本研究旨在开发一种多模态技术，将周期性张应力机械刺激（10% 应变，1 Hz）与髌下脂肪垫来源干细胞（IPFP-SCs）治疗相结合，探究其在促进IPFP-SCs软骨向分化方面的协同作用，从而建立一种更高效的软骨组织工程再生策略。
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摘要
摘要
髌下脂肪垫（IPFP）是膝关节前部隔室中一种特化的纤维脂肪结构，其独特的显微结构特征为交错分布的胶原纤维束与脂肪小叶，共同构成了该组织的黏弹性生物力学特性。新近证据表明，IPFP来源的干细胞（IPFP-SCs）具有独特的转录谱特征，尤其在骨关节炎进展过程中与软骨降解介质密切相关。最近研究表明，动态压缩与静水压力可有效促进骨髓来源及IPFP来源间充质干细胞的软骨向分化，同时抑制钙化沉积。本研究采用细胞拉伸系统模拟膝关节内的周期性机械应力环境，结果显示动态张力刺激（10%应变，1 Hz）可显著增强IPFP-SCs的软骨向分化能力。该效应表现为软骨分化标志物如SOX9和COMP的表达显著上调，证实关节特异性的机械微环境在间充质干细胞终末分化过程中发挥关键调控作用。上述结果为软骨组织再生策略提供了重要的实验依据，强调了生物力学调控在软骨修复再生治疗中的重要性。
引言
软骨组织的再生与修复是骨关节炎治疗中的核心难题，因为传统的细胞疗法常因对微环境调控不足而难以重建功能性软骨基质。近年来，将物理力学刺激与细胞疗法相结合的多模态策略已成为研究热点1，旨在通过模拟增强干细胞的软骨分化潜能 体内 生物力学微环境。本研究旨在开发一种多模态技术，将循环拉伸力学刺激（10%应变，1 Hz）与髌下脂肪垫来源干细胞（IPFP-SCs）治疗相结合，探究二者在促进IPFP-SCs软骨向分化方面的协同作用，从而建立一种更高效的软骨组织工程再生策略。
本研究的核心目标是通过动态拉伸刺激增强IPFP-SCs的软骨生成能力。既往研究表明，机械信号可通过调控细胞骨架重排、离子通道激活（如Piezo1）以及下游信号通路（如YAP-SOX9轴）来驱动间充质干细胞（MSCs）的软骨向分化2。现有文献为多模式刺激的协同效应提供了关键见解。Buckley和Kelly等人证实，周期性静水压可通过增强糖胺聚糖（sGAG）和II型胶原的沉积来稳定软骨表型3。郭等人报道，动态培养结合适当的机械刺激可有效扩增前体细胞，从而生成具有临床意义的关节软骨细胞，用于修复软骨缺损。然而，与静态条件相比，单纯剪切应力导致hMSCs的软骨向分化效果较差，而额外施加压缩载荷则上调了Sox9、聚集蛋白聚糖（aggrecan）和II型胶原等软骨向标志物....
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方案
本研究遵循机构指南，并已获得内蒙古自治区人民医院伦理委员会批准（SC-07/01KT2024008）。所用试剂和设备列于材料表中。
1. IPFP-SCs 的解冻与扩增
- 解冻IPFP-SCs。
- 将冻存的IPFP-SCs（P2-P5代）在37 °C水浴中快速解冻。
- 将细胞转移至含有预热完全培养基（α-DMEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素）的15 mL离心管中。
- 在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。
- 扩增细胞。
- 以5,000–8,000个细胞/cm2的密度将细胞接种至两个10 cm培养皿中。在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。
- 每2–3天更换一次培养基，直至细胞达到80–90%融合度。
- 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代，并继续培养以用于后续实验步骤。
2. 软骨分化细胞接种
- 制备细胞悬液。
- 当细胞融....
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结果
本研究的代表性结果表明，在成软骨诱导条件下，周期性拉伸力学刺激可增强髌下脂肪垫来源干细胞（IPFP-SCs）的成软骨分化。具体而言，接受7天拉伸负荷的IPFP-SCs在转录水平上显著上调了成软骨标志物的表达，表现为与静态对照组相比，SOX9 表达和 COMP 生成明显增加。这些协调一致的分子与结构响应证实，生物力学刺激与生化信号协同作用，可增强软骨基质的合成，为软骨组织工程和再生医学中基于力生物学的策略开发提供了关键见解（图1）。
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讨论
该方案结合周期性张应力机械刺激（10% 应变，1 Hz）与膝下脂肪垫间充质干细胞（IPFP-SCs），以促进软骨向分化，应对软骨再生中的关键挑战。主要步骤包括细胞的精确扩增、分阶段软骨向预诱导培养（3 天）、延迟机械刺激（于第 3 天开始，持续 7 天）以及刺激后的分析 通过 免疫荧光SOX9，COMP）以及定量聚合酶链式反应（qPCR）。该机械刺激方案借鉴了既往的力学生物学研究，可在促进细胞外基质沉积的同时，避免过早抑制细胞分化。3,4,7,8严格的参数控制（应变、频率、持续时间）和环境一致性（无菌性、CO₂）2，温度）被强调以确保可重复性。可根据需要调整刺激起始时间或应变幅度（5%–15%）以优化结果9,11
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致谢
本工作由以下机构资助： 中国内蒙古自治区自然科学基金（2024ZD32 和 2024LHMS08015），以及首都地区公立医院高水平临床重点专科建设科技项目（2024SGGZ015）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | biosharp | BL539A | |
| 抗荧光淬灭封片液（含DAPI） | Beyotime | P0131 | |
| 封闭液 | Beyotime | P0260 | |
| 细胞培养腔室 | AIRTECH | AZ2020062530 | |
| 细胞培养罐 | CELL &FORCE | ||
| II型胶原一抗 | Abcam | AB34712 | |
| E.Z.N.A. HP 总RNA提取试剂盒 | OMEGA | R6812-00S | |
| F-肌动蛋白一抗 | Proteintech | PF00001 | |
| 胎牛血清 | CellMax | SA101.02 | |
| 山羊抗兔IgG | Abcam | AB50077 | |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus） | YEASEN | 11202ES50 | |
| 人源间充质干细胞软骨诱导分化试剂盒 | Fuyuanbio | FY200008 | |
| Leica DMi8 倒置生物显微镜 | LEICA | DMi8 | |
| LightCycler 96 实时荧光定量PCR仪 | Roche | 16056 | |
| MEM-α | Gibco | C12571500BT | |
| PBS缓冲液 | Servicebio | G4202 | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B混合液 | NCM Biotech | C100C8 | |
| Piezo1一抗 | Proteintech | 15939-1-AP | |
| PrimeScript RT 试剂盒（完美实时） | Takara | RR037A | |
| SOX9一抗 | Abcam | AB185230 | |
| TritonX-100 | SCIGE | SG6193 | |
| Veriti Dx 96孔梯度PCR仪 | Thermo Fisher | EN61326 |
参考文献
- Schätti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
- Yan, W., et al.
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