本研究利用三种方法评估了衰老相关分泌表型（SASP）因子对非衰老HeLa细胞的增殖效应，这些因子来源于衰老的HeLa细胞 体外 具有实时监测功能的模型。系统比较了每种方法的优缺点，以更深入地理解癌症中的细胞间相互作用。
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摘要
摘要
化疗诱导的衰老癌细胞还会分泌多种因子，称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP），以调控其细胞外微环境。既往研究报道，这些SASP因子对周围细胞具有有害的旁分泌效应，包括促进细胞增殖、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、血管生成及细胞迁移。若干 体外 共培养技术被广泛用于研究通过将相同或不同类型的细胞共同培养而产生的细胞过程。在此，利用三种互补方法研究了衰老的HeLa细胞分泌的SASP因子对非衰老HeLa细胞的潜在促增殖作用 体外 方法。第一种方法通过共培养衰老细胞与非衰老细胞，研究由衰老相关分泌表型（SASP）介导的旁分泌信号。第二种方法收集衰老癌细胞的条件培养基，经浓缩后用于检测条件培养基对细胞增殖的影响，并通过实时监测评估其效应。第三种方法将衰老细胞与非衰老细胞并排培养，以评估SASP通过直接细胞间接触介导的邻分泌效应。这三种实验模型均一致表明，SASP因子显著促进非衰老癌细胞的增殖。值得注意的是，与对照组相比，衰老细胞共培养使增殖速率提高64.6%，而3倍浓缩的SASP条件培养基使增殖增加超过50%。基于荧光成像的结果显示，在邻分泌条件下，GFP阳性细胞数量增加了49.3%。这些方法共同实现了对SASP诱导的增殖变化进行定性与定量评估。对这三种方法的比较分析揭示了各自的优势与局限性，为深入理解衰老细胞的旁分泌效应提供了重要见解。
引言
在多细胞生物中，细胞通过旁分泌和邻分泌信号传导与微环境交换信息，从而影响彼此的行为。这种通讯可以直接通过隧道纳米管和间隙连接进行，也可以间接通过向细胞外基质分泌可溶性化学分子（如细胞因子、生长因子和趋化因子）来实现。这些信号传导机制在调控多种生理过程（包括组织发育和免疫细胞反应）中发挥关键作用，同时也参与多种疾病（如癌症、艾滋病、高血压和阿尔茨海默病）的发病机制1。
20世纪60年代，Leonard Hayflick发现正常人类成纤维细胞在体外具有有限的复制能力in vitro2。由于端粒随细胞分裂逐渐缩短而导致的这种有限增殖状态被称为复制性衰老。后续研究表明，多种类型的细胞应激也可触发细胞衰老。研究已证实，常见的癌症治疗方法（如化疗和放疗）同样可在癌细胞和基质细胞中诱导细胞衰老，这一现象被称为治疗诱导性衰老3,4。细胞衰老与机体衰老是具有层级关系但彼此不同的生物学过程。衰老细胞在机体内的累积通过促进炎症反应、组织功能障碍以及年龄相关疾病的发生而推动衰老进程。然而，与细胞衰老相比，衰老涉及更广泛的系统性事件和机制5。
衰老细胞的特征是细胞质扩张，....
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方案
注意：所有细胞培养操作均须在二级以上生物安全水平（BSL2+）条件下，于经认证的生物安全柜内进行。阿霉素是一种危险的化疗药物，所有操作必须在经认证的二级以上生物安全水平（BSL2+）安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服和手套。所有含有阿霉素的废弃物，包括培养基和固定液，均应收集于指定且明确标识的危险废物容器中，并通过机构的危险废物管理系统进行处置。
1. 模型1：使用实时细胞分析系统进行共培养
- 细胞培养与衰老诱导（第1-2天）
- 接种 8 × 105 将HeLa细胞接种至含有5 mL添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 µg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的T25培养瓶中，于37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养2.
- 次日，将细胞培养基更换为5 mL新鲜完全培养基。通过直接向培养基中加入300 nM阿霉素处理细胞，以诱导细胞衰老。将T25培养瓶置于含5% CO₂的培养箱中继续培养。2 37 °C 下孵育 72 小时。
- 非衰老细胞接种（第4天）
- 种子 8 x 105 未处理的HeLa细胞（非衰老对照）接种于新的T25培养瓶中，加入5 mL DME....
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结果
本组代表性实验旨在研究衰老癌细胞产生的衰老相关分泌表型对其他癌细胞的潜在影响。因此，首先通过SA-β-Gal染色确认了72小时多柔比星处理是否可诱导HeLa细胞发生衰老。在衰老细胞中，溶酶体酶β-半乳糖苷酶即使在低pH条件下仍保持活性，并可裂解显色底物X-gal，形成蓝色沉淀17。因此，出现蓝色染色的细胞表明细胞衰老已被诱导。与对照组相比，多柔比星处理显著诱导了HeLa细胞的衰老，差异具有统计学意义，p < 0.0001。（图1A、B，n=3）。形态学分析还显示，与对照细胞相比，衰老细胞表现出更大且更扁平的形态。图1C显示，经多柔比星处理的HeLa细胞条件培养基中IL-6水平显著高于对照细胞，p < 0.0001。该结果也表明，多柔比星处理可诱导出明显的衰老相关分泌表型，提示细胞已进入衰老状态（
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讨论
癌细胞与其微环境之间的动态相互作用对肿瘤进展至关重要，这会影响转移的诱导以及继发性肿瘤的形成。已有报道表明，衰老的癌细胞和间质细胞通过衰老细胞分泌的因子来调控肿瘤微环境4。这些因子可促进细胞增殖、迁移、侵袭和分化，并增强多药耐药性4,13。因此，理解衰老相关分泌表型（SASP）对周围癌细胞的影响，对于认识肿瘤微环境具有重要意义。
在本研究中，采用三种不同方法评估了SASP因子在非衰老癌细胞中的潜在促增殖活性。第一种方法可通过监测细胞指数值来实时追踪细胞增殖情况。e-板视图允许在相位对比显微镜下，通过在任意选定的孵育时间点暂停记录，对靶细胞（非衰老细胞）进行详细的形态学评估。即使在获取图像后，仍可使用ImageJ等程序对这些靶细胞的形态特征（如细胞大小）进行分析，并比较各组之间可能存在的差异。然而，该方法的一个潜在局限性在于，由于下室中存在培养基，可能会稀释上室细胞所分泌的因子，从而导致预期效应无法被充分观察到。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加齐大学科学项目部（资助编号：TOA-2021-7321）和土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK，资助编号：122S564 和 223S969）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-Slide 8 孔高 |  bidi | 80806 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Amicon Ultra 离心滤过装置 (Ultracel-3K) | Millipore | UFC200324 | |
| CO2 培养箱 (37°C, 5% CO2) | Sanyo | ||
| CO2-Controller 2000 | Pecon | ||
| DMEM | Gibco | 41966-029 | |
| 阿霉素 | Tocris | 2252 | |
| E-plate INSERT 16 | ACEA Biosciences/Agilent | 6 465 382 001 | |
| E-plate VIEW 16 | ACEA Biosciences/Agilent | 300 601 140 | |
| FBS | Gibco | A5256701 | |
| HeLa 细胞 |  AP Institute, Ankara, Turkey | HÜKÜK No: 90061901 | |
| Leica DMi8 倒置荧光显微镜 | Leica | ||
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | 70011-044 | |
| 衰老相关 β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 染色试剂盒 | Cell Signalling | 9860S | |
| 载台式培养系统 | Pecon | ||
| Temp-controller 2002-2 | Pecon | ||
| 台盼蓝染料 | Sigma | T8154 | |
| xCELLigence RTCA DP 系统 | ACEA Biosciences/Agilent |
参考文献
- Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).....
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重印与许可
