利用三种不同方法的比较分析评估SASP因子对癌细胞增殖的影响

摘要

本研究利用三种方法评估了衰老相关分泌表型（SASP）因子对非衰老HeLa细胞的增殖效应，这些因子来源于衰老的HeLa细胞 体外 具有实时监测功能的模型。系统比较了每种方法的优缺点，以更深入地理解癌症中的细胞间相互作用。

摘要

化疗诱导的衰老癌细胞还会分泌多种因子，称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP），以调控其细胞外微环境。既往研究报道，这些SASP因子对周围细胞具有有害的旁分泌效应，包括促进细胞增殖、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、血管生成及细胞迁移。若干 体外 共培养技术被广泛用于研究通过将相同或不同类型的细胞共同培养而产生的细胞过程。在此，利用三种互补方法研究了衰老的HeLa细胞分泌的SASP因子对非衰老HeLa细胞的潜在促增殖作用 体外 方法。第一种方法通过共培养衰老细胞与非衰老细胞，研究由衰老相关分泌表型（SASP）介导的旁分泌信号。第二种方法收集衰老癌细胞的条件培养基，经浓缩后用于检测条件培养基对细胞增殖的影响，并通过实时监测评估其效应。第三种方法将衰老细胞与非衰老细胞并排培养，以评估SASP通过直接细胞间接触介导的邻分泌效应。这三种实验模型均一致表明，SASP因子显著促进非衰老癌细胞的增殖。值得注意的是，与对照组相比，衰老细胞共培养使增殖速率提高64.6%，而3倍浓缩的SASP条件培养基使增殖增加超过50%。基于荧光成像的结果显示，在邻分泌条件下，GFP阳性细胞数量增加了49.3%。这些方法共同实现了对SASP诱导的增殖变化进行定性与定量评估。对这三种方法的比较分析揭示了各自的优势与局限性，为深入理解衰老细胞的旁分泌效应提供了重要见解。

引言

在多细胞生物中，细胞通过旁分泌和邻分泌信号传导与微环境交换信息，从而影响彼此的行为。这种通讯可以直接通过隧道纳米管和间隙连接进行，也可以间接通过向细胞外基质分泌可溶性化学分子（如细胞因子、生长因子和趋化因子）来实现。这些信号传导机制在调控多种生理过程（包括组织发育和免疫细胞反应）中发挥关键作用，同时也参与多种疾病（如癌症、艾滋病、高血压和阿尔茨海默病）的发病机制¹。

20世纪60年代，Leonard Hayflick发现正常人类成纤维细胞在体外具有有限的复制能力in vitro²。由于端粒随细胞分裂逐渐缩短而导致的这种有限增殖状态被称为复制性衰老。后续研究表明，多种类型的细胞应激也可触发细胞衰老。研究已证实，常见的癌症治疗方法（如化疗和放疗）同样可在癌细胞和基质细胞中诱导细胞衰老，这一现象被称为治疗诱导性衰老^3,4。细胞衰老与机体衰老是具有层级关系但彼此不同的生物学过程。衰老细胞在机体内的累积通过促进炎症反应、组织功能障碍以及年龄相关疾病的发生而推动衰老进程。然而，与细胞衰老相比，衰老涉及更广泛的系统性事件和机制⁵。

衰老细胞的特征是细胞质扩张，明显大于正常细胞，并呈现扁平的形态⁶。这些衰老细胞的溶酶体活性增强，且对衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）呈阳性反应，该酶是一种溶酶体酶，即使在pH 6.0的酸性条件下仍保持活性。SA-β-gal染色是检测衰老细胞应用最广泛的生物标志物⁷。细胞核增大和形态不规则在发生衰老的细胞中常见。此外，这些细胞具有独特的染色质重排结构，称为衰老相关异染色质灶（SAHF），可介导不可逆的细胞周期阻滞^8,9。

尽管衰老的癌细胞最终失去了增殖能力，但它们仍保持存活并具有代谢活性。已知衰老细胞会分泌多种因子以调节其细胞外肿瘤微环境，这种现象被称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）^10,11。这些SASP因子包括可溶性信号分子（如白细胞介素、趋化因子和生长因子）、分泌型蛋白酶以及分泌的不溶性蛋白/细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分。总体而言，这些因子会产生有害的旁分泌效应，包括促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及诱导上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）^4,12。此外，化疗引起的不良反应部分归因于衰老细胞的积累¹³。因此，研究衰老细胞与非衰老细胞之间的相互作用已成为癌症治疗领域的重要研究方向。特别是对SASP因子的分析，尤其是其组成成分及其对肿瘤微环境的影响，被认为是发现癌症治疗新靶点分子以及针对这些分子开发新药的有前景策略。

体外共培养技术长期以来被用于研究细胞间相互作用的理解¹⁴。在本方法学文章中，旨在利用三种不同的方法评估衰老细胞分泌的因子对非衰老癌细胞可能具有的增殖活性。此外，对三种不同方法所得结果进行了比较，并对每种方法各自的优缺点进行了批判性评价。

首先，建立衰老的HeLa细胞与非衰老的HeLa细胞之间的共培养模型，利用实时细胞分析系统实时监测癌细胞增殖可能发生的改变¹²。该系统包含两块培养板，用于评估细胞间的相互作用。形成下层的e-plate微孔板表面用于接种靶细胞，其底部设有微电极。靶细胞黏附于该表面所产生的电阻以可测量的参数——细胞指数（Cell Index, CI）表示。CI值与细胞数量及其对表面的黏附程度成正比¹⁵。此外，e-plate微孔板可在相差显微镜下对细胞进行形态学观察。形成上层的e-plate插入式培养室是效应细胞接种的区域，其底部覆盖有孔径为0.4 µm的半透膜。效应细胞分泌的因子可穿过该膜，作用于e-plate微孔板中的靶细胞。若此相互作用促进细胞增殖，则表现为CI值的升高。因此，可对细胞间的相互作用进行定量评估。

在第二种方法中，收集衰老的HeLa细胞的条件培养基，浓缩后添加至未衰老的HeLa细胞中。使用实时细胞分析系统监测这些细胞的潜在增殖效应。

在第三种方法中，计划将衰老的HeLa细胞与非衰老的GFP-HeLa细胞直接在二维条件下共培养，并在显微镜下实时监测癌细胞可能发生的增殖变化。

本实验的目的是建立三种模型，用于研究衰老的HeLa细胞与非衰老的HeLa细胞之间的相互作用，并实时监测癌细胞增殖可能发生的改变。因此，可方便地探究衰老癌细胞所分泌的SASP因子对其他癌细胞的影响。相应地，对这三种方法的优势与局限性进行了系统性评估。

方案

注意：所有细胞培养操作均须在二级以上生物安全水平（BSL2+）条件下，于经认证的生物安全柜内进行。阿霉素是一种危险的化疗药物，所有操作必须在经认证的二级以上生物安全水平（BSL2+）安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服和手套。所有含有阿霉素的废弃物，包括培养基和固定液，均应收集于指定且明确标识的危险废物容器中，并通过机构的危险废物管理系统进行处置。

1. 模型1：使用实时细胞分析系统进行共培养

1. 细胞培养与衰老诱导（第1-2天）
   1. 接种 8 × 10⁵ 将HeLa细胞接种至含有5 mL添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的T25培养瓶中，于37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养₂.
   2. 次日，将细胞培养基更换为5 mL新鲜完全培养基。通过直接向培养基中加入300 nM阿霉素处理细胞，以诱导细胞衰老。将T25培养瓶置于含5% CO₂的培养箱中继续培养。₂ 37 °C 下孵育 72 小时。
2. 非衰老细胞接种（第4天）
   1. 种子 8 x 10⁵ 未处理的HeLa细胞（非衰老对照）接种于新的T25培养瓶中，加入5 mL DMEM培养基，培养基中添加10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL），置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养₂.
3. 确认衰老诱导（第5天）
   1. 为了确定多柔比星处理72 h是否诱导了细胞衰老，进行SA-β-半乳糖苷酶染色⁶在未用于主要实验的另一组细胞上进行此检测。有关获得的结果，请参见 图1A，B.
   2. 检测衰老HeLa癌细胞条件培养基中的IL-6水平以评估其分泌活性。用阿霉素处理细胞72小时，随后在无血清且不含酚红的培养基中继续孵育2天。根据细胞数量对收集的条件培养基进行归一化处理，并测定IL-6水平。
      注意：IL-6 是 SASP 的标志性细胞因子¹²IL-6 测量结果以……形式呈现 图1C.
4. 实时细胞分析系统设置（第5天）
   1. 在接种细胞前，启动实时细胞分析系统。打开 RTCA 软件 2.0，点击 实验注意事项 按钮（图2）并输入实验详情。
   2. 点击 时间安排 按钮并添加两个步骤。第一步用于背景设置。第二步为每15分钟监测一次细胞增殖，持续72小时。
   3. 选择 第一步 并点击 播放 通过向 e-plate view 的每个孔中加入 50 µL 完全培养基，记录背景阻抗值。
5. 将细胞接种至e-plate培养板（第5天）
   1. 在接种细胞前，使用10倍物镜在相差显微镜下观察经阿霉素处理（衰老）和未经处理（非衰老）的HeLa细胞。显微镜下可见，衰老细胞的形态较正常细胞明显增大。
   2. 用 5 mL 无菌预热的 PBS 清洗衰老和非衰老的 HeLa 细胞，然后吸弃。
   3. 加入1 mL预热的0.05%胰蛋白酶，于37 °C孵育2分钟以使细胞脱落。加入5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM培养基中和胰蛋白酶。
   4. 以 500 x g 离心细胞 g 室温孵育10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL完全DMEM培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）。
   5. 使用血细胞计数板，通过台盼蓝染色排斥法计数活细胞。
   6. 将非衰老的 HeLa 细胞以 5 x 10 的密度接种³ 每孔加入100 µL完全DMEM培养基，其中包含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL），接种至e-plate的每个孔中，每孔细胞数为cells/well。
   7. 将e-plate放入实时细胞分析系统的支架中，置于培养箱内，使细胞贴附于培养板表面。
   8. 选择 第二步 在时间表按钮上点击并选择 播放 使用 RTCA 软件 2.0 开始阻抗测量的按钮，持续 72 小时（图2).
6. 将细胞接种至e-plate小室中
   1. 在60 µL完全DMEM培养基中接种种子细胞至e-plate插入式培养小室，培养基中添加10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）。
   2. 将种子细胞接种至e-plate小室中，设置三种不同的实验条件：第一组（阴性对照）：不接种细胞（仅培养基）
      第2组：2 × 10⁴ 非衰老的HeLa细胞
      第3组：1 × 10⁵ 衰老的HeLa细胞
   3. 在含5% CO₂的培养箱中，将e-plate插入板保持在37 °C₂ 孵育6小时以促进贴壁。
7. 共培养细胞
   1. 点击 暂停 细胞接种6小时后，轻柔地从e-plate view的每个孔中吸除培养基，以去除血清和未贴壁的细胞。
   2. 用预热至 37 °C 的 PBS 洗涤细胞孔 2 次。向 e-plate view 的每孔中加入 140 µL 无血清 DMEM。
   3. 取出e-plate小室，吸除培养基。用37 °C的PBS轻柔洗涤2次，每孔加入60 µL无血清DMEM。
   4. 将e-plate插入件置于e-plate观察区域，轻轻按压，直至插入件完全嵌入孔中。
   5. 将合并后的培养板插入实时细胞分析系统并点击 播放 使用软件以15分钟为间隔恢复对细胞指数值的实时监测图2).
   6. 实验时间结束后，关闭实时细胞分析系统图3A).
8. 在e-plate插件上成像细胞
   注意：由于e-plate插入式小室中带有膜，因此无法通过相差显微镜在膜上观察接种于此处的细胞。因此，为检测细胞在实验结束时是否仍保持活性以及衰老细胞是否维持其结构完整性，使用DAPI对细胞进行染色（图3B).
   1. 从e-plate观察板中取出e-plate插件。使用DAPI对e-plate插件中的细胞进行染色，并在荧光显微镜下检查细胞的存在情况。¹⁶已知衰老细胞的细胞核比正常细胞的细胞核更大。因此，根据DAPI染色后细胞的细胞核大小，判断哪个孔接种的是非衰老细胞，哪个孔接种的是衰老细胞。
9. 在 e-plate 视图中成像细胞
   1. 使用10倍物镜在相差显微镜下直接观察e-plate的视图（图3B由于在e-plate视图中每个孔的中央移除了四排微电极传感器，从而形成了空间6，以便通过显微镜监测细胞。
10. 数据分析
    1. 在将e-plate视图和e-plate插入件合并并插入实时细胞分析系统时，对该时间点的CI值进行归一化处理。
    2. 点击 数据分析 使用实时细胞分析系统获得的最大细胞指数和斜率数据，点击按钮以计算增殖速率和数量图2）。然后，使用适当的统计学软件分析数据（图3C，D).

2. 模型2：利用实时细胞分析系统进行条件培养基处理实验

1. 细胞培养与衰老诱导（第1-2天）
   1. 将35 × 10⁴个HeLa细胞接种至6孔板的每个孔中，每孔加入2.5 mL添加了10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养。
   2. 次日，更换为2.5 mL新鲜完全培养基，并直接向培养基中加入300 nM阿霉素处理细胞，以诱导细胞衰老。将6孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养72小时。
2. 非衰老细胞接种（第4天）
   1. 将35 × 10⁴个未经处理的HeLa细胞（非衰老对照组）接种至新的6孔板的每个孔中，每孔加入2.5 mL添加了10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的DMEM培养基，并在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中维持培养。
3. 按照步骤1.3所述方法确认细胞衰老的诱导效果。
4. 制备来自衰老和非衰老HeLa细胞的条件培养基
   1. 在相差显微镜下观察阿霉素处理的细胞（衰老细胞）和未处理的HeLa细胞（非衰老细胞）。显微镜下可见，衰老细胞的形态较正常细胞明显增大。
   2. 吸除两个6孔板（衰老和非衰老HeLa细胞）中的培养基，用预热至37 °C的PBS洗涤细胞两次，以去除残留血清和细胞碎片。
   3. 向每孔加入2 mL添加了青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的无血清DMEM培养基，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育48小时。
5. 收集并浓缩条件培养基（第7天）
   1. 在超净安全柜中将各孔的条件培养基收集至无菌离心管中。
   2. 用胰蛋白酶消化细胞，并使用血球计数板结合台盼蓝染色排除法计数细胞，以便将条件培养基按细胞数量进行归一化处理。
   3. 根据细胞数量对条件培养基进行归一化调整后，在无菌2 mL离心管中用添加了青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的无血清DMEM补足至终体积2 mL。
   4. 将收集的条件培养基在4 °C下以1,000 × g离心10分钟以去除细胞碎片，随后在4 °C下以10,000 × g离心10分钟，获得澄清的上清液。
   5. 使用2 mL超滤离心过滤装置，在 4 °C、3,000 × g条件下离心60分钟，浓缩条件培养基。此步骤可将2 mL条件培养基浓缩为5倍浓度的400 µL浓缩液。
   6. 在超净安全柜中，将获得的40 µL浓缩条件培养基用新鲜无血清培养基稀释，配制1x、2x和3x浓度的条件培养基至无菌离心管中。
      注：由于细胞在48小时内消耗导致原有培养基成分耗尽，因此收集并浓缩后的条件培养基需用新鲜培养基稀释后使用。
6. e-plate view中接种细胞
   1. 按照步骤1.1–1.4所述设置实时细胞分析系统。用预热的PBS洗涤非衰老HeLa细胞，随后吸除液体。
   2. 加入1 mL预热的0.05%胰蛋白酶溶液，将培养瓶置于37 °C孵育2分钟以使细胞脱落，然后加入5 mL添加了10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM中和胰蛋白酶。
   3. 在室温下以500 × g离心10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL添加了10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM中。
   4. 使用血球计数板结合台盼蓝染色排除法计数活细胞数量。
   5. 将非衰老HeLa细胞以每孔5 × 10³个细胞的密度接种至e-plate view的每个孔中，每孔体积为200 µL，含添加了10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM。
   6. 将e-plate view放入实时细胞分析系统的支架中，置于培养箱内使细胞贴附于孔板表面。
   7. 在程序设置中选择第二步，点击“Play”按钮，使用RTCA软件2.0开始阻抗测量（图2）。在非衰老HeLa细胞接种6小时后，点击软件中的“Pause”按钮（图2）。
   8. 轻柔吸除e-plate view各孔中的培养基，以去除血清和未贴壁细胞。用预热至37 °C的PBS洗涤孔壁两次。
   9. 将预热至37 °C的条件培养基加入相应分组：
      第1组：新鲜培养基
      第2组：1x非衰老HeLa细胞条件培养基
      第3组：2x非衰老HeLa细胞条件培养基
      第4组：3x非衰老HeLa细胞条件培养基
      第5组：1x衰老HeLa细胞条件培养基
      第6组：2x衰老HeLa细胞条件培养基
      ​第7组：3x衰老HeLa细胞条件培养基
   10. 将e-plate view重新插入实时细胞分析系统，点击Play按钮，恢复对细胞指数值的实时监测，每15分钟记录一次，持续48小时（图2）。
   11. 实验结束后关闭实时细胞分析系统（图4A）。
7. e-plate view中细胞成像
   1. 直接在相差显微镜下以10倍物镜观察e-plate view（图4B）。由于e-plate view每个孔中心区域移除了四排微电极传感器，从而留出空间可用于显微镜下细胞观察。
8. 数据分析
   1. 将非衰老HeLa细胞接受浓缩条件培养基处理时的细胞指数（CI）值进行归一化处理。
   2. 点击数据分析按钮，利用实时细胞分析系统获得的最大细胞指数和斜率数据计算细胞增殖速率和数量（图2）。随后使用适当的统计学软件对数据进行分析（图4C、D）。

3. 模型3：细胞间相互作用的实时监测

1. 细胞培养与衰老诱导（第1-2天）
   1. 将8 × 10⁵个HeLa细胞接种至含有5 mL添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的T25培养瓶中，并在37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养。
   2. 次日，更换为5 mL新鲜完全培养基，并直接向培养基中加入300 nM阿霉素处理细胞，以诱导细胞衰老。将T25培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中维持72小时。
2. 非衰老细胞接种（第4天）
   1. 将8 × 10⁵个GFP-HeLa细胞（非衰老对照）接种至新的T25培养瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的DMEM培养基，并在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中维持培养。
   2. 将8 × 10⁵个HeLa细胞（非衰老对照）接种至新的T25培养瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的DMEM培养基，并在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中维持培养。
3. 按照步骤1.3所述方法进行衰老诱导的确认（第5天）。
4. 共培养细胞
   1. 在接种细胞前，使用相差显微镜检查经阿霉素处理的细胞、未处理的GFP-HeLa细胞和未处理的HeLa细胞。显微镜下可见，衰老细胞的形态明显比正常细胞更大。
   2. 用5 mL预热的无菌PBS清洗三个T25培养瓶，吸除液体。每瓶加入1 mL预热的0.05%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育2分钟以使细胞脱落。
   3. 加入5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶。
   4. 将细胞悬液在室温下以500 × g离心10分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM培养基中。
   5. 使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板计数活细胞数量。将细胞以200 µL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的完全DMEM培养基接种。
   6. 将细胞接种至µ-slide 8孔高壁板，设置三种不同的实验组：
      第1组：7 × 10³个GFP-HeLa细胞
      第2组：18 × 10³个非衰老HeLa细胞 + 7 × 10³个GFP-HeLa细胞
      ​第3组：18 × 10³个衰老HeLa细胞 + 7 × 10³个GFP-HeLa细胞
   7. 将µ-slide置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育8小时，使细胞贴壁。8小时后，用预热PBS（37 °C）洗涤细胞两次，以消除血清对细胞的影响。
   8. 向每个孔中加入200 µL含青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的无血清DMEM培养基。
5. 显微镜设置
   1. 开启温度控制器和CO₂控制器，使载台式培养系统稳定30分钟。
   2. 手动检查CO₂浓度和温度设置，确保达到生理条件（5% CO₂，37 °C）。
   3. 开启倒置荧光显微镜，等待系统完成自校准。打开荧光光源，启动成像与分析软件以控制成像参数和图像采集。
6. 延时成像
   1. 将载玻片置于配备高分辨率数码相机的倒置荧光显微镜的载台式培养室中。打开软件，在采集设置中选择Part X, Y, Z, 和 T 模式并设定实验步骤（图5A）。
   2. 选择20倍物镜进行高对比度的荧光与相差成像（图5A）。添加相差和荧光（FITC滤光片）通道，以实现双模式成像（图5A）。
   3. 点击Live按钮启动活细胞成像，然后在相差模式下将目标细胞调至清晰对焦（图5A）。打开z轴层扫窗口，标记感兴趣区域的细胞位置（包含衰老/非衰老HeLa细胞及GFP-HeLa细胞）。使用自动载物台控制器在各孔之间移动，精确定位所选区域以进行位置标记（图5A）。
      注意：通过此方法，可在同一载玻片的单个孔中选择多个区域。
   4. 切换至荧光通道开始荧光成像。设置合适的曝光时间（89.506 ms）、增益（10）和强度（136）参数（图5A）。
      注意：这些参数根据表达荧光蛋白的细胞荧光强度而有所不同。
   5. 设置z轴层扫间隔（µm），确定顶部和底部位置，并在相差模式下配置z轴层扫（图5A）。点击Stop关闭实时成像功能。
   6. 使用“持续时间”和“时间间隔”字段设置延时成像的总时长（48小时）和时间间隔（30分钟）。
   7. 点击Start开始为期48小时的成像（图5A）。48小时后保存项目（图5A）。
   8. 在每个时间点（0小时和48小时），从z轴层扫中选择最佳焦平面图像并导出（图5A）。
   9. 分别在0小时和48小时计数GFP阳性细胞，计算GFP阳性细胞百分比的增加量，并使用适当的软件程序进行数据分析（图1D、E）。
7. 生成视频
   1. 点击Show Gallery，显示按时间点和z轴层扫层级组织的所有已捕获图像（图5B）。
   2. 对每个时间点，右键点击对应z轴层扫中的Best-focused Image，选择Select Thumbs in a Row。保存所选帧图像（图5B）。
   3. 对每个位置重复此过程。为辅助选择最清晰的图像，可使用“Find Best Focused Frames”功能。通过“Save Selected Frames”选项保存所选图像。保存的图像将自动上传至“Open Project”部分。
   4. 当图像序列完全加载后，右键点击Movie并选择Export Image。
   5. 在导出窗口中切换至Movie选项卡，设置所需的帧率（每秒帧数），根据需要选择比例尺、时间戳等附加选项，并通过Browse功能选择保存路径以完成导出（图5B、视频1、视频2和视频3）。

结果

本组代表性实验旨在研究衰老癌细胞产生的衰老相关分泌表型对其他癌细胞的潜在影响。因此，首先通过SA-β-Gal染色确认了72小时多柔比星处理是否可诱导HeLa细胞发生衰老。在衰老细胞中，溶酶体酶β-半乳糖苷酶即使在低pH条件下仍保持活性，并可裂解显色底物X-gal，形成蓝色沉淀¹⁷。因此，出现蓝色染色的细胞表明细胞衰老已被诱导。与对照组相比，多柔比星处理显著诱导了HeLa细胞的衰老，差异具有统计学意义，p < 0.0001。（图1A、B，n=3）。形态学分析还显示，与对照细胞相比，衰老细胞表现出更大且更扁平的形态。图1C显示，经多柔比星处理的HeLa细胞条件培养基中IL-6水平显著高于对照细胞，p < 0.0001。该结果也表明，多柔比星处理可诱导出明显的衰老相关分泌表型，提示细胞已进入衰老状态（

讨论

癌细胞与其微环境之间的动态相互作用对肿瘤进展至关重要，这会影响转移的诱导以及继发性肿瘤的形成。已有报道表明，衰老的癌细胞和间质细胞通过衰老细胞分泌的因子来调控肿瘤微环境⁴。这些因子可促进细胞增殖、迁移、侵袭和分化，并增强多药耐药性^4,13。因此，理解衰老相关分泌表型（SASP）对周围癌细胞的影响，对于认识肿瘤微环境具有重要意义。

在本研究中，采用三种不同方法评估了SASP因子在非衰老癌细胞中的潜在促增殖活性。第一种方法可通过监测细胞指数值来实时追踪细胞增殖情况。e-板视图允许在相位对比显微镜下，通过在任意选定的孵育时间点暂停记录，对靶细胞（非衰老细胞）进行详细的形态学评估。即使在获取图像后，仍可使用ImageJ等程序对这些靶细胞的形态特征（如细胞大小）进行分析，并比较各组之间可能存在的差异。然而，该方法的一个潜在局限性在于，由于下室中存在培养基，可能会稀释上室细胞所分泌的因子，从而导致预期效应无法被充分观察到。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-Slide 8 孔高	bidi	80806
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)	Gibco	25300-054
Amicon Ultra 离心滤过装置 (Ultracel-3K)	Millipore	UFC200324
CO2 培养箱 (37°C, 5% CO2)	Sanyo
CO2-Controller 2000	Pecon
DMEM	Gibco	41966-029
阿霉素	Tocris	2252
E-plate INSERT 16	ACEA Biosciences/Agilent	6 465 382 001
E-plate VIEW 16	ACEA Biosciences/Agilent	300 601 140
FBS	Gibco	A5256701
HeLa 细胞	AP Institute, Ankara, Turkey	HÜKÜK No: 90061901
Leica DMi8 倒置荧光显微镜	Leica
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	70011-044
衰老相关 β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 染色试剂盒	Cell Signalling	9860S
载台式培养系统	Pecon
Temp-controller 2002-2	Pecon
台盼蓝染料	Sigma	T8154
xCELLigence RTCA DP 系统	ACEA Biosciences/Agilent