使用荧光脂肪酸类似物定量内皮脂肪酸摄取

摘要

该协议详细介绍了一种 体外 测定，用于测量长链和极长链饱和脂肪酸的BODIPY-C₁₂ 和BODIPY-C₁₆ 荧光类似物刺激后内皮细胞中的细胞脂质摄取。该方法高效且适用于其他细胞类型，为研究脂质代谢提供了有用的方法。

摘要

内皮细胞 （EC） 在调节脂肪酸 （FA） 从血液转运到代谢组织方面发挥着核心作用，但以可靠、可扩展的方式量化 EC FA 摄取的工具仍然有限。在这里，我们提出了一种快速、定量且具有成本效益的测定方法，以使用荧光 FA 类似物（BODIPY-C₁₂ 和 BODIPY-C₁₆）测量 EC 中的 FA 摄取，从而允许研究 96 孔板格式中的链长特异性摄取动力学。该方案包含阳性（3-羟基异丁酸，乳酸）和阴性（氯硝柳胺）对照，并在原代（HUVEC）和永生化（EA.hy926）EC系中得到验证。该测定检测时间和剂量依赖性的 FA 摄取，使用 Hoechst 核染色将结果归一化为细胞数量，并使用适当的对照对背景进行校正。它可以适应多种细胞类型、成像方式和实验条件，包括活细胞成像和脉冲追逐格式。与传统的脂质染色或放射性标记示踪剂相比，该方法提供了更高的安全性、速度和多功能性，同时捕获活细胞中的动态 FA 摄取。该测定为研究内皮脂质转运的调节及其对代谢疾病的贡献提供了一个强大的平台。

引言

为了使血源性营养物质（如脂质）进入代谢组织（如骨骼肌），它们必须首先穿过构成毛细血管壁的内皮细胞 （EC） 屏障。虽然长期以来人们认为脂肪酸 （FA） 只是扩散穿过该屏障到达底层组织，但新出现的证据表明，EC 通过进化为在细胞外和细胞内水性世界中移动疏水分子的特殊运输机制来主动调节这一过程¹。

在血液中，FA要么以白蛋白结合游离脂肪酸（FFA）的形式存在，要么包装在富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）中，例如乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）²。在EC的管腔表面，脂蛋白脂肪酶（LPL）水解TRL以释放FFA以供摄取。多种蛋白质参与 FA 转运，包括 CD36，它将 FA 实际摄取到细胞中;介导载体转运的脂肪酸转运蛋白 （FATP） 和酰基辅酶 A 合成酶 （ACSL）;脂肪结合蛋白 （FABP），充当亲脂性伴侣，以及无数其他蛋白，其中一些尚未被发现和分类 ^2,3。底层组织也使用类似的机制来吸收运输的脂肪，尽管存在的特定亚型通常因细胞类型而异。

最近的研究表明，EC通过旁分泌信号传导与邻近细胞协调，调节FA转运到靶组织中。例如，骨骼肌细胞分泌一系列旁分泌因子，如 3-羟基异丁酸 （3-HIB）、血管内皮生长因子 B （VEGFB） 和 apelin，以促进附近内皮细胞 ^4,5,6 的 FA 转运。有趣的是，内分泌系统也可能参与其中，例如胰岛素刺激脂肪细胞释放乳酸，这也刺激 EC 吸收 FA⁷。

因此，EC 充当脂肪的调节看门人，表明它们在心血管疾病或 2 型糖尿病等脂质代谢紊乱中发挥着关键作用。最近的证据表明，EC本身会积累脂滴（LD）以响应脂肪超负荷，可能充当调节脂肪酸递送至底^层组织的缓冲液^8,9。在高脂肪消耗的情况下，就像现代饮食一样，这些 LD 的过度积累可能会导致血管功能障碍和疾病，包括高血压¹⁰。总而言之，更好地了解 EC 如何吸收和运输 FA 可能会为我们提供解决脂源性疾病的新治疗方法。

在这项研究中，我们描述了一种简单、快速且具有成本效益的测定方法，用于使用荧光长链 FA 类似物 BODIPY-C₁₂ 和 BODIPY-C₁₆ 测量内皮 FA 摄取。这些试剂相当便宜且非常安全，特别是与放射性或重同位素标记的FA相比，后者传统上用于测量细胞脂肪摄取^11,12。值得注意的是，这些试剂与未偶联的“游离”BODIPY染料不同，后者被动地积累在细胞的疏水区域，主要是在LD^中13。相反，将 BODIPY 与脂肪族 FA 链（例如 C₁₂ 或 C₁₆）偶联会产生一种在结构上模拟天然长链 FA 的分子。这种修饰允许对细胞中的动态脂肪酸摄取进行特定测量，而不是反映细胞内脂质储存或液滴形成。

这种方法的一个关键优势是它的灵活性。研究人员可以使用其他细胞类型、可变孵育时间和一系列 BODIPY 偶联的 FA 类似物来研究链长依赖性摄取，甚至是顺式双边脂肪酸等天然荧光脂质¹⁴。总体而言，该协议将为研究人员提供一种在多种条件下测试细胞FA摄取的简单方法，并为回答脂质代谢，内皮生物学和代谢疾病的基本问题铺平道路（图1）。

方案

本研究中使用的所有人源性内皮细胞 （HUVEC） 均根据人类生物材料伦理使用的机构和供应商指南从市售的、去识别化的来源获得。在层流罩下的无菌环境中执行所有步骤。有关所有试剂和设备的列表，请参阅 材料表 。

1、96孔板明胶包衣

1. 通过在 500 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 25 mL 2% 明胶原液来制备 0.1% 明胶溶液。
2. 彻底混合并使用 0.2 μm 真空过滤器（或高压灭菌器）进行过滤灭菌。
3. 将每孔 100 μL 0.1% 明胶加入黑色、透明底的 96 孔板中。
4. 在 37°C 下孵育至少 30 分钟或最好过夜。

2. 细胞接种

1. 在完全培养基中制备EC的单细胞悬浮液。
   1. 通过用 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素（两者 v/v）补充适当的基础培养基来制备完整的培养基。
      注意：基础培养基会根据具体的细胞类型而有所不同;本研究分别将内皮生长培养基（EGM-2）和Dulbecco's改良的Eagle's Medium（DMEM）用于HUVECs和EA.hy926细胞。
2. 将 100 μL 细胞悬液移液到每个孔中，接种密度使细胞在第二天达到汇合。

3、处理试剂制备及应用

1. 在二价PBS（含有Ca²⁺ 和Mg²⁺）中制备所有试剂，并预热至37°C。
   1. 制备3-HIB（阳性对照）作为20mM工作溶液。将储备液溶解在1 M的双蒸水中，并储存在4°C。
   2. 制备乳酸（阳性对照）作为 20 mM 工作溶液。将储备液溶解在1 M的双蒸水中，并储存在4°C。
   3. 制备终浓度为1μM的氯硝柳胺（阴性对照）。将储备溶液溶解在DMSO中，浓度为10mM。等分成较小的体积以避免冻融循环，并在 -20 °C 下储存。
2. 用预热的二价PBS洗涤细胞一次。
3. 每孔加入50μL适当的处理试剂（3-HIB，乳酸或氯硝柳胺），并在37°C下孵育30分钟（对于氯硝柳胺）或60分钟（对于3-HIB和乳酸）。

4. BODYPY-FA：BSA复合物的制备和应用

1. 使用 2：1 FA：BSA 摩尔比，在 PBS 中制备终浓度为 0.5 μM、1 μM 或 2 μM 的 BODIPY-FA：BSA 复合物。对于 2 μM BODIPY-FA 溶液，在 PBS 中与 1 μM 不含 FA 的 BSA 一起孵育。对于 1 μM BODIPY-FA，使用 0.5 μM BSA，依此类推。在孵化过程中始终保护复合物免受光照。
2. 使用前将混合物在室温下孵育10分钟。
3. 将 50 μL 复合物添加到处理过的孔中。
   注意：仅使用中间的 10 列以避免边缘效应。将外部色谱柱保留为自发荧光对照，仅向这些孔添加 PBS。
4. 将板在 37°C 下孵育 1 分钟、5 分钟或 10 分钟。

5.荧光猝灭和细胞内信号检测

1. 在PBS中制备1μM无FA的BSA作为洗涤缓冲液，并预热至37°C。
2. 去除 BODIPY-FA：BSA 并用 50 μL 预热的 1 μM 无 FA BSA 在 PBS 中洗涤整个板两次。每次洗涤 1.5 分钟。
3. 加入 50 μL 0.08% 台盼蓝以猝灭细胞外荧光。
4. 立即使用具有以下设置的酶标仪测量细胞内荧光：激发：488 nm，发射：515 nm，截止：495 nm，模式：底部读数。
   注意：使用包含在步骤 4 中未用 BODIPY-FA 处理的细胞的外柱孔减去自发荧光背景。

6. 用于细胞正常化的 Hoechst 核染色

1. 取出台盼蓝溶液并用PBS轻轻洗涤。
   注意：细胞可能有些脆弱，容易脱落。洗涤时要小心。
2. 在 10% 培养基中加入 4 μg/mL Hoechst，并在 37°C 下孵育 30 分钟。
   注意：Hoechst 孵育时间可能需要优化。根据细胞类型，可能需要 5 分钟到 60 分钟才能实现均匀的核标记和足够的信号强度。不要将 Hoechst 添加到外列。
3. 用PBS清洗板一次。
4. 添加新鲜的PBS并使用以下设置测量Hoechst荧光：激发：350 nm，发射：461 nm，截止：455 nm，模式：底部读数。
   注意：使用外柱孔减去 Hoechst 自发荧光背景。
5. 通过将步骤 5.3 中的自发荧光校正值除以步骤 6.4 中获得的相应 Hoechst 值，将 BODIPY-FA 荧光归一化为细胞数。对 BODIPY 和 Hoechst 信号使用背景校正值。
   注意：最终值表示归一化为细胞数的 BODIPY-FA 摄取，在 BODIPY 和 Hoechst 通道中针对自发荧光进行了校正。

7. 统计分析

1. 使用双向方差分析对 图 2 进行统计分析，以评估时间、浓度及其相互作用的影响。应用 Tukey 的事后检验进行多重比较。
2. 对于 图 3 和 图 4，在比较两个条件时使用学生的未配对双尾 t 检验。对于涉及三个或更多条件的实验，使用单因素方差分析，然后使用邓内特检验进行多重比较。

结果

如 图 1 所示，该测定使用 96 孔板格式，其中 EC 直接接种到孔中。BODIPY标记的FA与牛血清白蛋白（BSA）偶联，并应用于实验孔和对照孔。在 FA 治疗之前，可以通过药物治疗或遗传扰动（例如 siRNA 转染或 CRISPR 基因编辑）来纵 EC。至关重要的是，此类作还允许包含适当的阳性和阴性对照，以确保测定的可靠性。

在HUVEC和EA.hy926细胞中将BODIPY-C₁₂在0.5μM，1μM和2μM下孵育1分钟，5分钟和10分钟后，观察到细胞内BODIPY-C₁₂信号的明显剂量和时间依赖性增加（图2）。为了解释每孔细胞数量的潜在变化，将 BODIPY-C₁₂ 值归一化为 Hoechst 核染色并荧光测量。使用无 BODIPY 和无 Hoechst 对照孔校正背景自发荧光。

为了验证测定的重现性和范围，使用 BODIPY-C₁₂ 在 EA.hy926 EC 中测试了已知的脂肪酸代谢调节剂（图 3）。用增加浓度的乳酸（0 mM、5 mM、20 mM）或 3-HIB（0 mM、5 mM、20 mM）进行 1 小时处理，以剂量依赖性方式增强 BODIPY-C₁₂ 的摄取，证实它们作为 FA 摄取的正调节因子的作用。相反，先前已经证明化学氯硝柳胺可以通过线粒体解偶联 抑制 脂肪酸摄取¹⁵。事实上，这里也重现了类似的结果，因为用氯硝柳胺（1μM）处理30分钟相对于载体对照显着降低了BODIPY-C₁₂ 信号，验证了其作为阴性对照的效用。虽然这些数据被归一化为 Hoechst 以解释细胞数量的任何差异，但这些处理都没有改变细胞活力或 Hoechst 荧光值。

为了评估该测定对不同脂肪酸类似物的适应性，将可被视为超长链脂肪酸的代理的 BODIPY-C₁₆ 给予 HUVEC，并在孵育 5 分钟后测量其摄取（图 4）。观察到乳酸处理（0 mM、10 mM、20 mM）以剂量依赖性方式增加 BODIPY-C₁₆ 信号，而氯硝柳胺 （1 μM） 降低信号，与 BODIPY-C₁₂ 观察到的结果相同。

总而言之，该测定能够对原代 （HUVEC） 和永生化 （EA.hy926） EC 中的 FA 摄取进行稳健且可重复的定量。此外，这些发现证明了该测定在不同链长的 FA 中的多功能性，并展示了阳性和阴性对照的有效性。

图 1：使用 BODIPY 标记的脂肪酸进行脂肪酸摄取测定的示意图。 将内皮细胞接种到黑色、透明底部的 96 孔板中，并与 BODIPY 偶联脂肪酸 （FA） 类似物孵育，以实现细胞内摄取。孵育后，用台盼蓝淬灭细胞外荧光，并使用底部读数荧光酶标仪测量细胞内信号。荧光测量后应用Hoechst核染色剂来量化细胞数量以进行归一化。可以在 BODIPY-FA 孵育之前应用药物治疗或遗传扰动。 请点击此处查看此图的大图。

图2：原代和永生化内皮细胞中BODIPY-C₁₂摄取的定量。 （A）在0.5μM，1μM和2μM BODIPY-C₁₂复合成0.25μM，0.5μM和1μM无FABSA中孵育1分钟，5分钟和10分钟后，HUVEC中BODIPY-C₁₂摄取的时间和浓度依赖性增加。（B）EA.hy926细胞在相同条件下表现出相似的时间和剂量依赖性BODIPY-C₁₂摄取。将平均荧光强度归一化为 Hoechst 染色的细胞核（细胞数）和无 BODIPY 对照。数据显示为平均值±标准差。使用双因素方差分析进行统计分析以评估时间、浓度及其相互作用的影响，然后进行 Tukey 的事后检验进行多重比较。在时间 （p < 0.0001）、浓度 （p < 0.0001） 及其相互作用 （p = 0.0443） 方面观察到显着的主效应。Tukey 检验确定的具有统计学意义的成对比较在条形图上如下所示：*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。

图3：在EA.hy926中使用阳性和阴性对照的测定验证。 （A）1小时乳酸处理（0mM，5mM，20mM）以剂量依赖性方式增加BODIPY-C₁₂ 的摄取。（B）1-h 3-HIB处理（0 mM、5 mM、20 mM）同样增加了FA摄取。（C）相对于载体对照（DMSO），30分钟氯硝柳胺处理（1μM）显着抑制了BODIPY-C₁₂ 的摄取。将平均荧光强度归一化为 Hoechst 染色的细胞核（细胞数）和无 BODIPY 对照。数据显示为平均值±标准差。将 2 μM BODIPY-C₁₂ （与 1 μM 无脂肪酸 BSA 络合）孵育 5 分钟，用于所有实验。（A） 和 （B） 的统计量使用单因素方差分析和 Dunnett 检验进行多重比较，C 的统计量使用 Student 的无配对双尾 T 检验确定。p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：在 HUVEC 中使用 BODIPY-C₁₆ 进行测定验证。 （A）乳酸处理（0 mM、10 mM、20 mM持续1小时）以剂量依赖性方式增强BODIPY-C₁₆ 的摄取。（B）与载体处理的对照相比，氯硝柳胺处理（1μM持续1小时）显着降低了BODIPY-C₁₆ 信号。将平均荧光强度归一化为 Hoechst 染色的细胞核（细胞数）和无 BODIPY 对照。数据显示为平均值±标准差。将 2 μM BODIPY-C₁₆ （络合至 1 μM 无脂肪酸 BSA）孵育 5 分钟，用于所有实验。（A） 的统计量使用单因素方差分析和 Dunnett 检验进行多重比较确定，B 的统计量使用 Student 的无配对双尾 T 检验确定。*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

该测定提供了一种快速、定量且经济高效的方法，用于使用 96 孔板格式和荧光长链 FA 类似物测量 EC 中的 FA 摄取。通过结合阳性和阴性对照并跨原代 （HUVEC） 和永生化 （EA.hy926） EC 进行验证，该协议展示了稳健性、可重复性和广泛的适用性。

如前所述，基于荧光的分析有助于揭示内皮脂质转运的旁分泌调节因子 ^4,5,7。这些例子突出了标准化系统如何在受控的体外环境中继续可靠地阐明代谢物驱动的脂质转运调节。此处描述的方案建立了可靠的FA摄取测量的关键参数，包括使用多种浓度（0.5-2μM）和孵育时间（1分钟，5分钟和10分钟）的BODIPY-C₁₂和BODIPY-C₁₆。此外，还有效检测到对3-HIB和乳酸的反应摄取增加，以及氯硝柳胺治疗后摄取减少，证实了其灵敏度和动态范围。虽然这里针对 EC 进行了优化，但该测定可以很容易地适应其他细胞类型，例如脂肪细胞、肌管或肝细胞，并调整 BODIPY：BSA 比率和治疗条件。它还可以使用兼容板进行修改以进行活细胞成像，或改编为脉冲追踪格式以评估细胞内 FA 保留、代谢或外排。

与其他方法相比，这种方法具有明显的优势：可扩展、定量且适应各种 FA 链长度。此外，它具有成本效益，仅涉及少数步骤，并且需要的仪器不比普通酶标仪复杂，使包括学生在内的新用户能够快速掌握该协议。最后，与基于定性显微镜的方法或反映累积脂质含量的油红 O 等终点染色不同，该协议无需固定或裂解即可捕获实时 FA 摄取。

尽管如此，还是要注意一些局限性。使用2D静态培养系统并不能完全概括血管环境的生理复杂性。该简化模型中不存在剪切应力或LPL介导的脂肪分解以及内皮-实质相互作用等关键因素。先进的系统，例如微流体或基于类器官的3D共培养物，可以更好地模拟体内结构和信号传导，尽管它们确实需要更多的技术专长和基础设施^16,17。例如，微流体生物反应器提供了一个环境，EC可以模拟微血管系统形成并与其他组织类型相互作用，使研究人员能够在更生理的环境中模拟旁分泌动力学¹⁸。此外，最近的研究表明，可以开发专门的系统来在3D水凝胶培养物中进行实时荧光成像19。这些进步使人们相信这种测定有朝一日可以适用于更具生理代表性的细胞培养系统，但需要进行优化。

总之，该检测代表了一个灵活、可访问且可重复的平台，用于研究不同条件下的细胞 FA 摄取。虽然最适合机制 体外 研究，但从该系统中获得的见解可能会为未来使用更具生理相关性的内皮脂质转运模型的工作提供信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-羟异丁酸盐（3-HIB）	开曼化工	26105	正对照，最终浓度为5或20毫米
96孔黑底透明聚苯乙烯微板	西格玛-奥尔德里奇	CLS3603-48EA	用于电镀细胞的检测
博迪皮FL C12（博迪皮-FA）	赛莫飞世尔科学	D3822	绿色荧光长链脂肪酸
博迪皮FL C16（博迪皮-FA）	赛莫飞世尔科学	D3821	绿色荧光，非常长链脂肪酸
牛血清白蛋白溶液	西格玛-奥尔德里奇	A9205-50ML	用于制备 Bodipy：BSA 复合物
二甲基亚硫酸盐（DMSO）	西格玛-奥尔德里奇	D2650	药品股票的溶剂
一次性输液槽	VWR	89094-680	包含将要移液到细胞上的各种溶液
杜尔贝科改良型鹰中等	康宁生命科学	10-013-CV	EA.hy926 单元的介质
EA.hy926 细胞	空军交通管制委员会	CRL-2922	永生化内皮细胞杂交系
EGM-2内皮细胞生长培养基-2 BulletKit	隆扎	CC-3162	HUVEC的媒体
胎儿牛血清（FBS）及nbsp;	VWR	97068-085	EGM-2和DMEM中10%补充剂
荧光微板读机	各种	无	任何能够进行荧光测量的微板读片机
明胶溶液	西格玛-奥尔德里奇	G1393-100ml	用于0.1%工作浓度的镀层
Hoechst 33342 解决方案	生命科学	62249	细胞归一化的核染色（4 & μ;M)
人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）	隆扎	C2519A	人类初级内皮细胞
多通道移液器	VWR	76627-768	用于移液到96孔板
尼氯酰胺	米利波尔西格玛	N3510-50G	负对照组，1 & μ;M 最终集中
PBS，含钙和镁	费舍尔科学	21031CV	用于处理处理和洗涤缓冲（配合BSA）
PBS，不含钙和镁	杰尼西科学	25-508	用于明胶稀释、霍赫斯特染色和一般洗涤
青霉素/链霉素	赛莫飞世尔科学	15140122	EGM-2和DMEM中的1%补充剂
L-乳酸钠	西格玛-奥尔德里奇	L7022-5G	正对照，最终浓度为5或20毫米
特里潘蓝溶液	西格玛-奥尔德里奇	T8154-20ML	0.08%用于消灭细胞外荧光
真空过滤系统，500ml PES膜，0.45及微量;m	GenClone	25-227	灭菌明胶溶液