本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S. cerevisiae）中依赖于细胞周期的过程。
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本文内容
摘要
摘要
真核细胞遵循一种保守的细胞周期，该周期调控着包括DNA维持和细胞器稳态在内的多种过程。为了正确解读实验结果，通常需要以依赖于细胞周期的方式研究细胞过程。目前已有一系列化学和遗传方法可用于在多种生物体（包括脊椎动物模型）的培养细胞中实现细胞周期同步，从而便于研究依赖于细胞周期的过程。然而，在模式生物中，芽殖酵母因其高效的同步化方法、较短的世代时间以及良好的遗传操作性，仍然是进行细胞周期分析的强大工具。酵母与其它真核生物共享核心的细胞周期调控机制，这使其在细胞周期调控研究中取得了多项里程碑式的发现。本实验方案详细介绍了酵母细胞周期分析的方法，重点介绍G1期阻滞-释放和有丝分裂阻滞-释放实验，内容涵盖菌株构建、培养物准备以及显微镜观察。文中提供了通过PCR标记方法构建适用于细胞周期阻滞和荧光显微镜观察的酵母菌株的技术。利用肽类信息素α-factor可实现G1期阻滞，短暂洗涤后即可实现同步释放并进入细胞周期进程。在释放后不同时间点取样，并固定用于显微观察。第二种方法通过耗竭细胞周期调控因子Cdc20使酵母细胞阻滞于有丝分裂期，获得处于中期的细胞群体，并可选择性地释放进入后期。样品在释放前后均被固定并制备用于成像，随后进行显微成像与分析。图像分析主要关注蛋白质在细胞周期中动态定位及群体丰度变化的系统记录。这些同步化方法适用于多种细胞周期操控实验；尽管本文重点强调其在固定细胞成像中的应用，但也可根据需要调整用于其他多种分析，包括活细胞成像以及生物化学和分子生物学检测。
引言
真核细胞的分裂通过一个称为细胞周期的程序进行高度调控。细胞周期中发生的高度保守且动态的过程，不仅其本身具有重要的研究价值，而且对其他细胞生物学过程的研究也具有广泛的影响。例如，许多细胞器在细胞分裂过程中会发生显著的重塑，且许多蛋白质的丰度和定位在整个周期中受到严格调控1,2,3。尽管与酵母相比，多细胞动物系统在细胞分裂调控方面存在一些额外的复杂性，例如具有更多种类的调控激酶和蛋白质，以及来自外部信号的更多输入，但总体而言，细胞分裂在所有真核生物中高度保守4,5。许多关于细胞周期进程和关键调控步骤的基础性研究工作是在酵母中完成的，由于多种原因，酵母至今仍是研究细胞周期相关问题极具吸引力的模式生物6,7。其中最主要的优势在于存在大量可用于操控细胞周期的方法，能够实现细胞在不同阶段的阻滞以及细胞群体的同步化。其他优势还包括酵母较短的细胞周期（约90–150分钟，具体时长取决于温度和培养基条件）、易于进行遗传操作，以及拥有大量条件性等位基因，可在接近野生型背景下开展相关研究。
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方案
1. 用于细胞周期分析和成像的菌株构建
- 使用 Pringle 标签质粒（pFA6a 质粒）设计引物以对目标基因进行C端标签标记24简而言之，设计F2和R1引物，使其与pFA6a系列质粒配合使用时，能够扩增出可直接转化至酵母中的PCR产物，从而获得目的基因的“标记”版本。使用以下引物对和质粒： 表1 用于在此方案中标记目标基因。Longtine 等人已详细描述了酵母基因C端标记的质粒和引物设计策略。24.
注意：该方法可用于制备荧光标记的蛋白质以进行成像，或制备生长素诱导型降解决定子（Auxin Inducible Degron, AID）标记的蛋白质，从而通过靶蛋白的降解实现细胞周期阻滞及其他相关实验。18例如，用于标记 CDC20 带有AID（IAA7）标签，正向标记引物由25-40个碱基组成 CDC20 基因 终止密码子前立即出现，不包含终止密码子（5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
CAGCCAATATTTGATCAGG 3'），以及添加至3'端的Pringle质粒F2接头序列（5' cggatccccgggttaattaa 3'），以生成最终引物序列（5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
CAGCCAATATTT....
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结果
通过荧光显微镜分析细胞周期依赖性蛋白定位的变化，可借助本文所述方法轻松实现。我们课题组长期致力于研究有丝分裂纺锤体的动态调控及其功能。在酵母中，纺锤体极体（由组分Spc110标记）作为微管组织中心，微管丝从此处延伸而出，形成有丝分裂纺锤体的结构30。微管结合蛋白Stu2通过促进微管聚合在纺锤体形成中发挥重要作用31。Stu2还在多种细胞位置中发挥不同功能，包括着丝粒、纺锤体极体和微管正端，其在细胞周期中定位的动态变化有助于实现这些功能32,33,34,35。利用标记的Spc110和Stu2进行荧光显微镜观察，可帮助理解它们在细胞周期中的定位与功能。图2展示了在α因子.......
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讨论
利用芽殖酵母的细胞周期同步化技术可研究多种细胞过程的重要机制。通过α因子处理实现G1期阻滞与释放，可使细胞群体同步地经历细胞周期各阶段；正如我们所展示的，该方法能够揭示细胞调控因子（如Stu2）的动态定位模式36细胞周期阻滞也可以通过遗传学手段实现。 通过 耗竭细胞周期调控因子（如Cdc20）可使细胞停滞于中期，从而能够在无纺锤体张力的条件下评估有丝分裂特异性过程，例如Bub1在动粒上的招募。37.
在芽殖酵母中，存在多种其他遗传手段可诱导细胞周期阻滞。cdc34（泛素连接酶SCF复合物的一个组分）的温度敏感型突变体可通过阻断蛋白酶体介导的细胞周期调控因子降解，从而在G1晚期造成阻滞40。在非允许温度下，cdc34-ts细胞在复制纺锤极体后、但在启动DNA复制前发生阻滞41。通过耗竭APC组分（如Cdc23）也可实现细胞在中期的阻滞，其机制.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢犹他大学细胞成像中心对Delta Vision显微镜设施的维护。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目包括F31CA2717405（资助对象：M.G.S.）和T32GM141848（资助对象：M.G.S.和T.C.S.）、5 For the Fight（资助对象：M.P.M.）、Pew生物医学学者奖（资助对象：M.P.M.）以及NIH资助项目R35GM142749（资助对象：M.P.M.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-因子 | 犹他大学核心合成设施 | 序列：WHWLQLKPGQPMY | |
| 1.5 mL Eppendorf管 | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 mM dNTP 混合液 | 赛默飞世尔科技 | R0193 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| 5x Phusion HF 反应缓冲液 | New England BioLabs | B0518S | |
| 冰醋酸 | Fisher Chemical | BP2401C-212 | |
| 腺嘌呤半硫酸盐 | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| 琼脂，颗粒状 | 顶端化学试剂与试剂 | 20-275 | |
| 琼脂糖 | Apex Bioresearch Products | 20-102GP | |
| Amsco Century 蒸汽灭菌器高压灭菌 | Steris | SV-1262 | |
| 高压灭菌的去离子水 | |||
| 生长素 | Sigma-Aldrich | 货号 I3750-5G-A；CAS：87-51-4 | |
| Cargille 激光液体 | Cargille Laboratories | 20130 | |
| D-山梨醇 | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | 分子探针 | 货号 D1306 | |
| 鲑鱼精中的脱氧核糖核酸钠盐 | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| 葡萄糖 | Fisher Chemical | D16-10 | |
| 乙二胺四乙酸二钠 | Fisher Chemical | S811-10 | |
| DMSO | 赛默飞世尔科技 | 20688 | |
| FIJI/ImageJ2 版本 2.14.0/1.54f | ImageJ2 | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| 固定转速涡旋混合器 | VWR | https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2 | |
| 荧光显微镜 DV Ultra | Leica | https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=荧光显微镜&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE | 序列号：NV01063。不再提供支持 |
| 甲醛 | Fisher Chemical | 货号#F79-500 | |
| 凝胶电泳装置 | 赛默飞世尔科技 | Owl EasyCast B1 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| 玻璃珠 | Fisher Scientific | 11312A | |
| 载玻片 | VWR | 48300-026 | |
| Innova 2300 平台摇床 | 新不伦瑞克 | NB-2300 | |
| Kimwipes | Kimtech | 06-666 | |
| 适用于1.5 mL离心管的实验室离心机 | Eppendorf | 2525 | |
| 适用于50 mL离心管的实验室离心机 | Eppendorf | 5804 | |
| 乙酸锂二水合物 | Sigma-Aldrich | L4158-250G | |
| Master cycler nexus X2 | Eppendorf | https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586 | |
| 微量移液器 p2、p20、p200 和 p1000 及相应的吸头 | Rainin | L-2XLS+R，L-20XLS-R，L-200XLS-R，L-1000XLS-R | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12541014 | |
| 诺考达唑 | Calbiochem | 货号#487928；CAS：31430-18-9；批号#B35705 | |
| 橙G | Sigma-Aldrich | O7252 | |
| PEG | Hampton Research | HR2-591 | |
| 蛋白胨颗粒 | Fisher Bioreagents | BP9725-5 | |
| Phusion HF DNA聚合酶 | New England BioLabs | M0530L | |
| Pipet-X | Rainin | PX-100R | |
| 磷酸氢二钾 | 赛默飞世尔科技 | 424195000 | |
| 磷酸二氢钾 | 赛默飞世尔科技 | 424200025 | |
| 电源 | Bio-Rad | 23786 | |
| 启动 Acquire Ultra 1.2.2 | softWoRx Cytiva | 使用 DV Ultra 获取 | |
| Tris碱 | Fisher Bioreagents | BP152-10 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 试管旋转仪 | VWR | 10136-084 | |
| 水浴锅 | VWR | WBE10A11B | |
| 超纯水 | Apex Bioresearch Products | 18-194 | |
| 酵母提取物 颗粒状 | Fisher Bioreagents | BP9727-5 |
参考文献
- Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
- Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....
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