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活细胞成像观察小鼠卵母细胞减数分裂过程中的染色体分离

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DOI：

10.3791/68847

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2025年10月10日

 , 
1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

本文内容

摘要

本文总结了利用 H2B-RFP 标记染色质和 SiR-微管蛋白标记纺锤体，对小鼠卵母细胞中染色体分离过程进行活细胞成像的技术。我们详细介绍了样本制备、显微注射、培养、成像设置及数据分析等步骤，为实现高分辨率且光毒性最小化的减数分裂染色体动态成像提供实用指南。

摘要

卵母细胞减数分裂过程中染色体的准确分离对于确保胚胎正常发育以及预防非整倍体相关疾病至关重要。活细胞成像结合荧光标记技术已成为以高时空分辨率研究减数分裂染色体动态的有力手段。本实验方案总结了在活体小鼠卵母细胞中可视化染色体分离的关键方法，重点介绍使用组蛋白H2B-RFP标记染色质以及SiR-微管蛋白追踪纺锤体的技术。我们详细描述了样本制备、mRNA显微注射、卵母细胞培养、活细胞成像腔室搭建以及共聚焦显微镜参数设置等操作步骤，所有条件均经过优化，以实现高分辨率成像的同时最大限度降低光毒性。此外，我们还强调了若干关键实验考量因素，包括光毒性控制、图像处理以及减数分裂事件的定量分析。通过系统评估现有方法，本方案为致力于研究活体卵母细胞中染色体动态的研究人员提供了实用指南，有助于提升减数分裂研究的准确性与可重复性。

引言

在卵母细胞减数分裂过程中，对染色体和纺锤体动态进行准确的可视化观察，对于理解调控雌性配子成熟及非整倍体风险的机制至关重要1,2,3,4,5。哺乳动物的卵母细胞经历一系列高度协调的减数分裂事件，包括生发泡破裂（GVBD）、染色体凝集、纺锤体组装以及不对称分裂6。尽管固定时间点的成像技术为这些过程提供了有价值的静态图像，但其时间分辨率有限，无法捕捉采样间隔之间发生的瞬时或快速事件。相比之下，对荧光标记的染色体和微管进行活细胞成像，为实时监测这些动态过程提供了一种强有力的方法2,3,7。该方法可直接观察单个卵母细胞中减数分裂事件的时间、持续时长和顺序，并能够识别在固定样本中可能被遗漏的瞬时事件。然而，在显微注射和成像过程中维持卵母细胞的活力和生理完整性，需要精细的操作和优化的条件8。

本方案描述了一种对小鼠生发泡（GV）期卵母细胞进行H2B-RFP cRNA显微注射的完整操作流程，可实现染色质的荧光标记，并随后通过共聚焦显微镜对减数分裂全过程中的染色体和纺锤体行为进行延时成像4。该方法整合了多个关键步骤，包括激素预处理、卵母细胞分离、在温度可控条件下进行显微注射，以及利用具备环境控制功能的共聚焦显微镜进行活细胞成像4,9。本文的总体目标是提供一种稳健且可重复的操作流程，用于实时观察活体小鼠卵母细胞中染色体和纺锤体的动态变化，为研究减数分裂调控及非整倍体风险相关的分子与细胞机制提供技术平台。

尽管该方案具有较高的时间和空间分辨率，但它依赖于外源报告基因的表达，这可能无法完全模拟内源性蛋白质的动态变化，并且如果过表达，还可能干扰天然的减数分裂过程。研究人员应考虑这些局限性，并在可能的情况下，采用互补的方法对研究结果进行验证。

本方案旨在支持对减数分裂机制、染色体分离错误以及遗传或环境干扰对卵母细胞质量影响的研究。它为生殖生物学领域的基础研究和转化应用提供了可靠的实验平台。

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方案

所有实验必须根据当地动物伦理委员会批准的方案进行。实验操作应严格遵守“3R”原则——替代、减少和优化。小鼠必须饲养在经认证的动物设施中，环境条件标准化（22 °C，60%湿度），并可自由获取食物和水。

1. 卵母细胞的收集与制备

注意：所有仪器和试剂必须无菌。所有卵母细胞操作均需在体视显微镜下使用口控移液管进行（参见材料表）。所有培养液滴均需用矿物油覆盖（图1A-E）。

  1. 激素刺激
    1. 在收集卵母细胞前46-48小时，对3-4周龄的雌性小鼠腹腔注射5国际单位（IU）的孕马血清促性腺激素（PMSG；参见材料表）。
      ​注：推荐使用B6CBAF1小鼠（C57BL/6J × CBA/CaCrl的F1代），因其卵母细胞产量较高且成熟特性良好。
  2. 培养基的制备
    1. 使用0.2 µm注射器滤器过滤M2和M16培养基（参见材料表）。通过稀释100 mM的储备液，将IBMX补充至终浓度为100 µM。
    2. 在35 mm塑料细胞培养皿中制备5-6滴M2-IBMX（每滴约30 µL）和3滴M16-IBMX。所有液滴均覆盖矿物油。将M2-IBMX培养皿置于37 °C加热块上（图1A），M16-IBMX培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中，至少平衡30分钟后再进行卵母细胞分离（图1C）。
    3. 另准备一个培养皿，内含800-1,000 µL M2-IBMX（不加矿物油），用于卵巢解剖。将其放置在体视显微镜下方的37 °C加热板上（图1B）。
  3. 卵母细胞的分离
    1. 通过颈椎脱位法处死小鼠。用70%乙醇擦拭下腹部，然后在皮肤和腹膜上做一小的横向切口以进入腹腔。用手拉开切口边缘以扩大切口。
    2. 用镊子将肠道移开，暴露位于上腹部、肾脏上极处的卵巢。使用精细镊子和显微剪小心地切除卵巢，避免损伤组织。立即将卵巢转移至含有100-200 µL预温M2-IBMX培养基的1.5 mL离心管中。
    3. 将卵巢转移至1 mL预温的M2-IBMX培养基中，并移至加热的解剖显微镜载物台上（图1B）。仔细去除脂肪组织和输卵管残余部分。
      注：操作卵巢时应轻柔，防止卵泡或卵母细胞受损。从动物房转移至实验室过程中，应始终保持卵巢处于温热的培养基中。
    4. 使用27 G针头穿刺卵泡以释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）（图1A-B）。收集COCs并转移至25-30 µL的M2-IBMX液滴中（图1D）。
    5. 使用窄口玻璃巴斯德移液管反复吹打，使卵丘细胞解离（图1E）。
      注：尽管口吸移液法常用于卵母细胞操作，但机械移液器或显微操作仪可作为替代方案，尤其适用于禁止或无法实施口吸移液的实验环境。此类替代方法已在类似实验方案中成功应用10,11。
    6. 在20x-40x体视显微镜下，根据卵母细胞直径较大及生发泡（GV）位于中央的特征，识别并挑选完全成熟的GV期卵母细胞。将其转移至置于37 °C加热块上的新鲜30 µL M2-IBMX液滴中，并避光保存。
      注：所有操作过程中均应将卵母细胞维持在37 °C，以保持其生理完整性。所有培养基均需预温，并在显微镜操作和显微注射过程中使用温控载物台。
    7. 显微注射前，将卵母细胞在37 °C加热载物台上静置恢复20分钟。

2. H2B-RFP cRNA 的制备

注意：所有步骤均需佩戴手套，在洁净且无RNase的环境中进行。仅使用无RNase的水和试剂，最好在存在RNase抑制剂的条件下操作。

  1. 对H2B-RFP质粒进行序列验证（参见 材料表通过使用跨越插入片段的引物进行Sanger测序来验证。通过转化感受态细胞扩增质粒 E. coli （例如 DH5α），挑取单个菌落，并在含有适当抗生素的 LB 肉汤中培养。使用标准的中提或大提质粒提取试剂盒纯化质粒。详细步骤参见 Green 和 Sambrook12.
  2. 使用商业质粒小提试剂盒，按照制造商说明书纯化质粒DNA。使用分光光度计测定DNA浓度。
  3. 使用合适的限制性内切酶（如用于H2B-RFP的NotI）在插入片段下游对2-4 µg质粒DNA进行线性化。按照相应缓冲液和酶浓度说明设置消化反应 表1 并在37 °C孵育1-2小时 h. 通过琼脂糖凝胶电泳确认完全线性化。出现多条条带表明消化不完全。若使用商业试剂盒，请遵循生产商说明书。
    注意：选择一种在插入片段下游精确切割且在最佳消化条件下发挥作用的限制性内切酶。通过将少量等分试样在琼脂糖凝胶上电泳来验证线性化效果。
  4. 通过加入1 µL蛋白酶K（10 µg/mL）、5.3 µL 10% SDS和50 µL无核酸酶水，在50 °C孵育1小时，以去除RNase污染。
    注意：此步骤对于消除RNase和蛋白质污染物至关重要。必须仅使用无RNase的试剂，并保持清洁的工作环境。
  5. 用酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提消化后的DNA，随后用氯仿再抽提一次。
    注意：为尽量降低毒性并简化样品处理，可使用商业化的柱式或磁珠纯化方法（如硅胶膜或磁珠系统）替代苯酚/氯仿抽提。
  6. 加入 3 M 醋酸钠和 100% 乙醇沉淀 DNA。在 −80 °C 孵育至少 2 小时。
  7. 通过离心（12,000-14,000 x g）沉淀DNA g 10分钟 4 °C 下离心 5 分钟。用 70% 乙醇洗涤沉淀，相同转速再次离心 5 分钟，4 °C，短暂空气干燥（2-5 分钟），并在 6 µL 无 RNase 水中重悬。
    注意：乙醇沉淀并离心后，管底应出现可见的透明或白色沉淀。若未观察到沉淀，请以更高转速重复离心，或重新评估DNA浓度。
  8. 执行 体外 使用T7 mMESSAGE mMACHINE试剂盒（见表2）按照制造商方案进行转录。
  9. 在 37 °C 下孵育转录反应至少 2 小时。若转录本长度超过 5 kb，应延长孵育时间。
  10. 使用 DNase I 处理去除模板 DNA，每 10 µL 反应体系中加入 1 U DNase I，37 °C 孵育 15 分钟。
  11. 使用氯化锂沉淀法纯化合成的cRNA13沉淀和离心后，管底应出现可见的半透明或白色沉淀。用70%乙醇洗涤RNA沉淀。
  12. 将最终的cRNA沉淀重悬于20 µL无RNase的水中。测定RNA浓度，并通过RT-PCR扩增后对PCR产物进行测序，以确认poly(A)尾的存在及其长度。将cRNA分装为每管1 µL，于−80 °C保存。

3. 卵母细胞的准备与显微注射

注意：整个操作过程中，使用预热的培养基和温度可控的显微镜载物台，将卵母细胞保持在 37 °C，以维持卵母细胞质量。

  1. 准备
    1. 将 H2B-RFP cRNA 分装样品置于冰上解冻，短暂离心后稀释至所需浓度（例如，250 ng/µL）。
      ​注意：最佳 cRNA 浓度可能因构建体、表达系统和实验目标而异。建议对 cRNA 浓度进行滴定（例如，在 50–300 ng/µL 范围内），以在确保足够信号的同时尽量减少过表达带来的假象。用户还应监测减数分裂进程（例如生发泡破裂、纺锤体形成和极体排出），作为表达构建体后卵母细胞健康和活力的功能性读数。已有文献报道，cRNA 的注射浓度通常在 0.2 至 1 µg/µL 之间，通常在 0.5 µg/µL 时获得最佳效果2,3,4,5,7,8,9。
    2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.5 mm，内径 = 0.86 mm，长度 = 100 mm）通过拉针仪制备显微注射针（图 2A）。
      注意：我们使用垂直拉针仪（见材料表；图 2A）。拉针参数需根据经验优化。针尖应足够细以最小化对卵母细胞的损伤，但又不能过细以免堵塞，并确保 cRNA 平稳注入。
    3. 使用无 RNase 的微量加样吸头将 0.5–1.5 µL cRNA 溶液装入注射针尖。注射前去除所有气泡。
  2. 显微注射培养皿的准备
    1. 在显微注射培养皿中加入 100 µL M2-IBMX 培养基，并完全覆盖矿物油，以防止蒸发和渗透压变化。
  3. 卵母细胞显微注射
    1. 将持卵针和注射针安装到显微操作仪系统上（图 2B，C）。
    2. 将显微注射培养皿置于显微镜载物台上。使用口控吸管将卵母细胞转移至 M2-IBMX 液滴中。
    3. 调整持卵针和注射针，使其与卵母细胞处于同一水平面。
    4. 使用持卵针施加轻微负压捕获一个卵母细胞（图 2B 和 C）。
    5. 将注射针穿过透明带和卵质膜，靶向细胞质，避免进入细胞核。
    6. 通过细胞内电位计施加短暂的负电容脉冲，注入 H2B-RFP cRNA（图 2B–E）。注射体积应约为卵母细胞体积的 5%。成功的注射通常可见细胞质出现小范围但明显的扩散。调整注射压力和注射时间，以避免膜损伤。
    7. 以相同角度迅速而平稳地撤出注射针，以最小化膜撕裂。
    8. 释放持卵针中的卵母细胞，并将其移至培养皿的另一区域，以区分已注射和未注射的卵母细胞（图 2F）。在此设置中，建议将未注射的卵母细胞置于培养皿上部，已注射的移至下部，以优化操作流程。
    9. 对所有剩余卵母细胞重复步骤 3.3.4–3.3.8。注射后的存活率因技术及 mRNA 特性而异，预期存活率为 60%–80%。
  4. 注射后处理
    1. 将已注射的卵母细胞转移至洁净培养皿中的新鲜 M16-IBMX 培养基液滴中。
    2. 在 37 °C 下孵育 1–4 小时，以允许 H2B-RFP 表达。根据 cRNA 浓度、转录本大小和表达效率调整孵育时间。

4. 减数分裂期间对 H2B-RFP 标记的染色体进行延时成像

  1.  设备与培养基的准备
    1. 将共聚焦显微镜载物台培养箱及环境舱预热至 37 °C，持续 ≥ 30 分钟 使用前1分钟图3A）。打开气体控制器并启动气体流动，以维持腔室中5% CO的浓度2 和环境 O2确保在长时间活细胞成像过程中，培养环境保持湿润，以维持卵母细胞的健康状态。
    2. 准备培养液滴：在培养皿中加入5-6滴含SiR-Tubulin（100）的M16培养基，每滴50 µL nM 终浓度）于 35 毫米培养皿。加入矿物油覆盖。在另一个玻璃底成像培养皿中，放置三滴5 µL的M16 + SiR-微管蛋白溶液，并用矿物油覆盖。将两个培养皿于37 °C预热不少于30分钟。 使用前静置 1 分钟。
  2. 卵母细胞移植与洗涤
    1. 洗涤卵母细胞：将显微注射后的卵母细胞依次转移至50 µL M16 + SiR-Tubulin液滴中，以去除残留的IBMX（建议洗涤5次）。操作时应轻柔，避免损伤卵母细胞。
      ​注意：残留的IBMX可能抑制减数分裂的恢复，因此彻底洗涤至关重要。
    2. 最终转移：洗涤后，将15–20个卵母细胞转移至预热的玻璃底成像培养皿中含M16 + SiR-Tubulin的5 µL液滴中。
  3. 显微镜设置
    1. 成像皿安装：将玻璃底培养皿放置在共聚焦显微镜载物台上（图3A）。让卵母细胞静置约10分钟 最小
    2. 卵母细胞定位：利用明场成像将卵母细胞置于视野中央，使用显微镜软件保存位置。
      ​注意：本研究中使用的是配备 HC PL APO 20x/1.0 NA 水镜的 Leica TCS SP8 共聚焦显微镜。然而，也可根据实际条件选用其他具有类似规格的共聚焦系统和物镜.
    3. 用于水浸物镜的水泵装置设置：若使用水浸物镜，应运行水泵系统，以每5-10分钟间隔间歇性供水。此周期性水流可维持物镜与玻璃底成像培养皿之间的水柱，防止干燥，确保长期实验过程中成像条件的稳定。对于油浸物镜，无需此水流装置。
  4. 成像设置
    1. 切换至激光扫描模式。将激光强度设置如下：561 nm，0.5%（物镜处约100 µW）用于H2B-RFP（染色体）；633 在物镜处3%强度下（约300 µW）激发SiR-微管蛋白（纺锤体微管）时的nm波长 图3B，E).
      注意：遵循适当的激光安全指南。尽量减少激光暴露，以保护样本活性。
  5. Z轴层扫采集
    1. 获取跨度为30-50 µm、步长为2-4 µm的Z轴层扫图像（Z-stacks）图3B，C).
    2. 以 5-10 倍放大倍率拍摄图像 使用600的扫描速度，最小间隔 赫兹（Hz）图3B，D）。总成像时间可达12–16小时，具体取决于所监测的减数分裂阶段，并受限于光毒性以及卵母细胞对长时间成像的耐受性 体外 培养
  6. 顺序图像采集
    1. 在显微镜系统上，使用两个HyD探测器进行顺序扫描：H2B-RFP：561 nm激发 纳米；发射光收集范围为580-630纳米 纳米；SiR-微管蛋白 633 激发 nm；发射光收集范围为650-700 纳米（nm）图3E).
  7. 启动延时成像
    1. 在开始长期延时成像之前，应先拍摄测试图像以验证信号质量。荧光信号应分布均匀：H2B-RFP 应清晰标记染色质，SiR-微管蛋白应突出显示微管结构且背景信号不过强。通过短时间初步成像确认自动对焦稳定，并尽量减少光漂白。
    2. 点击开始延时成像 开始.
      注意：GVBD 标志着进入 M 期，通常发生在 60–90 分钟内 min IBMX 洗脱后（图 4A）。在此条件下，C57BL/6卵母细胞在约8-9小时排出第一极体 h post-GVBD（图4A）。时间可能因小鼠品系和培养条件而异。

5. 成像后处理

  1. 通过选择 文件 > 打开，在图像分析软件中打开成像文件，并从成像会话中选择 .lif 文件。
  2. 通过选择 处理 > 生成投影，对 H2B RFP 和 SiR-微管蛋白通道生成 Z 投影。将投影类型设置为最大强度投影。同时选择 RFP 和 SiR 微管蛋白通道，然后点击 运行。
    注意：请勿对 DIC 通道进行 Z 投影，因为这可能导致图像模糊。相反，应识别并选择最清晰对焦的单个 DIC 层面。将此清晰对焦的 DIC 图像与 H2B-RFP 和 SiR-微管蛋白通道的最大强度投影结合使用，以实现最佳可视化效果。
  3. 提取单个明场对焦层面。返回处理工具，选择 编辑 > 裁剪。选择 明场通道，使用 Z 轴滑块找到最佳对焦层面，然后点击 应用。
  4. 通过打开处理工具并选择 合并 > 添加通道，将投影图像与明场图像合并。添加 RFP 投影、SiR-微管蛋白投影以及单个明场图像。右键点击 合并后的图像集，然后点击 应用。
  5. 通过选择 文件 > 导出 > 图像，导出最终的合并图像。选择 TIFF 格式以获得高质量、无压缩的输出。
    注意：建议以 TIFF 格式导出，以便于后续分析和图表制作。

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结果

如图4A、B所示，本方案可实现对卵母细胞中染色体（H2B-RFP）和纺锤体微管（SiR-微管蛋白）的高质量活细胞成像，从而在整个减数分裂成熟过程中提供全面的时空信息。

H2B-RFP 通道中的 图4A 揭示了生发泡破裂（GVBD）后染色体运动的各个阶段，从初始排列开始图 4A，03:00 - 08:00）直至第一次减数分裂后期的分离（图4A，09:00 黄色箭头）直至染色体在减数第二次分裂中期排列完成（图 4A，13:30）。高分辨率图像使研究人员能够观察纺锤体微管重排和染色体精细定位等细微结构，有助于对减数分裂进程、纺锤体定位及极体排出的研究。

此外，本方案支持在活细胞条件下进行功能研究，以探究小...

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讨论

本文所述方案介绍了一种对小鼠卵母细胞进行显微注射和活细胞成像的可靠方法，可实现减数分裂过程中染色体动态的高时空分辨率可视化。该方法成功的关键在于从卵母细胞的收集、显微注射到成像的各个步骤中均需进行精细的操作。卵母细胞对环境波动极为敏感，温度、pH值或渗透压的任何偏离均可能损害其生理完整性和发育潜能3,4,5,16,17。因此，在长时间操作和成像过程中，维持最佳条件——例如持续在37 °C下孵育、使用预热培养基以及温度可控的显微镜载物台——对于保持卵母细胞的活力至关重要3,4。

本方案的一个关键优势在于将荧光标记物（H2B-RFP用于染色体，Si...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 Christopher Chen 教授捐赠基金、昆士兰大学医学院启动资金以及澳大利亚国家卫生与医学研究委员会项目资助（项目编号：APP1078134 和 APP1103689）支持，资助对象为 H.A.H.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-ml 注射器TerumoSS+01T Tuberculin用于精确注射PMSG。
琼脂糖凝胶Invitrogen16500500用于DNA和RNA凝胶电泳，按大小分离核酸，以验证H2B-RFP序列。
酒精灯LabTekLW15557-01用于灭菌和口吸管制备。
细菌培养基（LB肉汤）Sigma-AldrichL3022用于培养大肠杆菌（E. coli）及其他细菌的标准培养基。
细胞培养皿（35 × 10 mm 和 60 × 15 mm）Sigma-AldrichCLS430165, CLS430166用于卵母细胞培养；提供多种规格。
台式离心机Eppendorf5424R适用于小体积样品的紧凑型离心机，常用于科研实验室。
离心管（15-ml 和 50-ml）Corning352096, 352070较大容量离心管，常用于细胞和蛋白质处理。
氯仿Sigma-AldrichC2432分子生物学实验中常用的溶剂，尤其用于DNA/RNA提取。
CO₂培养箱Sanyo (型号: MCO-18AIC)设计用于维持受控CO₂环境，以支持卵母细胞培养。
一次性超细针头（27 G × 1/2”）Hanke Sass Wolf4710004012用于卵母细胞采集的精细针头。
DNase I（无RNase）Thermo Fisher ScientificEN0521用于去除RNA样品中污染性DNA的酶。
干式加热块Grant Instruments (型号: QBD4)用于在无需水浴条件下精确控温加热样品或反应。
乙醇（分子生物学级）Sigma-AldrichE7023用于DNA和RNA沉淀，以及灭菌操作。
精细解剖剪刀Met-App Scientific and Surgical Instruments2235用于小鼠卵母细胞的精细解剖。
精细镊子Met-App Scientific and Surgical Instruments2127用于小鼠卵母细胞的精细解剖。
凝胶电泳系统Bio-Rad1645050用于在凝胶中进行核酸或蛋白质电泳的系统。
硫酸庆大霉素Sigma-AldrichG1264用于防止细胞培养中细菌污染的抗生素。
巴斯德玻璃移液管（230 mm）VWR6121702用于卵母细胞口吸管制备的玻璃移液管 
IBMXSigma-AldrichI5879磷酸二酯酶抑制剂，用于防止生发泡破裂（GVBD）。
倒置显微镜Nikon专为从培养皿下方观察活细胞或生物体而设计的显微镜。
适用于小鼠胚胎培养的轻质矿物油Sigma-AldrichM5310用于覆盖培养中的卵母细胞，防止蒸发并维持温度。
氯化锂Sigma-AldrichL9650用于RNA沉淀方法。
活细胞成像系统LeicaLAS X采用先进显微技术设计的系统，用于活细胞的实时观察。
M16培养基（用于体外培养）Sigma-AldrichM7292专为小鼠卵母细胞、胚胎及其他体外应用设计的培养基。
微量离心管（0.6-ml 和 1.6-ml）Neptune3735.X, 3745.X小体积离心管，常用于分子生物学和生物化学实验。
无RNase微量离心管Eppendorf / Neptune022431081 (Eppendorf)用于RNA操作的无RNase管，防止RNA降解。
显微注射针头Sutter InstrumentsP-30 Pipette Puller用于向卵母细胞进行精确显微注射的针头。
显微注射系统Harvard ApparatusFemtoJet, PicoPump用于将cRNA高精度注射入小鼠卵母细胞的系统。
质粒小提试剂盒Qiagen27106 (QIAprep Spin Miniprep Kit)用于从细菌培养物中分离质粒DNA，适用于分子生物学应用。
口吸管组件Sigma-AldrichA5177用于卵母细胞吸取。
Pellet PaintMerck Millipore69049-3用于在离心过程中可视化沉淀物形成的试剂。
苯酚:氯仿:异戊醇Thermo Fisher Scientific15593031用于H2B-RFP提取过程中的相分离溶液。
编码H2B-RFP的质粒Addgene质粒 #20972 用于以红色荧光蛋白（RFP）标记染色体的质粒 
PMSGProspecHOR-272用于小鼠超数排卵 
蛋白酶KThermo Fisher ScientificEO0491用于消化蛋白质的酶，常用于DNA/RNA提取过程。
限制性内切酶NotINew England Biolabs (NEB)R3189S用于DNA克隆和分子生物学应用的限制性内切酶，用于线性化H2B-RFP质粒。 
RNase抑制剂（可选）New England Biolabs (NEB)M0314S用于防止RNA相关实验中RNA降解的酶。
无RNase手套VWR / Fisher Scientific根据尺寸不同而异经处理以防止RNase污染的手套，用于RNA操作实验。
无RNase移液器吸头Axygen / Thermo FisherT-300-R-S专为RNA相关应用设计的无RNase污染移液吸头。
无RNase水Thermo Fisher ScientificAM9932经纯化去除RNase酶的水，是RNA实验中防止降解的必需品。
SDS（10%）Sigma-AldrichL3771十二烷基硫酸钠，用于电泳及其他实验中蛋白质的变性。
SiR-微管蛋白SpirochromeSC002一种特异性结合微管蛋白的荧光染料，用于活细胞中纺锤体的成像。
乙酸钠（3 M）Sigma-AldrichS7899用作缓冲液及在分子生物学操作中用于DNA沉淀。
分光光度计Thermo Fisher (NanoDrop)ND-ONE-W通过测量吸光度来定量核酸、蛋白质及其他物质的仪器。
体视显微镜Leica Microsystems  M165C用于在低倍率下三维观察样本的显微镜，适用于解剖操作。
注射器滤器单元（0.22-µm）MerckSLGP033RS用于液体的无菌过滤，尤其适用于微生物学和分子生物学应用。
注射器与针头组件TerumoSS+01T Tuberculin Syringes用于精确递送PMSG。
T7 mMESSAGE mMACHINE 试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1344用于从T7启动子体外转录RNA，以制备H2B-RFP cRNA的试剂盒。
水浴/加热块Grant InstrumentsQBD4用于需要加热的实验中维持精确温度。

参考文献

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