接种膜，以匹配共聚焦培养皿的大小和形状。
   2. 确保修剪后的样品完全覆盖培养皿的成像区域。
2. 固定细胞。
   1. 用PBS洗涤细胞两次。
   2. 在室温（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟。
   3. 在室温下用 0.1% Triton X-100 在 PBS 中处理 10 分钟。
   4. 用PBS洗两次。
   5. 在室温下用 PBS 中的 2% BSA 封闭 30 分钟。
3. 记号笔的染色。
   1. 将样品在4°C下与在封闭溶液中稀释的一抗一起孵育过夜：抗SOX9（1：200）和抗COMP（1：200）。
   2. 用PBS洗涤样品3次。
   3. 在PBS中以1：1000的比例稀释荧光偶联二抗。
   4. 加入 100 μL 稀释的二抗溶液以覆盖样品。
   5. 在室温下在避光的轨道振荡器上孵育1小时。
   6. 用PBS洗涤样品3次。
4. 图像采集
   1. 使用荧光显微镜观察样品。
   2. 在一致的曝光设置下拍摄图像。

6. 定量PCR（qPCR）分析

1. 提取 RNA
   1. 在TRIzol试剂中裂解细胞。
   2. 按照制造商的方案分离总 RNA。
   3. 使用分光光度计测量RNA浓度和纯度。
2. 合成 cDNA。
   1. 使用高容量 cDNA 合成试剂盒将 1 μg RNA 逆转录为 cDNA。
3. 进行qPCR。
   1. 使用 SYBR Green 预混液和软骨形成标记物（SOX9、COMP）和管家基因的特异性引物制备 qPCR 反应。
   2. 在实时荧光定量 PCR 系统上一式三份运行测定。包括无模板控件。

7. 可重复性

1. 无 菌
   1. 在层流罩下执行所有步骤，以防止污染。
2. 参数一致性
   1. 每天验证机械刺激设置（应变、频率和持续时间）。
3. 复制
   1. 每个条件至少包括三个生物重复。
4. 数据规范化
   1. 将 qPCR 数据归一化为管家基因和静态对照。

Results

本研究的代表性发现表明，循环拉伸机械刺激在软骨诱导下增强了IPFP-SCs的软骨分化。具体而言，与静态对照组相比，承受 7 天拉伸载荷的 IPFP-SC 在两个转录水平上表现出软骨形成标志物的显着上调， SOX9 表达和 COMP 产生增加证明了这一点。这些协调的分子和结构反应证实，生物力学刺激与生化线索协同作用，以增强软骨基质的合成，为软骨组织工程和再生医学中开发机械生物学决策提供了重要的见解（图1）。

图1：拉伸载荷通过上调SOX9和COMP促进IPFP-SC的软骨形成分化。 （A）SOX9 mRNA（qR...

Discussion

概述的方案将循环拉伸机械刺激（10% 应变，1 Hz）与 IPFP-SC 相结合，以增强软骨分化，解决软骨再生中的关键挑战。关键步骤包括精确的细胞扩增、分阶段的软骨形成预培养（3 天）、延迟机械刺激（从第 3 天开始，持续 7 天）以及通过免疫荧光（SOX9、COMP）和 qPCR 进行刺激后分析。方案的机械刺激，以先前的机械生物学研究为依据，避免了过早抑制分化，同时促进基质沉积3,4,7,8。强调严格的参数控制（应变、频率、持续时间）和环境一致性（无菌性、CO₂、温度）以确保可重复性。修改可能涉及调整刺激开始或应变大小 （5%-15%） 以改善结果 ^9,11

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% 多聚甲醛	生物夏普	BL539A型
抗荧光猝灭封闭液（含DAPI）	碧奥泰姆	P0131
阻塞解决方案	碧奥泰姆	P0260
细胞培养室	艾尔泰克	AZ2020062530
电池罐	细胞 &力
Col II 一抗	阿布卡姆	AB34712
E.Z.N.A. HP 总 RNA 试剂盒	欧米茄	R6812-00S
F-肌动蛋白一抗	蛋白质科技	PF00001
Fetal Bovine Serum	细胞	SA101.02
山羊对 Rb IgG	阿布卡姆	AB50077
Hieff qPCR SYBR 绿色预混液（Low Rox Plus）	耶森	11202ES50型
人间充质干细胞软骨诱导试剂盒	富源生物	FY200008
徕卡 DMi8 倒置生物显微镜	徕卡	DMi8
LightCycler 96 仪器	罗 氏	16056
MEM-&阿尔法;	吉布科	C12571500BT
公共广播公司	服务生物	G4202
青霉素-链霉素-两性霉素B	新新生物科技	C100C8型
Piezo1 一抗	蛋白质科技	15939-1-AP
PrimeScript RT 试剂盒（完美实时）	宝	RR037A型
SOX9 一抗	阿布卡姆	AB185230
海卫一X-100	西格	SG6193
Veriti Dx 96 孔热循环仪	赛默飞世尔	EN61326