用户友好且强大的大规模数据集 R 分析

随着科学领域大型数据集可用性的增加，开发用户友好的工具非常重要，使研究人员能够准确轻松地快速分析这些大型数据集。一种常见的大型数据集来自使用荧光素酶基因作为报告基因，这使得对活细胞和生物体中的基因表达进行简单、连续和无创的检查。发光记录的自动化改变了荧光素酶发光的测量，并导致数据收集的扩展，特别是在生物^钟领域1,2。使用 96 孔微孔板和带堆叠器的自动酶标仪，可以在一次实验中按时间序列单独检测数千个表达荧光素酶基因的样品，有时以一小时为间隔，持续数天。这种高通量实验产生了大型数据集，这是使用手工样本采集和 RNA 处理的传统基因表达实验无法实现的。及时分析如此庞大的数据集很重要，但也可能具有挑战性。

尽管存在大量工具来分析节律性数据，但许多工具分析基于动物行为的测定，而不是发光报告基因表达^3,4,5,6,7（补充表S1）。有些工具要求研究人员具备计算机编程技能，例如 Python 技能或访问 MATLAB。其他工具需要购买软件，这可能很昂贵。一些免费的可行解决方案可在线获得。BioDare2⁸ 就是这样的工具之一，它提供了多种不同的方法来分析节律性数据。BioDare2 是一个用户友好的在线工具，需要最少的计算专业知识。用户需要在线上传输入的数据，并从在线界面下载数据输出以进行进一步处理。

在这里，我们展示了用户友好的 R 脚本，具有多种功能，可以轻松分析大规模数据集。我们使用免费的开源软件 RStudio⁹（R 和 Python 接口）来运行脚本。RStudio 可用于各种计算机系统，包括 Windows、Mac 和 Linux。在本报告中，提供了详细的分步说明来指导用户如何使用 R 脚本，特别是在协议第 1 节和第 2 节中。此方法需要用户最少的输入。没有 R 知识且没有编程经验的初学者应能够使用该方法分析来自荧光素酶测定的大型数据集或其他类型的具有时间序列数据的数据集。所有输入和输出数据都存储在本地计算机上，因此，一旦首次下载所有相关的 R 包，就可以在任何地方进行分析，而不受互联网访问的限制。输出数据被分类到组织良好的文件夹中，结果可以处理以供发布。统计分析也作为输出的一部分包含在内，以便快速评估样本之间的差异。因此，R方法可以为研究人员分析大型数据集提供一种简单而强大的解决方案。

1. 基于荧光素酶的生物钟分析

1. 荧光素酶测定的实验设置
   注意：荧光素酶测定是用于实时测量生物钟活动的常用方法。活转基因生物和/或细胞携带的荧光素酶报告基因发出的发光可以自动记录，从而产生大规模的时间序列数据集。我们实验室主要使用表达荧光素酶基因的拟南芥幼苗作为报告基因。图 1 和图 2 显示了我们实验室中 96 孔格式的幼苗荧光素酶测定的典型实验设置的流程图，并根据之前的描述² 进行了修改。
   1. 用将 3 mL 36% （w/w） HCl 添加到烧杯中的 100 mL 室内漂白剂中产生的漂白剂蒸气对种子进行灭菌。将烧杯放入带密封盖的钟形罐中，放入化学通风橱中。灭菌后，使用无菌玻璃巴斯德移液器将种子接种在含有0.5%蔗糖和0.8%琼脂（pH 5.7）的1/2MS板上，在层流柜中。将化学废物收集在带盖的罐子中，并与机构环境卫生服务部门合作进行处理。
   2. 将板置于4°C中2天，然后将它们移至具有12小时光照和12小时暗光循环（LD）的组织培养室中。
   3. 让幼苗在LD中生长4天。
   4. 将幼苗转移到 96 孔板中;每个孔含有 180 μL 测定培养基（1/2MS、0.5% 蔗糖、0.4% 琼脂、0.25 mM 荧光素）。将板在LD中放置1天，然后在24小时恒光（LL）中放置1天。
   5. 向孔中添加处理或模拟溶液，并在LL中以1小时间隔记录发光5-7天。将发射滤光片镜头设置为3,600以获得增益，将测量间隔时间设置为1秒。
      注意： 录制的开始时间可以是任何时间。但是，由于 R 脚本只接受整数（整数），因此记录间隔必须是整数。例如，允许 1 小时的间隔，但 R 脚本不允许 15 分钟的间隔。
   6. 记录结束时，拍下盘子的照片，记录幼苗的生长情况。
   7. 将原始数据保存为 CSV 文件以进行 R 分析，使用另存为功能以及酶标仪的数据分析软件。
2. 基于荧光素酶的昼夜节律数据的 R 分析的逐步解释
   注意：此 R 分析使用 R 脚本补充文件 1（LUC_2025.R），为昼夜节律数据分析而开发，以及输入文件补充文件 2（NO7.csv）. R 脚本以及输入文件可通过在线存储库平台 Github （https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis） 公开获取。
   1. 下载与计算机系统兼容的 RStudio 软件 ^9,10。
   2. 下载补充文件 1 （LUC_2025.R） 所需的 RStudio 算法包：MetaCycle¹¹：MetaCycle 包的 ARSER 算法¹²、ggplot2¹³、dplyr¹⁴、magrittr¹⁵、stringr¹⁶、filesstrings¹⁷、circular¹⁸、AICcmodavg¹⁹ 和 broom²⁰。
      注意：另请参阅 R 脚本的顶部以获取包列表。
   3. 更改用户输入I（根据本地计算机上的特定数据集，包括工作目录，输入文件的名称，处理的标签以及测定的相对开始时间。
      注意：步骤 1.2.1 和 1.2.2 只需完成一次;之后，RStudio 界面控制台就可以接受用户输入，并对每个新分析进行修改。用户输入部分有两个部分（补充图 S1）。
      1. 选择工作目录。指示输入文件所在的位置。同一文件夹将是输出文件的位置。
      2. 选择输入文件，即针对 R 脚本格式正确的 CSV 文件（图 2B）。具体来说，顶行包含时间序列，第一列包含 96 孔板上的各个样品位置。
         注意：此类输入 CSV 文件的示例可以在补充文件 2 （NO7.csv） 中找到。
      3. 命名样品和/或处理。由于此分析用于从具有时间过程的 96 孔设置中获得的数据，因此将实验设计为每次处理 8 次重复，每个板总共最多 12 次处理，或每次处理 12 次重复，每个板总共最多 8 次处理。请务必输入正确的样本数量，8 或 12，因为样本数量很重要;如果样本计数不是 8 或 12，则代码将不会运行。但是，如果有一排空孔，只需在处理名称的空格中列出它们，例如，命名为空 1、空 2...
         注意：对于示例名称，应避免使用反斜杠或类似符号，因为它们可能会导致文件名问题。此外，在用户输入 II 中选择使用方差分析时，还应避免使用“NA”作为标签。任何完全相同的治疗都将合并为一个大治疗组。
      4. 指示测定的相对开始时间。对于给定的 24 小时，主观黎明是指在正常的明/暗循环期间打开腔室灯。例如，如果早上 7 点灯亮，则考虑此时的昼夜节律时间 0。如果荧光素酶测定在上午 9 点开始，则测定时间为昼夜节律时间 2;输入 2 作为相对开始时间。
         注意：相对开始时间必须是整数，不能为负数。这将影响样品的相位读数。
   4. 根据特定需求更改用户输入 II 选项。
      注意：以下说明提供了“用户输入”部分的更详细说明以及进行更改的分步指南。
      1. 包括图表：发光曲线、每个基因型和处理的周期、相和振幅图。
      2. 将方差分析检验与 Tukey HSD 结合使用，以比较治疗的周期、阶段和幅度。为方差分析检验输出选择一个控件;指定方差分析检验的对照，或将该选项留空以将每个处理用作成对比较中的对照。或者，选择是否对方差分析输出文件进行编号，以便更快地参考和组织。
      3. 使用 t 检验比较治疗的周期、阶段和幅度。选择 t 检验是否应为成对比较;如果选择成对 t 检验，则选择数据是否配对。选择 t 检验的对照;指定 t 检验的对照，或将该选项留空以将每个处理用作对照。选择是否对 t 检验输出文件进行编号，以便更快地参考和组织。
         注意：这只能用于同时比较两种处理，例如添加SA或Mock的相同基因型的两个品系。显示的 p 值未进行调整以考虑与同一线的多重比较。
      4. 选择是否对时间点进行舍入。如果时间点仅相差一两分钟，请四舍五入到最接近的小时并使用此分析。
         注意：此代码使用 ARS 方法¹² 计算周期、相位和幅度。此方法需要以小时为单位的一致时间序列才能运行。
      5. 根据读板器记录孔的方式，更改输入的读取方式。选择按 A1、A2、A3 列出的孔的标准数据列表......或 A1、B1、C1 列出的井的那个......
   5. 只需单击控制台右上角的“源”按钮即可运行分析。
      注意：分析只需不到 1 分钟即可完成。R 分析的输出将自动显示在与输入数据集相同的文件夹中。
   6. 查看输出：输出文件夹有多个文档和子文件夹，可提供全面的分析，包括每种基因型和/或处理的重复的平均周期、相位和振幅的统计信息。
      注意：对于输入文件补充文件2（NO7.csv），表1描述了协议部分1中的补充文件1（LUC_2025.R）脚本生成的输出文档列表，并且可以方便地使用补充图S2中的树结构查看。

2. 基于鲁米诺的 ROS 测定

1. ROS测定的实验设置
   1. 用活检打孔器从25日龄植物的第四片到第七片上切下直径4毫米的叶盘。
   2. 将叶盘的毛面朝上漂浮在 96 孔板中的 100 μL 无菌水上。
   3. 用干净的锡纸盖住板，并将其放入 LD 生长室中过夜。
   4. 用 100 μL 鲁米醇溶液（300 μM 在 pH 7.4 的 10 mM MOPS 缓冲液中，以及 1 μM flg22 或其他诱发剂）代替水。使用模拟溶液代替 flg22 作为对照。
   5. 立即开始每分钟记录一次发光读数，持续 40-60 分钟。
2. ROS数据R分析的逐步解释
   注意：此 R 分析使用 Rstudio、R 脚本、 补充文件 3 （ROS_2025.R） 和输入文件补充文件 4 （ROS_flg22.csv） 或补充文件 5 （ROS_elf26.csv）。R 脚本以及输入文件补充文件 4 （ROS_flg22.csv） 可通过在线存储库平台 Github （https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis） 公开获取
   1. 下载 RStudio 软件包：gplot2¹³、dplyr¹⁴、magrittr¹⁵、stringr¹⁶ 和 filesstrings¹⁷。
      注意：步骤 2.2.1 只需完成一次。为了帮助用户根据计算机上的特定数据集定制每个分析，创建了一个名为“用户输入”的部分，以允许用户为其实验指示特定参数（补充图S3）。
   2. 根据本地计算机上的特定数据集更改用户输入I，包括工作目录，输入文件的名称，处理的标签以及测定的相对开始时间。
      1. 选择工作目录。指示输入文件所在的位置。同一文件夹将是输出文件的位置。
      2. 选择输入文件，即针对 R 脚本格式正确的 CSV 文件（图 2B）。具体来说，顶行包含时间序列，第一列包含 96 孔板上的各个样品位置。
         注意：此类输入 CSV 文件的示例可以在补充材料、补充文件 4 （ROS_flg22.csv） 或补充文件 5 （ROS_elf26.csv） 中找到。
      3. 命名样品和/或处理。由于此分析用于从具有时间过程的 96 孔设置中获得的数据，因此将实验设计为每次处理 8 次重复，每个板总共最多 12 次处理，或每次处理 12 次重复，每个板总共最多 8 次处理。如果有一排空孔，只需在处理名称的空格中列出它们，例如，命名为空 1、空 2...
         注意：输入正确的样本数量（8 或 12）非常重要，因为样本数量很重要。如果样本计数不是 8 或 12，则代码将不会运行。对于示例名称，请避免使用反斜杠或类似符号，因为它们可能会导致文件名问题。在用户输入 II 中选择使用方差分析时，还要避免使用“NA”作为标签。与补充文件 1 （LUC_2025.R） 脚本不同，在此补充文件 3 （ROS_2025.R） 脚本中，具有相同名称的处理不会合并为单个组。
   3. 根据用户的特定需求更改用户输入 II 选项。
      注意：示例用户输入可以在补充图 S3 中看到。
      1. 将方差分析检验与 Tukey HSD 一起使用来比较处理发光总和。
      2. 使用双侧 t 检验一次比较两种治疗的数据。
         注意：显示的 p 值未调整以考虑与同一条线的多次比较。
      3. 绘制荧光曲线和条形图，比较荧光总和。将平均值的标准差或标准误差添加到图形中。
      4. 根据读板器记录孔的方式，更改输入的读取方式。要么使用按A1、A2、A3...或 A1、B1、C1 列出的井的那个......
3. 只需单击控制台右上角的“源”按钮即可运行分析。
   注意：分析只需不到 1 分钟即可完成。R 分析的输出将自动显示在与输入数据集相同的文件夹中。
4. 查看输出：输出文件夹有多个文档和子文件夹，以提供全面的分析。
   注意：对于输入文件补充文件4（ROS_flg22.csv），由协议节2中描述的补充文件3（ROS_2025.R）脚本生成的输出文档的树结构如补充图S4所示。

案例研究 1.拟南芥幼苗生物钟活动的发光测定

我们之前表明，在野生型GRP7启动子（pGRP7wt：LUC）的控制下，使用表达荧光素酶报告基因的转基因Col-0植物，富含甘氨酸的RNA结合蛋白7（GRP7）基因由主时钟蛋白CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1（CCA1）控制，GRP7的昼夜节律表达对其在植物防御中的作用很重要21.我们使用名为 LUC_2025.R 的 R 脚本（协议第 1 节中的补充文件 1）分析了这些转基因植物以及对照植物 CCA1：LUC/Col-0 的生物钟活动。

名为NO7.csv（补充文件2）的输入文件具有七个独立的pGRP7wt：LUC线和CCA1：LUC / Col-0对照（补充文件2（NO7.csv））的发光读数。运行脚本后，将在与输入文件NO7.csv（补充文件 2 （NO7.csv））相同的文件夹下生成名为 NO7 output 的输出子文件夹。NO7输出文件夹的文件如表1所述，可以方便地使用补充图S2中的树结构查看。对NO7输出文件夹中的值进行进一步处理，形成图3和图4。图3显示，CCA1：LUC报告基因显示振幅为3,000 RLU，周期为23.5 h，相位为3.5 h。这些时钟参数与之前的报告基本一致22,23。在pGRP7wt：Luc品系中观察到不同的表达模式。虽然所有pGRP7wt：LUC系在周期和阶段上似乎相似，但这些系的振幅值存在差异，这可能是由于转基因在染色体中的位置效应。当通过R脚本计算周期、幅度和相位参数时，这些观察结果得到了进一步证实（图4）。为了验证这一分析，使用BioDare2重新分析了同一数据集，BioDare2是一个用于昼夜节律数据分析的免费在线平台8。R 分析的结果与 BioDare2 FFT-NLLS （NLLS） 算法 8,24 获得的结果相当（图 4）。

案例研究 2.哺乳动物细胞生物钟活动的发光测定
R 脚本 LUC_2025.R（补充文件 1 进一步用于分析哺乳动物细胞25 显示的生物钟活动。表达昼夜节律时钟报告基因的U2 OS细胞系是测量哺乳动物昼夜节律时钟活动的常用模型细胞系26,27。我们重新分析了在 96 孔板中培养的表达 Per2d：Luc 报告基因的 U2 OS 细胞生成的时间序列数据。用靶向特定基因的 siRNA 分子处理细胞。图5显示，未用siRNA处理的阴性对照细胞显示出23.3小时的周期，2.8小时的相位和184.8 RLU的振幅。正如预期的那样，靶向CRY2基因的siRNA显著抑制了振幅，并影响了报告基因的周期和相位。PSMD4 和 PSMD7 基因编码蛋白质，这些蛋白质是 26S 蛋白酶体盖成分的一部分，用于蛋白质降解。与之前的报告25一致，R分析表明，通过各自的siRNA敲低PSMD4或PSMD7不会影响时钟参数。因此，该 R 脚本很容易适用于生物钟研究的不同实验系统。

案例研究 3.用于防御反应的 ROS 测定
除了来自发光生物钟测定的大型数据集外，R 脚本还可以用于分析其他数据类型。在这里，我们提出了一种用于定量活性氧 （ROS） 的应用。众所周知，植物已经进化出各种策略来对抗病原体入侵。其中一种策略是识别病原体中的非自身分子，然后激活先天免疫反应。一种这样的早期免疫反应是 ROS 爆发，当宿主遇到非自身分子时，它会在几分钟内发生。典型的ROS测定是用96孔板进行的，每次处理每种基因型包含12个叶盘（方案第2节）。在这里，使用两种常见的诱导子分子 flg22（一种源自细菌鞭毛蛋白28 保守区的 22 个氨基酸肽）和 elf26（一种源自延伸因子 Tu 蛋白29 的 26 个氨基酸肽）来诱导 ROS 爆发。该脚本补充 文件 3 （ROS_2025.R） 是为 ROS 数据分析而开发的。可从“补充材料”部分下载来自 ROS 测定的两个 CVS 文件，补充 文件 4 （ROS_flg22.csv） 和 补充文件 5 （ROS_elf26.csv），已转换为 R 分析的格式。R分析后，输出文件夹应与自己计算机中的每个输入文件在同一文件夹中生成，其中包含测定期间的ROS爆发曲线和总ROS值，以及统计分析（补充图S4）。对数据进行进一步处理，形成图6。此处显示的结果与已发布的结果相似，后者是手动处理的30.

图1：用于R分析的荧光素酶测定流程图。 将表达由时钟启动子驱动的荧光素酶报告基因的幼苗灭菌并在LD中的1/2 MS培养基上生长4天。将幼苗转移到含有 180 μL 含有 D-荧光素的 1/2 MS 培养基的 96 孔板中。每口井包含一棵幼苗。在 LD 中 1 天后，在 LL 中 1 天后，用酶标仪记录发光。通常记录平板上的幼苗在LL中以1 h的间隔发光，持续5-7天。记录后，对平板进行拍照以评估幼苗生长情况，并将原始数据保存为 CSV 文件以进行 R 分析。缩写：LD = 12 小时光照/12 小时暗;LL = 恒定光。 请点击此处查看此图的大图。

图2：发光数据采集和R分析的流程图。（A）概述了使用R脚本进行生物钟分析的五步程序。步骤 1.将实验设置为每个基因型和/或每个处理 8 或 12 个幼苗;步骤 2.以 1 小时的间隔记录 LL 中的发光，持续 5-7 天;步骤 3.获取 CSV 文件中的数据并格式化;步骤 4.使用 R 分析数据;和步骤 5。查看输出数据。录制的开始时间可以是任何时间。但是，由于 R 脚本只接受整数（整数），因此记录间隔必须是整数。（B） 针对 R 脚本正确格式化的输入 CSV 文件的屏幕截图。原始输入文件 NO7.csv 可在补充文件 2 中找到。请点击此处查看此图的大图。

图3：转基因植物中pGRP7wt：LUC的昼夜节律表达。 显示了pGRP7wt：LUC的发光痕迹。x 轴下方的条形表示主观白天（开放条形图）和黑夜（灰色条形图）。每个基因型的发光痕迹平均为 12 次重复。由于曲线数量众多，未显示误差线。缩写：RLU = 相对发光单位。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：R 脚本和 BioDare2 的输出数据比较。 图 3 中所示的同一组数据通过 R 脚本和 BioDare2 分析了生物钟参数、幅度、周期和相位。数据代表 SEM ±平均值 （n=12）。不同字母表示样本间差异显著（P < 0.05;使用事后 Tukey HSD 检验的单因素方差分析）。 请点击此处查看此图的大图。

图5：哺乳动物细胞生物钟活动的分析。 用表达在DD中的96孔板上培养的Per2dLuc报告基因的U2 OS细胞生成的时间序列数据在前面描述了25。靶向CRY2、PSMD4或PSMD7的siRNA分子用于处理细胞。（A） 发光痕迹。（b）Per2d：Luc的振幅、周期和相位。数据代表 SEM ±平均值 （n = 3）。面板（B）中的不同字母表示阴性对照与siRNA处理的样品之间存在显着差异（P<0.05;使用事后 Tukey HSD 检验的单因素方差分析）。缩写：RLU = 相对发光单位。 请点击此处查看此图的大图。

图 6：R 的 ROS 突发分析。 在用 1 μM flg22（左）或 1 μM elf26（右）处理后立即记录幼苗的相对发光单位。（A） 在引出后的时间过程中，每个基因型 （n = 12） 的 12 只幼苗的平均发光痕迹。每次处理的每个基因型的平均值是 R 输出的一部分。（B）每种基因型的平均总发光计数，采用flg22或elf26处理。数据代表 SEM ±平均值 （n = 12）。不同字母表示样本间差异显著（P < 0.05;使用事后 Tukey HSD 检验的单因素方差分析）。缩写：RLU = 相对发光单位。 请点击此处查看此图的大图。

表 1：R 分析的输出文档列表。 这是由 LUC_2025.R 脚本（补充文件 1）和输入文件 NO7.csv（补充文件 2）生成的输出文档的列表。

补充图S1：协议第1节中输入I和输入II的屏幕截图。 必须更改用户输入 I 才能根据本地计算机上的特定数据集定制分析。对用户输入 II 的更改是可选的，具体取决于实验设置。请务必注意， 补充文件 1 （LUC_2025.R） 脚本希望所有孔都存在于文件中，而不仅仅是选定或使用的孔。 请点击此处下载此图。

补充图 S2：输出文档的树结构。 此输出是使用 LUC_2025.R 脚本（补充文件 1）和输入文件 NO7.csv（补充文件 2）生成的。LUC_2025.R 脚本根据输入文件名生成输出文件夹。有关输出文件的更多详细信息，请参阅 表 1。框表示文件夹。 请点击此处下载此图。

补充图S3：协议第2节中用户输入I和用户输入II的屏幕截图。补充文件 3 （ROS_2025.R） 脚本使用与补充文件 1 （LUC_2025.R） 脚本相同的常规输入格式。必须更改用户输入 I 才能根据本地计算机上的特定数据集定制分析。对用户输入 II 的更改是可选的，具体取决于实验设置。请务必注意，补充文件 3 （ROS_2025.R） 脚本希望所有孔都存在于文件中，而不仅仅是选定或使用的孔。请点击此处下载此图。

补充图 S4：输出文档的树结构。 此输出是使用 ROS_2025.R 脚本（补充文件 3）和输入文件 ROS_flg22.csv（补充文件 4）生成的。ROS_2025.R 脚本根据输入文件名生成输出文件夹。该文件夹中有一个用于 Total ROS Counts 的文件和一个用于图形的文件。还有用于 PRISM 和图形数据、方差分析检验和 t 检验的子文件夹。框表示文件夹。 请点击此处下载此图。

补充表 S1：用于昼夜节律数据分析的可用生物信息学工具列表。请点击此处下载此文件。

补充文件 1：LUC_2025.R. 这是用于分析生物钟数据的 R 脚本。 请点击此处下载此文件。

补充文件 2：NO7.csv。 这是包含生物钟数据示例的输入文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件 3：ROS_2025.R. 这是用于分析 ROS 数据的 R 脚本。 请点击此处下载此文件。

补充文件 4：ROS_fig22.csv。 这是包含 ROS 数据示例的输入文件。通过1 μM flg22处理诱导ROS。 请点击此处下载此文件。

补充文件 5：ROS_elf26.csv。 这是包含 ROS 数据示例的输入文件。ROS由1 μM elf26处理诱导。 请点击此处下载此文件。

作者没有需要披露的利益冲突。