本报告介绍了一种利用开源软件 RStudio 中的 R 脚本分析时间序列实验所获得的大规模数据集的方法。
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本文内容
摘要
摘要
大型数据集在科学领域中日益普遍。开发用户友好的工具，使研究人员能够轻松分析这些大型数据集，显得尤为重要。本文介绍一种利用开源软件 RStudio 中的 R 脚本分析时间序列实验获得的大规模数据集的方法。该方法对用户输入的要求极低，即使是没有 R 语言基础或编程经验的新手也能使用。本文及 R 脚本中提供的详细说明将进一步指导用户如何使用该方法。输入数据与输出结果均存储在本地计算机的同一文件夹中，使得分析可在任何时间、任何地点进行。输出结果按文件夹分类整理，便于解读，并可方便地进一步处理以生成用于发表的图表。该方法已成功用于分析生物钟数据和活性氧爆发数据，二者均为来自 96 孔板格式时间序列实验的大规模数据集。我们相信，该方法为研究人员分析类似的时间序列实验所获得的大规模数据集提供了一种简便而强大的解决方案。
引言
随着科学领域中大型数据集的日益普及，开发用户友好的工具以使研究人员能够快速、准确且便捷地分析这些大型数据集变得尤为重要。其中一种常见的大型数据集来源于荧光素酶基因作为报告基因的应用，该技术使得对活细胞和生物体中基因表达的检测变得简便、连续且无创。发光信号记录的自动化已彻底改变了荧光素酶发光强度的测量方式，并极大地扩展了数据采集规模，尤其是在昼夜节律研究领域1,2。通过使用96孔微孔板以及配备自动进板系统的酶标仪，可在单次实验中对数千个表达荧光素酶基因的样品进行时间序列检测，有时甚至以每小时一次的频率持续数天。此类高通量实验所产生的数据量，是传统基因表达实验（依赖人工取样后进行RNA处理）所无法企及的。及时分析此类大型数据集至关重要，但也面临诸多挑战。
尽管存在大量用于分析节律性数据的工具，但其中许多工具主要用于分析基于动物行为的实验，而非生物发光报告基因的表达3,4,5,6,7（补充表 S1）。部分工具要....
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方案
1. 基于荧光素酶的昼夜节律钟分析
- 荧光素酶实验的实验装置
注意：荧光素酶检测是一种用于实时评估生物钟活性的常用方法。来自活体转基因生物和/或细胞所携带的荧光素酶报告基因的发光信号可被自动记录，从而生成大规模的时间序列数据集。本实验室主要使用 拟南芥 表达荧光素酶基因作为报告基因的幼苗。 图1 和 图2 显示我们实验室中对先前描述进行修改后的、采用96孔板格式对幼苗进行荧光素酶检测的典型实验装置流程图2.- 用烧杯将3 mL 36%（w/w）HCl加入100 mL家用漂白剂中，产生氯气蒸气，在密闭钟罩内对种子进行3小时的灭菌处理，钟罩置于化学通风橱中。灭菌完成后，在超净工作台中使用无菌玻璃巴斯德吸管将种子接种于含0.5%蔗糖和0.8%琼脂（pH 5.7）的1/2MS培养基平板上。将化学废液收集至带盖容器中，并与机构的环境健康服务部门协作妥善处置。
- 将培养皿置于 4 °C 环境中 2 天，随后转移至具有 12 小时光照与 12 小时黑暗光周期（LD）的组织培养室中。
- 让幼苗在长日照条件下生长4天。
- 将幼苗转移至96孔板中，每孔加入180 µL检测培养基（1/2MS、0.5%蔗糖、0.4%琼脂、0.25 mM荧光素）。将....
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结果
案例研究1. 利用拟南芥幼苗进行生物钟活性的发光检测
我们先前研究表明，富含甘氨酸的RNA结合蛋白7（GRP7）基因受主生物钟蛋白CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1（CCA1）调控，且GRP7的昼夜节律表达对其在植物防御中的功能至关重要，该结论基于在野生型GRP7启动子（pGRP7wt:LUC）驱动下表达荧光素酶报告基因的转基因Col-0植株所得结果21。我们利用名为LUC_2025.R的R脚本（方案第1部分中的补充文件1），分析了这些转基因植株以及对照植株CCA1:LUC/Col-0的生物钟活性。
名为 NO7.csv 的输入文件（补充文件 2）包含七个独立的 pGRP7wt:LUC 品系以及 CCA1:LUC/C.......
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讨论
本文介绍了在 RStudio 中使用 R 脚本提供一种用户友好的方法，用于分析从 96 孔板格式的时间序列实验中获得的大规模数据。该方法使我们能够快速、简便地分析来自数千个样本的时间序列实验中的发光记录数据，以评估从植物幼苗到哺乳动物细胞培养物的生物钟活性，此外还可分析活性氧（ROS）检测中的数据。
BioDare2 是一个免费的数据库，已被广泛用于昼夜节律数据分析。尽管 BioDare2 是一个设计良好的在线工具，但研究人员需要将数据上传至网络，并在每次分析完成后下载结果。此外，还需进行大量数据标注和格式处理，才能将数据转换为可用格式。本文所描述的 R 方法提供了若干功能，可显著提升使用的便捷性。首先，该方法对用户输入的要求极低，仅需四个简单步骤：指定工作目录、输入文件、处理组标签以及钟控实验的相对起始时间。用户还可根据自身具体需求添加其他可选输入。本文提供了详细说明，以帮助用户更好地了解如何进行相应修改。不同培养板的实验可连续进行分析，无需中途重复输入相同信息。该脚本可轻松用于分析 96 孔板格式的实验，每种处理可包含 8 或 12 个重复，且无需手动查找孔板各孔的标签。其次，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Lu实验室的成员在本研究工作中提供的帮助。感谢Min Gao和Matthew Fabian提供未处理的数据，感谢Benjamin Harris在编写本R脚本过程中提供的协助和/或指导。感谢辛辛那提儿童医院医学中心的John B. Hogenesch提供用于案例研究2的哺乳动物细胞发光数据。我们还感谢辛辛那提儿童医院医学中心的John B. Hogenesch、爱丁堡大学的Andrew Millar以及史密斯学院的Mary Harrington在本方法开发过程中提供的有益讨论。本研究工作部分得到了美国国家科学基金会（NSF 1456140 和 NSF 2223886）向Hua Lu提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| R | R 项目 | https://www.r-project.org/ | 一个可从网络免费下载并用于编程的开源平台，尤其适用于统计分析。 |
| RStudio | Posit 软件 | https://posit.co/download/rstudio-desktop/ | 一款可从网络下载的免费软件，旨在提供更便捷的 R 语言使用体验。 |
| MetaCycle | Gang Wu, Xavier Li, Matthew Carlu showc, Ron Anafi, Michael Hughes, Karl Kornacker, 和 John Hogenesch | https://cran.r-project.org/web/packages/MetaCycle/vignettes/implementation.html | 使用MetaCycle软件包中的ARSER算法评估生物钟参数，包括周期、相位和振幅。 |
| ggplot2 | Posit Software | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html | 生成数据可视化图表，特别是用于统计图形。 |
| dplyr | Posit Software | https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html | 一种用于高效数据处理的基础 R 程序包。 |
| magrittr | Posit Software | https://cran.r-project.org/web/packages/magrittr/index.html | 提供一组运算符，以增强代码可读性，并促进数据操作的自然流程。 |
| stringr | Posit Software | https://cran.r-project.org/web/packages/stringr/index.html | 提供了一组一致、简洁且易于使用的函数，用于处理字符字符串。 |
| 文件字符串 | Rory Nolan, Sergi Padilla-Parra | https://cran.r-project.org/web/packages/filesstrings/index.html | 提供用于操作文件和字符串的便捷函数，特别是与文件名和路径相关的操作。 |
| 圆形的 | Ulric Lund, Claudio Agostinelli, Hiroyoshi Arai, Alessando Gagliardi, Eduardo García-葡萄牙és, Dimitri Giunchi, Jean-Olivier Irisson, Matthew Pocernich, 和 Federico Rotolo | https://cran.r-project.org/web/packages/circular/index.html | 提供圆形数据的统计分析与图形化表示。 |
| AICcmodavg | Marc J. Mazerolle | https://cran.r-project.org/web/packages/AICcmodavg/index.html | 基于赤池信息准则（AIC）及相关信息创建模型选择表格。 |
| broom | Posit Software | https://cran.r-project.org/web/packages/broom/index.html | 将各种统计模型和对象的输出转换为 "整洁" tibbles（一种现代数据框格式），使其更便于处理、分析和可视化模型结果。 |
| 高压灭菌器 | Steris Amsco Eagle Century SG120 Scientific, Inc. | 8901400012 | 高压灭菌培养基 |
| 化学通风橱 | 实验室设计 &材料与供应 | 对种子进行灭菌 | |
| Omega 发光检测仪 | BMG LABTECH, Inc. | 酶标仪 | |
| 层流柜 | NuAire Nu-408FM-400 | II类/类型A | 将幼苗转移至96孔板 |
| 96孔微孔板 | Perkin-Elmer | OptiPlate-96 | 用于荧光素酶检测的幼苗培养 |
| Flg22 | GenScript Inc. | RP19986 | 一种来自细菌鞭毛蛋白的激发子。 |
| Elf26 | Alpha Diagnostic Intl. Inc. | 2427 | 一种来自细菌翻译延伸因子-Tu的激发子。 |
| D-荧光素萤火虫，钾盐 | Biosynth 化学 &与生物学 | L-8220 | 荧光素酶底物 |
| L-012（鲁米诺） | Fisher Scientific | NC0733364 | ROS 检测试剂 |
参考文献
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393 (10), 288-301 (2005).
- McClung, C. R., Xie, Q. Measurement of luciferase rhythms in plant circadian networks. Circadian Networks. Staiger, D. , Springer. New York. 1-11 (2014).
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