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方法文章

大规模数据集的用户友好型高效 R 分析

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⸱

DOI：

10.3791/68868

⸱

2025年11月4日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

本文内容

摘要

本报告介绍了一种利用开源软件 RStudio 中的 R 脚本分析时间序列实验所获得的大规模数据集的方法。

摘要

大型数据集在科学领域中日益普遍。开发用户友好的工具，使研究人员能够轻松分析这些大型数据集，显得尤为重要。本文介绍一种利用开源软件 RStudio 中的 R 脚本分析时间序列实验获得的大规模数据集的方法。该方法对用户输入的要求极低，即使是没有 R 语言基础或编程经验的新手也能使用。本文及 R 脚本中提供的详细说明将进一步指导用户如何使用该方法。输入数据与输出结果均存储在本地计算机的同一文件夹中，使得分析可在任何时间、任何地点进行。输出结果按文件夹分类整理，便于解读，并可方便地进一步处理以生成用于发表的图表。该方法已成功用于分析生物钟数据和活性氧爆发数据，二者均为来自 96 孔板格式时间序列实验的大规模数据集。我们相信，该方法为研究人员分析类似的时间序列实验所获得的大规模数据集提供了一种简便而强大的解决方案。

引言

随着科学领域中大型数据集的日益普及，开发用户友好的工具以使研究人员能够快速、准确且便捷地分析这些大型数据集变得尤为重要。其中一种常见的大型数据集来源于荧光素酶基因作为报告基因的应用，该技术使得对活细胞和生物体中基因表达的检测变得简便、连续且无创。发光信号记录的自动化已彻底改变了荧光素酶发光强度的测量方式，并极大地扩展了数据采集规模，尤其是在昼夜节律研究领域1,2。通过使用96孔微孔板以及配备自动进板系统的酶标仪，可在单次实验中对数千个表达荧光素酶基因的样品进行时间序列检测，有时甚至以每小时一次的频率持续数天。此类高通量实验所产生的数据量，是传统基因表达实验（依赖人工取样后进行RNA处理）所无法企及的。及时分析此类大型数据集至关重要，但也面临诸多挑战。

尽管存在大量用于分析节律性数据的工具，但其中许多工具主要用于分析基于动物行为的实验，而非生物发光报告基因的表达3,4,5,6,7（补充表 S1）。部分工具要求研究人员具备计算机编程技能，例如掌握 Python 或能够使用 MATLAB。另一些工具则需要购买软件，成本较高。目前也有一些免费且可用的在线解决方案。其中之一是 BioDare28，该工具提供了多种不同的方法用于分析节律性数据。BioDare2 是一个用户友好的在线工具，对计算技能要求极低。用户只需在线上传数据输入，并从在线界面下载分析结果，以便进行后续处理。

本文介绍了一系列用户友好的 R 脚本，具备多种功能，可轻松分析大规模数据集。我们使用免费的开源软件 RStudio9，这是一个用于 R 和 Python 的集成环境来运行这些脚本。RStudio 可在多种计算机系统上使用，包括 Windows、Mac 和 Linux。本报告中提供了详细的分步说明，指导用户如何使用 R 脚本，具体见方案部分的第 1 和第 2 节。该方法对用户输入的要求极低。即使是没有 R 语言基础或编程经验的新手，也能使用该方法分析来自荧光素酶报告基因实验或其他类型的时间序列数据集。所有输入和输出数据均存储在本地计算机上，因此在首次下载所有相关 R 软件包后，无需依赖网络连接即可在任何地方进行数据分析。输出数据被自动归类到结构清晰的文件夹中，结果可直接用于论文发表。输出内容还包括统计分析结果，以便快速评估样本间的差异。因此，该 R 方法为科研人员分析大规模数据集提供了一种简便而强大的解决方案。

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方案

1. 基于荧光素酶的昼夜节律钟分析

  1. 荧光素酶实验的实验装置
    注意：荧光素酶检测是一种用于实时评估生物钟活性的常用方法。来自活体转基因生物和/或细胞所携带的荧光素酶报告基因的发光信号可被自动记录，从而生成大规模的时间序列数据集。本实验室主要使用 拟南芥 表达荧光素酶基因作为报告基因的幼苗。 图1 和 图2 显示我们实验室中对先前描述进行修改后的、采用96孔板格式对幼苗进行荧光素酶检测的典型实验装置流程图2.
    1. 用烧杯将3 mL 36%（w/w）HCl加入100 mL家用漂白剂中，产生氯气蒸气，在密闭钟罩内对种子进行3小时的灭菌处理，钟罩置于化学通风橱中。灭菌完成后，在超净工作台中使用无菌玻璃巴斯德吸管将种子接种于含0.5%蔗糖和0.8%琼脂（pH 5.7）的1/2MS培养基平板上。将化学废液收集至带盖容器中，并与机构的环境健康服务部门协作妥善处置。
    2. 将培养皿置于 4 °C 环境中 2 天，随后转移至具有 12 小时光照与 12 小时黑暗光周期（LD）的组织培养室中。
    3. 让幼苗在长日照条件下生长4天。
    4. 将幼苗转移至96孔板中，每孔加入180 µL检测培养基（1/2MS、0.5%蔗糖、0.4%琼脂、0.25 mM荧光素）。将培养板先置于长日照条件（LD）下1天，随后转入连续光照（LL）条件下培养1天。
    5. 向孔中加入处理剂或模拟溶液，并在持续光照（LL）条件下以每小时一次的频率记录5-7天的发光信号。将发射滤光片镜头设置为 3,600 用于 增益 以及测量 间隔时间 在 1 s.
      注意：记录的起始时间可以为任意时刻。但由于 R 脚本仅接受整数（整数值），记录间隔必须为整数。例如，允许设置 1 小时的间隔，但不允许设置 15 分钟的间隔用于 R 脚本。
    6. 记录结束后，拍摄培养板的照片以记录幼苗生长情况。
    7. 将原始数据保存为 CSV 文件，用于 R 分析，使用以下方法 另存为 使用酶标仪的数据分析软件进行功能分析。
  2. 基于荧光素酶的昼夜节律数据的R分析逐步详解
    ​注意：本R分析使用R脚本 补充文件 1 （LUC_2025.R），专为昼夜节律数据分析开发，以及输入文件 补充文件 2 （NO7.csv）。R 脚本及输入文件已通过在线代码仓库平台 Github 公开提供（https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis）。
    1. 下载与计算机系统兼容的 RStudio 软件9,10.
    2. 下载 RStudio 算法包所需的软件包 补充文件 1 (LUC_2025.R)：MetaCycle11ARSER算法12 MetaCycle 包，ggplot213，dplyr14，magrittr15，stringr16，文件字符串17，环状18AICcmodavg19和扫帚20.
      注意：R 脚本的开头部分还列出了所需的软件包列表。
    3. 更改用户输入 I（根据本地计算机上的特定数据集，包括工作目录、输入文件名称、处理标签以及检测的相对起始时间）。
      注意：步骤 1.2.1 和 1.2.2 仅需完成一次；此后 RStudio 界面控制台即可准备接收用户输入，并针对每次新分析进行相应修改。用户输入部分包含两个部分（补充图 S1).
      1. 选择工作目录。指定输入文件所在的位置，输出文件也将保存在同一文件夹中。
      2. 选择输入文件，即为 R 脚本正确格式化的 CSV 文件（图2B）。具体而言，顶行显示时间序列，第一列包含96孔板上各个样本的位置。
        注意：此类输入 CSV 文件的示例如下所示，可参见 补充文件 2 (NO7.csv)
      3. 命名样本和/或处理组。由于该分析适用于从具有时间序列的96孔板实验中获得的数据，因此实验设计应为每种处理设置8个重复，每块板最多包含12种处理；或每种处理设置12个重复，每块板最多包含8种处理。务必准确输入样本数量（8或12），因为样本数量会影响程序运行；如果样本数量不是8或12，代码将无法执行。然而，如果存在空孔行，只需在处理名称栏中将其明确列出，例如命名为 empty 1、empty 2……
        注意：对于样本名称，应避免使用反斜杠或类似符号，因为它们可能导致文件名问题。此外，还应避免使用 "NA" 在用户输入 II 中选择使用方差分析（ANOVA）时，将其作为标签。任何名称完全相同的处理将被合并为一个大的处理组。
      4. 标明实验的相对起始时间。对于一个24小时周期，主观黎明是指在正常光/暗循环中培养箱光照开启的时间点。例如，若光照在上午7点开启，则将此时间视为昼夜节律时间0（circadian time 0）。若荧光素酶实验在上午9点开始，则实验时间为昼夜节律时间2（circadian time 2）；此时应输入2作为相对起始时间。
        注意：相对起始时间必须为整数，且不能为负数。这将影响样品的相位读数。
    4. 根据具体需求更改用户输入 II 选项。
      注意：以下说明对用户输入部分提供了更详细的解释，并逐步指导如何进行修改。
      1. 包含图表：发光曲线，以及按基因型和处理分组的周期、相位和振幅图。
      2. 使用 ANOVA 检验结合 Tukey HSD 方法比较各处理组在周期、相位和振幅上的差异。为 ANOVA 检验结果选择一个对照组；可指定 ANOVA 检验的对照组，或留空该选项以在成对比较中将每个处理组均作为对照。此外，可选择是否对 ANOVA 输出文件进行编号，以便更快地参考和整理。
      3. 使用一个 t- 使用t检验比较各处理组的周期、相位和振幅。选择t检验是否采用配对比较方式；若选择配对t检验，需指定数据是否为配对数据。选择一个对照组作为参照 t- 测试；指明该对照组的对照内容 t-检验，或留空以将每种处理作为对照。选择是否对各项进行编号 t- 测试输出文件，以便更快地参考和整理。
        注意：此方法仅可用于同时比较两种处理，例如在相同基因型的两组中分别添加水杨酸（SA）或模拟处理（Mock）。所显示的 p 值未针对同一组别进行多次比较进行校正。
      4. 选择是否对时间点进行取整。如果时间点仅偏差一到两分钟，可将其取整至最接近的整点小时，并采用此分析方法。
        注意：此代码使用ARS方法计算周期、相位和振幅12该方法需要以小时为单位的连续时间序列才能运行。
      5. 根据酶标仪记录孔板的方式，更改输入数据的读取方式。选择按 A1、A2、A3… 顺序排列的标准孔位数据列表，或选择按 A1、B1、C1… 顺序排列的孔位列表。
    5. 单击即可运行分析 来源 控制台右上角的按钮。
      注意：分析过程耗时不到1分钟。R分析的结果将自动保存在与输入数据集相同的文件夹中。
    6. 查看输出结果：输出文件夹包含多个文档和子文件夹，提供全面的分析结果，包括每种基因型和/或处理组重复样本的平均周期、相位和振幅的统计信息。
      ​注意：对于输入文件 补充文件 2 (NO7.csv)，由系统生成的输出文件列表 补充文件 1 协议第1节中描述了(LUC_2025.R)脚本 表1 并可方便地通过树状结构进行查看 补充图 S2.

2. 基于鲁米诺的活性氧检测

  1. 活性氧检测实验设置
    1. 使用活检打孔器从25天大的植株第四至第七片叶上切取直径为4 mm的叶圆片。
    2. 将叶圆片有毛的一面朝上，漂浮于96孔板中每孔100 µL的无菌水中。
    3. 用洁净的锡箔纸覆盖96孔板，并将其置于LD培养箱中过夜。
    4. 将水替换为100 µL的鲁米诺溶液（300 µM，溶于pH 7.4的10 mM MOPS缓冲液中），并加入1 µM flg22或其他诱导子。以不含flg22的溶液作为空白对照。
    5. 立即开始每分钟记录一次发光信号，持续40–60分钟。
  2. ROS数据R分析的逐步说明
    注：本R分析使用RStudio、R脚本 Supplemental File 3 (ROS_2025.R)以及输入文件 Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) 或 Supplemental File 5 (ROS_elf26.csv)。该R脚本及输入文件 Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) 已通过在线代码仓库平台Github公开提供（https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis）
    1. 下载RStudio包：gplot213、dplyr14、magrittr15、stringr16 和 filesstrings17。
      注：步骤2.2.1仅需完成一次。为帮助用户根据本地计算机上的特定数据集定制每次分析，脚本中设置了名为"用户输入"的部分，允许用户指定其实验的特定参数（补充图S3）。
    2. 根据本地计算机上的特定数据集修改“用户输入I”，包括工作目录、输入文件名称、处理组标签以及检测的相对起始时间。
      1. 选择工作目录，指明输入文件所在位置，输出文件也将保存在同一文件夹中。
      2. 选择输入文件，该文件应为符合R脚本格式要求的CSV文件（图2B）。具体而言，第一行为时间序列，第一列为96孔板上各个样品的位置。
        注：此类输入CSV文件的示例可在补充材料中找到，即 补充文件4 (ROS_flg22.csv) 或 补充文件5 (ROS_elf26.csv)。
      3. 命名样品和/或处理组。由于本分析适用于具有时间序列的96孔板实验数据，建议每板实验设计为每处理8个重复，最多12个处理组；或每处理12个重复，最多8个处理组。若存在空孔行，请在处理组名称区域如实列出，例如命名为“empty 1”、“empty 2”等。
        注：正确输入样本数量（8或12）非常重要，因为程序会统计样本数。若样本数非8或12，代码将无法运行。在命名样本时，应避免使用反斜杠或其他类似符号，以免导致文件名错误。此外，在“用户输入II”中选择使用ANOVA时，应避免使用"NA"作为标签。与 补充文件1 (LUC_2025.R)脚本不同，在本 补充文件3 (ROS_2025.R)脚本中，名称相同的处理组不会合并为同一组。
    3. 根据用户的特定需求修改“用户输入II”中的选项。
      注：示例“用户输入”可参见 补充图S3。
      1. 使用ANOVA检验结合Tukey HSD方法比较各处理组的发光信号总和。
      2. 使用双侧 t-检验一次性比较仅两个处理组的数据。
        注：显示的p值未针对同一行内的多次比较进行校正。
      3. 绘制荧光曲线图及比较总荧光信号总和的柱状图，并在图中添加标准差或均值标准误。
      4. 根据酶标仪记录孔位的方式，调整输入数据的读取方式：可选择按A1、A2、A3…顺序的标准数据排列，或按A1、B1、C1…顺序的排列方式。
  3. 只需点击控制台右上角的 Source 按钮即可运行分析。
    注：分析过程耗时不到1分钟。R分析的输出结果将自动保存在与输入数据集相同的文件夹中。
  4. 查看输出结果：输出文件夹包含多个文档和子文件夹，提供全面的分析内容。
    注：对于输入文件 补充文件4 (ROS_flg22.csv)，协议第2部分所述的 补充文件3 (ROS_2025.R)脚本生成的输出文件结构树如 补充图S4所示。

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结果

案例研究1. 利用拟南芥幼苗进行生物钟活性的发光检测

我们先前研究表明，富含甘氨酸的RNA结合蛋白7（GRP7）基因受主生物钟蛋白CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1（CCA1）调控，且GRP7的昼夜节律表达对其在植物防御中的功能至关重要，该结论基于在野生型GRP7启动子（pGRP7wt:LUC）驱动下表达荧光素酶报告基因的转基因Col-0植株所得结果21。我们利用名为LUC_2025.R的R脚本（方案第1部分中的补充文件1），分析了这些转基因植株以及对照植株CCA1:LUC/Col-0的生物钟活性。

名为 NO7.csv 的输入文件（补充文件 2）包含七个独立的 pGRP7wt:LUC 品系以及 CCA1:LUC/C...

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讨论

本文介绍了在 RStudio 中使用 R 脚本提供一种用户友好的方法，用于分析从 96 孔板格式的时间序列实验中获得的大规模数据。该方法使我们能够快速、简便地分析来自数千个样本的时间序列实验中的发光记录数据，以评估从植物幼苗到哺乳动物细胞培养物的生物钟活性，此外还可分析活性氧（ROS）检测中的数据。

BioDare2 是一个免费的数据库，已被广泛用于昼夜节律数据分析。尽管 BioDare2 是一个设计良好的在线工具，但研究人员需要将数据上传至网络，并在每次分析完成后下载结果。此外，还需进行大量数据标注和格式处理，才能将数据转换为可用格式。本文所描述的 R 方法提供了若干功能，可显著提升使用的便捷性。首先，该方法对用户输入的要求极低，仅需四个简单步骤：指定工作目录、输入文件、处理组标签以及钟控实验的相对起始时间。用户还可根据自身具体需求添加其他可选输入。本文提供了详细说明，以帮助用户更好地了解如何进行相应修改。不同培养板的实验可连续进行分析，无需中途重复输入相同信息。该脚本可轻松用于分析 96 孔板格式的实验，每种处理可包含 8 或 12 个重复，且无需手动查找孔板各孔的标签。其次，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Lu实验室的成员在本研究工作中提供的帮助。感谢Min Gao和Matthew Fabian提供未处理的数据，感谢Benjamin Harris在编写本R脚本过程中提供的协助和/或指导。感谢辛辛那提儿童医院医学中心的John B. Hogenesch提供用于案例研究2的哺乳动物细胞发光数据。我们还感谢辛辛那提儿童医院医学中心的John B. Hogenesch、爱丁堡大学的Andrew Millar以及史密斯学院的Mary Harrington在本方法开发过程中提供的有益讨论。本研究工作部分得到了美国国家科学基金会（NSF 1456140 和 NSF 2223886）向Hua Lu提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RR 项目https://www.r-project.org/ 一个可从网络免费下载并用于编程的开源平台，尤其适用于统计分析。
RStudioPosit 软件https://posit.co/download/rstudio-desktop/ 一款可从网络下载的免费软件，旨在提供更便捷的 R 语言使用体验。
MetaCycleGang Wu, Xavier Li, Matthew Carlu showc, Ron Anafi, Michael Hughes, Karl Kornacker, 和 John Hogeneschhttps://cran.r-project.org/web/packages/MetaCycle/vignettes/implementation.html 使用MetaCycle软件包中的ARSER算法评估生物钟参数，包括周期、相位和振幅。 
ggplot2Posit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html 生成数据可视化图表，特别是用于统计图形。
dplyrPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html 一种用于高效数据处理的基础 R 程序包。
magrittrPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/magrittr/index.html 提供一组运算符，以增强代码可读性，并促进数据操作的自然流程。
stringrPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/stringr/index.html 提供了一组一致、简洁且易于使用的函数，用于处理字符字符串。
文件字符串Rory Nolan, Sergi Padilla-Parrahttps://cran.r-project.org/web/packages/filesstrings/index.html 提供用于操作文件和字符串的便捷函数，特别是与文件名和路径相关的操作。
圆形的Ulric Lund, Claudio Agostinelli, Hiroyoshi Arai, Alessando Gagliardi, Eduardo García-葡萄牙és, Dimitri Giunchi, Jean-Olivier Irisson, Matthew Pocernich, 和 Federico Rotolohttps://cran.r-project.org/web/packages/circular/index.html 提供圆形数据的统计分析与图形化表示。
AICcmodavgMarc J. Mazerollehttps://cran.r-project.org/web/packages/AICcmodavg/index.html 基于赤池信息准则（AIC）及相关信息创建模型选择表格。 
broomPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/broom/index.html 将各种统计模型和对象的输出转换为 "整洁" tibbles（一种现代数据框格式），使其更便于处理、分析和可视化模型结果。
高压灭菌器Steris Amsco Eagle Century SG120 Scientific, Inc.8901400012高压灭菌培养基
化学通风橱实验室设计 &材料与供应 对种子进行灭菌
Omega 发光检测仪 BMG LABTECH, Inc.酶标仪
层流柜NuAire Nu-408FM-400II类/类型A 将幼苗转移至96孔板
96孔微孔板Perkin-ElmerOptiPlate-96 用于荧光素酶检测的幼苗培养
Flg22GenScript Inc.RP19986一种来自细菌鞭毛蛋白的激发子。 
Elf26Alpha Diagnostic Intl. Inc.2427一种来自细菌翻译延伸因子-Tu的激发子。
D-荧光素萤火虫，钾盐Biosynth 化学 &与生物学L-8220荧光素酶底物
L-012（鲁米诺）Fisher ScientificNC0733364ROS 检测试剂

参考文献

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  13. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  14. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. v.1.0.2, (2020).
  15. magrittr: A Forward-Pipe Operator for R. v.2.0.3, (2022).
  16. stringr: Simple, Consistent Wrappers for Common String Operations. v.1.4.0, (2019).
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