方法文章

利用Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳揭示磷酸化修饰 体外 激酶活性检测

DOI：

10.3791/68884

⸱

2025年8月8日

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了在临床样本中利用Phos-tag凝胶电泳检测目标蛋白磷酸化修饰变化的实验步骤 体外 激酶活性检测

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

磷酸化是一种经典的翻译后修饰，可调控蛋白质功能。蛋白质通常包含多个潜在的磷酸化位点，这些位点可在不同位置被多种激酶修饰。在疾病中研究靶蛋白的磷酸化变化通常需要使用磷酸化位点特异性抗体。然而，商业化的抗体可能仅针对单一修饰位点，或完全不可获得。本文介绍一种利用Phos-tag凝胶电泳检测临床样本中靶蛋白磷酸化修饰变化的方法，并通过后续分析鉴定具体的磷酸化位点。 体外 激酶活性检测。结合Phos-tag的磷酸化蛋白在SDS-PAGE凝胶电泳中迁移速率较慢，可通过缓慢迁移条带的平均像素强度对疾病组织中磷酸化水平的变化进行半定量分析。通过将Phos-tag SDS-PAGE与针对多种候选蛋白的广谱特异性抗体免疫印迹相结合，研究人员可高效鉴定出发生磷酸化改变的靶蛋白。在完成候选激酶的筛选后， 体外 激酶活性检测使用靶蛋白进行，所得磷酸化产物通过质谱分析以精确定位磷酸化位点。该方法无需特异性磷酸化蛋白抗体，可对组织样本进行大规模筛选，从而鉴定疾病中的异常磷酸化状态。此外，所鉴定的磷酸化位点可用于开发特异性抗体，以在疾病组织中进行定量和定位分析，进一步揭示其功能作用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

磷酸化是一种关键的翻译后修饰，可调节蛋白质的亚细胞定位、激酶活性以及转录活性。在人类基因组中已发现超过500个蛋白激酶基因，这些基因参与信号转导、基因表达以及蛋白质-蛋白质相互作用1。磷酸化与去磷酸化过程由多种激酶调控，具有快速可逆性，能够调节细胞黏附、细胞增殖和细胞分化2。然而，异常的蛋白质磷酸化修饰与多种人类疾病相关，包括肿瘤发生、自身免疫性疾病、神经退行性疾病以及生育力低下3,4,5。

临床样本的磷酸化蛋白质组学分析可获得多个差异磷酸化蛋白候选分子6。为了揭示人类疾病中的关键磷酸化修饰，亟需一种简便且高效的方法来检测特定靶蛋白的磷酸化状态。不同位点的磷酸化可能导致蛋白质功能发生不同的改变。因此，使用针对特定氨基酸位点的磷酸化特异性抗体无疑是检测蛋白磷酸化变化的最佳方法。然而，许多蛋白尚缺乏经过充分验证的磷酸化特异性抗体。此外，还需要更合适的方法来鉴定潜在的新型磷酸化位点。特定氨基酸残基的磷酸化常会改变蛋白质在凝胶电泳中的迁移速率，迁移较慢的条带可反映磷酸化状态的变化7。但这类迁移率变化通常较为微弱，难以分辨。Phos-tag 是一种以碱性磷酸酶催化结构域为模板设计合成的化学化合物，能够特异性结合磷酸化的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸以及组氨酸/天冬氨酸/赖氨酸残基。因此，Phos-tag 结合技术可有效放大磷酸化与非磷酸化蛋白之间的迁移速率差异，同时还能区分磷酸化位点数量的不同8。

基于Phos-tag的组织样本中目标蛋白磷酸化变化检测方法相较于传统方法具有显著优势。关键在于，该方法无需使用磷酸化特异性抗体，而是采用常规的免疫印迹级蛋白特异性抗体进行检测。在Phos-tag SDS-PAGE过程中，目标蛋白的磷酸化与非磷酸化形式可分离为不同的条带，从而通过比较条带强度，对疾病状态下磷酸化水平的变化进行半定量分析。本实验方案的工作流程包括：（1）蛋白样本的Phos-tag SDS-PAGE分离，（2）磷酸化目标蛋白的免疫印迹检测，（3） 体外 使用候选激酶进行激酶活性检测，并通过磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体验证。随后的质谱分析（由外部服务平台完成）用于鉴定磷酸化位点，从而实现位点特异性抗体的开发；该详细方法未包含在本实验方案中。值得注意的是，该方法已成功应用于临床样本中Nur77磷酸化变化的检测，鉴定了Mst1激酶为Nur77磷酸化的上游调控因子，并开发了针对Nur77苏氨酸366位点磷酸化的位点特异性磷酸化抗体，用于临床样本中该位点磷酸化的检测。9因此，这种方法在初步研究阶段尤为有价值，当需要同时分析多个候选蛋白时，可利用 commercially available 抗体对大量靶标蛋白的磷酸化状态变化进行高通量筛选。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

南京鼓楼医院伦理委员会批准了本项人体研究（2013-408081-01）。本实验方案以子宫内膜组织作为代表性模型建立。经过适当优化后，该方法可拓展应用于其他临床标本，包括但不限于肿瘤组织的蛋白质提取及后续分析。子宫内膜活检取自生育期女性（对照组）及反复胚胎着床失败女性的分泌中期子宫内膜组织体外 受精-胚胎移植（疾病组）。所有患者在采样前均签署了知情同意书。所用试剂和设备列于下文 材料表.

1. 样品制备

  1. 用预冷的 PBS 将获取的新鲜组织样本冲洗两次，以去除血细胞，并将约 100 mg 组织分离至 1.5 mL 离心管中。
  2. 将组织置于含有 1 mL 组织蛋白裂解液（150.0 mmol/L NaCl、1.0% NP-40、50.0 mmol/L Tris pH 8.0、0.5% 脱氧胆酸钠、蛋白酶抑制剂混合物以及磷酸酶抑制剂混合物 2 和 3）的 2 mL 圆底研磨管中。
  3. 将高速组织分散器的速度设置为 5 级（共 6 级），研磨组织 10 秒，随后在冰上孵育 30 秒。重复此过程 5 次，得到组织匀浆液。
  4. 在 4 °C 条件下，将匀浆液于摇床上缓慢旋转裂解 30 分钟，然后在 4 °C、13,000 × g 条件下离心 10 分钟，收集上清液。
  5. 采用 BCA 法测定蛋白浓度。
  6. 取总量为 300 µg 的蛋白，调整至相同体积后，与 4× Laemmli 蛋白上样缓冲液混合。于 95 °C 加热 8 分钟使蛋白变性，冷却至室温后上样进行后续分析。
    注意：在步骤 2 之前，建议使用总抗体通过常规 Western 印迹分析检测目标蛋白，以评估其表达水平。

2. Phos-tag SDS-PAGE 胶的制备

  1. 通过加入29.0 g丙烯酰胺和1.0 g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，配制100 mL 30% w/v丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液。
    注意：4 °C避光保存。
  2. 配制1.5 mol/L Tris-HCl溶液（pH 8.8）、0.5 mol/L Tris-HCl溶液（pH 6.8）、10% w/v SDS溶液和10% w/v过硫酸铵溶液，用于常规SDS-PAGE。
  3. 配制专用于Phos-tag SDS-PAGE凝胶的5.0 mmol/L Phos-tag溶液和10 mmol/L MnCl2溶液。
  4. 配制分离胶溶液，若需制备含50 µM Phos-tag溶液和100 µM MnCl2的10 mL 6% w/v聚丙烯酰胺凝胶，则混合以下组分：2 mL 30% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合溶液、2.5 mL 1.5 mol/L Tris/HCl溶液（pH 8.8）、0.1 mL 5.0 mmol/L Phos-tag溶液、0.1 mL 10 mmol/L MnCl2溶液、0.1 mL 10% (w/v) SDS溶液、10 µL TEMED和5.14 mL蒸馏水。
  5. 轻轻涡旋振荡已配制的分离胶溶液以确保均匀，然后将装有凝胶溶液的离心管置于真空干燥器中，在0.1 MPa真空条件下抽气2分钟，直至无可见气泡。
  6. 加入50 µL 10%过硫酸铵，轻轻但充分混匀。
  7. 立即用移液器将溶液注入组装好的凝胶夹心中，液面升至短玻璃板顶部边缘下方约1 cm处。避免引入气泡。
  8. 小心地在凝胶表面覆盖0.5 mL蒸馏水，以隔绝空气并确保界面平整。室温下静置聚合20–30分钟。
  9. 同时，通过混合以下组分配制标准Tris-HCl缓冲浓缩胶（4.5% w/v聚丙烯酰胺凝胶）溶液：0.6 mL 30% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合溶液、1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl溶液（pH 6.8）、40 µL 10% (w/v) SDS溶液、4 µL TEMED和2.33 mL蒸馏水。轻轻涡旋振荡并进行脱气处理。
  10. 确认凝胶已完全凝固（倾斜凝胶夹心观察上层液体流动情况，同时确认中间界面固定不动）。小心倾去上层水相，并彻底沥干。
  11. 向已配制的浓缩胶溶液中加入20 µL 10%过硫酸铵，轻轻混匀后立即加至分离胶上方。
  12. 小心插入10孔或15孔梳子至浓缩胶溶液中，避免产生气泡。室温下静置聚合10分钟。
    注意：务必在使用前新鲜配制凝胶。请针对每种目标蛋白优化Phos-tag和丙烯酰胺的浓度。

3. Phos-tag SDS-PAGE 电泳

  1. 组装电泳设备，并用电泳缓冲液（Tris/Glycine/SDS 运行缓冲液）填充电极室。
  2. 使用微量移液器将每孔加入 30 µg 蛋白质样品。
  3. 在恒定电流条件下（30 mA/胶）进行电泳，直至溴酚蓝迁移至分离胶底部。
  4. 将凝胶浸入不含甲醇的 SDS-PAGE 转膜缓冲液（含 5 mM EDTA）中，每次 10 分钟，重复两次，以去除二价阳离子。
  5. 使用湿式/槽式转膜系统，在 90 V 条件下转膜 90 分钟，将蛋白质转移至 PVDF 膜上。

4. 免疫印迹与分析

  1. 用5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白粉末（溶于1×Tris-硼酸-氯化钠-Tween-20溶液，TBST）在室温下封闭膜1小时。
  2. 将针对目标蛋白的一抗按适当比例稀释后，于4 °C与膜孵育过夜。
  3. 用TBST在室温下轻轻振荡洗涤膜3次，每次10分钟。
  4. 将膜与HRP标记的二抗在室温下孵育1小时。
  5. 用TBST在室温下轻轻振荡洗涤膜3次，每次10分钟。
  6. 在避光条件下加入增强型化学发光底物孵育1分钟，随后进行曝光。
  7. 使用自动凝胶成像系统采集图像，并利用ImageJ软件对目标条带（缓慢迁移的磷酸化目标蛋白和快速迁移的非磷酸化目标蛋白）的灰度强度进行定量。
    注意：Phos-Tag凝胶的Western印迹不能用于分子量的确定。
  8. 计算每个样本中缓慢迁移的磷酸化条带与快速迁移的非磷酸化条带的比值，并分析各组间磷酸化百分比的统计学差异。

5. 目标蛋白的免疫沉淀

  1. 构建编码带有FLAG标签（或其他表位标签，包括但不限于HA、GFP、GST或His）的靶蛋白野生型或位点特异性磷酸化突变体的表达质粒。
  2. 按照制造商的说明，使用Lipofectamine 3000将表达质粒转染至HEK293细胞中。
  3. 按照步骤1所述方法，用1 mL组织蛋白裂解缓冲液裂解细胞，以提取蛋白上清液。
  4. 将上清液与20 µL Anti-FLAG M2亲和凝胶在4 °C下旋转孵育过夜。
  5. 离心（1000 × g，3分钟），收集琼脂糖珠，并用10柱体积的TBS洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质。
  6. 将FLAG肽溶解于TBS中，终浓度为100 µg/mL。
  7. 通过加入五次单柱体积的FLAG肽溶液（每20 µL琼脂糖珠使用100 µL溶液），在轻柔混匀条件下孵育5–10分钟，进行竞争性洗脱，从而从Anti-FLAG M2亲和凝胶上洗脱结合的FLAG融合蛋白。
  8. 离心（1000 × g，3分钟），收集上清液。
    注意：若已知激酶，则继续进行步骤6；否则，在进入步骤6之前，应首先通过酵母双杂交筛选或生物信息学预测（例如使用PhosphositePlus或Group-based Prediction System）鉴定潜在的激酶。

6. 体外 激酶活性检测以鉴定磷酸化氨基酸

  1. 准备激酶缓冲液（每反应 30 µL）：40 mM HEPES pH 7.6，10 mM MgCl2，1 mM EGTA，1 mM DTT，2.5 mM β-甘油磷酸钠，200 µM ATP，100 ng 活性激酶，免疫沉淀的 FLAG 融合蛋白。
  2. 在 30 °C 下于恒温混匀仪中孵育 30 分钟，轻柔振荡。
  3. 加入 10 µL 4× Laemmli 缓冲液终止反应，并在 95 °C 变性 5 分钟。
  4. 对经活性激酶处理或未处理的免疫沉淀 FLAG 融合蛋白进行常规 SDS-PAGE 电泳。
  5. 使用抗磷酸化苏氨酸抗体和抗磷酸化丝氨酸抗体检测磷酸化氨基酸位点；以抗 FLAG 抗体作为对照（见材料表）。
  6. 按照步骤 4 所述方法完成免疫印迹及分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对对照组和疾病组的人类样本进行初步磷酸化蛋白质组学分析，发现 Nur77 是一种候选的差异磷酸化蛋白。为评估 Phos-tag SDS-PAGE 在检测 Nur77 蛋白磷酸化方面的有效性，进行了 Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE 实验。从组织样本中提取总蛋白后，将 30 µg 蛋白上样并经 Mn2+-Phos-tag 凝胶电泳分离，随后转移至 PVDF 膜。使用 Nur77 一抗和 HRP 标记的山羊抗兔二抗进行免疫印迹，并通过 ECL 化学发光法检测。观察到两条明显不同的条带（图 1A）。迁移较快的条带（下方）代表非磷酸化的 Nur77；迁移较慢的条带（上方）代表磷酸化的 Nur77。半定量分析显示，与对照组相比，不育组中磷酸化 Nur77 与非磷酸化 Nur77 的比值显著降低（图 1B），提示在疾病状态下 Nur77 的磷酸化受到损害。

为了验证基于 Phos-tag 方法的可靠性，我们采用质谱分析进...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于Phos-tag的临床组织中靶蛋白磷酸化变化检测方法在蛋白质磷酸化研究中具有显著优势。由于Phos-tag的结合，磷酸化蛋白的电泳迁移率降低，从而能够在无需磷酸化特异性抗体的情况下，对候选蛋白的磷酸化状态进行高通量筛选。这对于多个候选蛋白的初步大规模分析尤为重要。具有异常磷酸化修饰的蛋白可被优先选中，用于后续的in vitro激酶实验，以鉴定特异性的磷酸化位点。

尽管Phos-tag SDS-PAGE的样品制备与常规Western印迹法有相似之处，但仍需注意若干关键的技术要点。在样品处理过程中必须避免使用含EDTA的试剂，因为EDTA会螯合对Phos-tag功能至关重要的Mn2+或Zn2+离子。然而，在电泳结束后、转膜前，必须将凝胶置于含有10 mM EDTA的转移缓冲液中孵育，以去除残留的Mn2+或Zn2+离子，否则会严重降低蛋白质的转膜效率。

Phos-tag SDS-PAGE 胶的制备需要仔细优化。Phos-ta...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作受到国家自然科学基金（82271698）和江苏省自然科学基金（BK20231117）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% SDS 溶液Sangon BiotechB548118
10x Tris/Glycine/SDSBIO-RAD1610732
4×  Laemmli 蛋白样品缓冲液BIO-RAD1610747
丙烯酰胺Sangon BiotechA601032
过硫酸铵Sangon BiotechA100486
Anti-FLAG M2 亲和凝胶MilliporeA2220
增强型化学发光试剂盒ThermoFisher32106
FLAG 抗体CST14793
FLAG 肽MilliporeF3290
HRP 标记的二抗Bioworld TechnologyBS13278
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015
Mini Trans-Blot 转膜装置BIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽BIO-RAD1658005
Mst1 抗体CST3682
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺Sangon BiotechA600025
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）Sangon BiotechA610508
Nur77 抗体CST3960
磷酸酶抑制剂混合物 2SigmaP5726用于抑制酪氨酸蛋白磷酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶
磷酸酶抑制剂混合物 3SigmaP0044用于抑制蛋白磷酸酶 2A、碱性磷酸酶、蛋白磷酸酶 1 和 2A
磷酸化丝氨酸抗体SigmaP5747
磷酸化苏氨酸抗体SigmaP6623
Phos-tag 丙烯酰胺Wako304-93526用于制备 Phos-tag SDS-PAGE 凝胶
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒Thermo 23227
蛋白酶抑制剂混合物SigmaS8830无 EDTA，片剂，用于抑制丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶
PVDF 膜 Roche3010040001
ThermoMixer 恒温混匀仪Eppendorf2231001127
组织匀浆分散器IKAT 10 用于制备组织匀浆
Tris-HCl 缓冲液（0.5 M，pH 6.8）Sangon BiotechB546020
Tris-HCl 缓冲液（1.5 M，pH 8.8）Sangon BiotechB546019
真空干燥器ThermoFisher5311-0250用于脱气凝胶溶液
β-巯基乙醇SigmaM3148

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation and dephosphorylation. Cell Biosci. 6, 25(2016).
  3. Pang, K., et al. Role of protein phosphorylation in cell signaling, disease, and the intervention therapy. MedComm. 3 (4), e175(2022).
  4. Bollu, L. R., Mazumdar, A., Savage, M. I., Brown, P. H. Molecular Pathways: Targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res. 23 (9), 2136-2142 (2017).
  5. Martin, L., et al. Tau protein kinases: involvement in Alzheimer's disease. Ageing Res Rev. 12 (1), 289-309 (2013).
  6. Bhardwaj, S., et al. Integrating the analysis of human biopsies using post-translational modifications proteomics. Protein Sci. 33 (4), e4979(2024).
  7. Kristjansdottir, K., Wolfgeher, D., Lucius, N., Angulo, D. S., Kron, S. J. Phosphoprotein profiling by PA-GeLC-MS/MS. J Proteome Res. 7 (7), 2812-2824 (2008).
  8. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  9. Cai, X., et al. Mst1-mediated phosphorylation of Nur77 improves the endometrial receptivity in human and mice. EBioMedicine. 88, 104433(2023).
  10. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics. 11 (2), 319-323 (2011).
  11. Shih, H. H., et al. An ultra-specific avian antibody to phosphorylated tau protein reveals a unique mechanism for phosphoepitope recognition. J Biol Chem. 287 (53), 44425-44434 (2012).
  12. Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay. J Vis Exp. (135), e57674(2018).
  13. Mehla, J., Caufield, J. H., Uetz, P. Mapping protein-protein interactions using yeast two-hybrid assays. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (5), 442-452 (2015).
  14. Ayati, M., Yilmaz, S., Blasco Tavares Pereira Lopes, F., Chance, M., Koyuturk, M. Prediction of kinase-substrate associations using the functional landscape of kinases and phosphorylation sites. Pac Symp Biocompu. 28, 73-84 (2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章