方法文章

利用Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳揭示磷酸化修饰 体外 激酶活性检测

DOI：

10.3791/68884

⸱

2025年8月8日

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

本文内容

摘要

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本方案描述了在临床样本中利用Phos-tag凝胶电泳检测目标蛋白磷酸化修饰变化的实验步骤 体外 激酶活性检测

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

磷酸化是一种经典的翻译后修饰，可调控蛋白质功能。蛋白质通常包含多个潜在的磷酸化位点，这些位点可在不同位置被多种激酶修饰。在疾病中研究靶蛋白的磷酸化变化通常需要使用磷酸化位点特异性抗体。然而，商业化的抗体可能仅针对单一修饰位点，或完全不可获得。本文介绍一种利用Phos-tag凝胶电泳检测临床样本中靶蛋白磷酸化修饰变化的方法，并通过后续分析鉴定具体的磷酸化位点。 体外 激酶活性检测。结合Phos-tag的磷酸化蛋白在SDS-PAGE凝胶电泳中迁移速率较慢，可通过缓慢迁移条带的平均像素强度对疾病组织中磷酸化水平的变化进行半定量分析。通过将Phos-tag SDS-PAGE与针对多种候选蛋白的广谱特异性抗体免疫印迹相结合，研究人员可高效鉴定出发生磷酸化改变的靶蛋白。在完成候选激酶的筛选后， 体外 激酶活性检测使用靶蛋白进行，所得磷酸化产物通过质谱分析以精确定位磷酸化位点。该方法无需特异性磷酸化蛋白抗体，可对组织样本进行大规模筛选，从而鉴定疾病中的异常磷酸化状态。此外，所鉴定的磷酸化位点可用于开发特异性抗体，以在疾病组织中进行定量和定位分析，进一步揭示其功能作用。

引言

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磷酸化是一种关键的翻译后修饰，可调节蛋白质的亚细胞定位、激酶活性以及转录活性。在人类基因组中已发现超过500个蛋白激酶基因，这些基因参与信号转导、基因表达以及蛋白质-蛋白质相互作用1。磷酸化与去磷酸化过程由多种激酶调控，具有快速可逆性，能够调节细胞黏附、细胞增殖和细胞分化2。然而，异常的蛋白质磷酸化修饰与多种人类疾病相关，包括肿瘤发生、自身免疫性疾病、神经退行性疾病以及生育力低下3,4,5。

临床样本的磷酸化蛋白质组学分析可获得多个差异磷酸化蛋白候选分子6。为了揭示人类疾病中的关键磷酸化修饰，亟需一种简便且高效的方法来检测特定靶蛋白的磷酸化状态。不同位点的磷酸化可能导致蛋白质功能发生不同的改变。因此，使用针对特定氨基酸位点的磷酸化特异性抗体无疑是检测蛋白磷酸化变化的最佳方法。然而，许多蛋白尚缺乏经过充分验证的磷酸化特异性抗体。此外，还需要更合适的方法来鉴定潜在的新型磷酸化位点。特定氨基酸残基的磷酸化常会改变蛋白质在凝胶电泳中的迁移速率，迁移较慢的条带可反映磷酸化状态的变化7。但这类迁移率变化通常较为微弱....

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方案

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南京鼓楼医院伦理委员会批准了本项人体研究（2013-408081-01）。本实验方案以子宫内膜组织作为代表性模型建立。经过适当优化后，该方法可拓展应用于其他临床标本，包括但不限于肿瘤组织的蛋白质提取及后续分析。子宫内膜活检取自生育期女性（对照组）及反复胚胎着床失败女性的分泌中期子宫内膜组织体外 受精-胚胎移植（疾病组）。所有患者在采样前均签署了知情同意书。所用试剂和设备列于下文 材料表.

1. 样品制备

  1. 用预冷的 PBS 将获取的新鲜组织样本冲洗两次，以去除血细胞，并将约 100 mg 组织分离至 1.5 mL 离心管中。
  2. 将组织置于含有 1 mL 组织蛋白裂解液（150.0 mmol/L NaCl、1.0% NP-40、50.0 mmol/L Tris pH 8.0、0.5% 脱氧胆酸钠、蛋白酶抑制剂混合物以及磷酸酶抑制剂混合物 2 和 3）的 2 mL 圆底研磨管中。
  3. 将高速组织分散器的速度设置为 5 级（共 6 级），研磨组织 10 秒，随后在冰上孵育 30 秒。重复此过程 5 次，得到组织匀浆液。
  4. 在 4 °C 条件下，将匀浆液于摇床上缓慢旋转裂解 30 分钟，然后在 4 °C、13,000 × g 条件下离心 10 分钟，收集上清液。
  5. 采用 BCA 法测定蛋白浓....

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结果

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对对照组和疾病组的人类样本进行初步磷酸化蛋白质组学分析，发现 Nur77 是一种候选的差异磷酸化蛋白。为评估 Phos-tag SDS-PAGE 在检测 Nur77 蛋白磷酸化方面的有效性，进行了 Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE 实验。从组织样本中提取总蛋白后，将 30 µg 蛋白上样并经 Mn2+-Phos-tag 凝胶电泳分离，随后转移至 PVDF 膜。使用 Nur77 一抗和 HRP 标记的山羊抗兔二抗进行免疫印迹，并通过 ECL 化学发光法检测。观察到两条明显不同的条带（图 1A）。迁移较快的条带（下方）代表非磷酸化的 Nur77；迁移较慢的条带（上方）代表磷酸化的 Nur77。半定量分析显示，与对照组相比，不育组中磷酸化 Nur77 与非磷酸化 Nur77 的比值显著降低（图 1B），提示在疾病状态下 Nur77 的磷酸化受到损害。

为了验证基于 Phos-tag 方法的可靠性，我们采用质谱分析进.......

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讨论

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基于Phos-tag的临床组织中靶蛋白磷酸化变化检测方法在蛋白质磷酸化研究中具有显著优势。由于Phos-tag的结合，磷酸化蛋白的电泳迁移率降低，从而能够在无需磷酸化特异性抗体的情况下，对候选蛋白的磷酸化状态进行高通量筛选。这对于多个候选蛋白的初步大规模分析尤为重要。具有异常磷酸化修饰的蛋白可被优先选中，用于后续的in vitro激酶实验，以鉴定特异性的磷酸化位点。

尽管Phos-tag SDS-PAGE的样品制备与常规Western印迹法有相似之处，但仍需注意若干关键的技术要点。在样品处理过程中必须避免使用含EDTA的试剂，因为EDTA会螯合对Phos-tag功能至关重要的Mn2+或Zn2+离子。然而，在电泳结束后、转膜前，必须将凝胶置于含有10 mM EDTA的转移缓冲液中孵育，以去除残留的Mn2+或Zn2+离子，否则会严重降低蛋白质的转膜效率。

Phos-tag SDS-PAGE 胶的制备需要仔细优化。Phos-ta.......

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披露

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作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

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本工作受到国家自然科学基金（82271698）和江苏省自然科学基金（BK20231117）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% SDS 溶液Sangon BiotechB548118
10x Tris/Glycine/SDSBIO-RAD1610732
4×  Laemmli 蛋白样品缓冲液BIO-RAD1610747
丙烯酰胺Sangon BiotechA601032
过硫酸铵Sangon BiotechA100486
Anti-FLAG M2 亲和凝胶MilliporeA2220
增强型化学发光试剂盒ThermoFisher32106
FLAG 抗体CST14793
FLAG 肽MilliporeF3290
HRP 标记的二抗Bioworld TechnologyBS13278
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015
Mini Trans-Blot 转膜装置BIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽BIO-RAD1658005
Mst1 抗体CST3682
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺Sangon BiotechA600025
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）Sangon BiotechA610508
Nur77 抗体CST3960
磷酸酶抑制剂混合物 2SigmaP5726用于抑制酪氨酸蛋白磷酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶
磷酸酶抑制剂混合物 3SigmaP0044用于抑制蛋白磷酸酶 2A、碱性磷酸酶、蛋白磷酸酶 1 和 2A
磷酸化丝氨酸抗体SigmaP5747
磷酸化苏氨酸抗体SigmaP6623
Phos-tag 丙烯酰胺Wako304-93526用于制备 Phos-tag SDS-PAGE 凝胶
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒Thermo 23227
蛋白酶抑制剂混合物SigmaS8830无 EDTA，片剂，用于抑制丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶
PVDF 膜 Roche3010040001
ThermoMixer 恒温混匀仪Eppendorf2231001127
组织匀浆分散器IKAT 10 用于制备组织匀浆
Tris-HCl 缓冲液（0.5 M，pH 6.8）Sangon BiotechB546020
Tris-HCl 缓冲液（1.5 M，pH 8.8）Sangon BiotechB546019
真空干燥器ThermoFisher5311-0250用于脱气凝胶溶液
β-巯基乙醇SigmaM3148

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation ....

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