Method Article

出芽酵母细胞周期依赖性过程的作和分析

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

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1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

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该协议详细介绍了酵母细胞周期停滞和可选释放的两种方法，并详细阐述了使用荧光显微镜来研究 酿酒酵母细胞周期依赖性过程。

Abstract

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真核细胞遵循保守的细胞周期，调节多种过程，包括 DNA 维持和细胞器稳态。通常需要以细胞周期依赖性的方式研究细胞过程，以正确解释实验结果。有化学和遗传方法可用于在包括脊椎动物模型在内的广泛生物体的培养细胞中产生细胞周期同步，从而能够研究细胞周期依赖性过程。然而，在模式生物中，出芽酵母由于其特别强大的同步方法、较短的生成时间和遗传易处理性，仍然是细胞周期分析的动力源。酵母与其他真核生物共享核心细胞周期机制，这使得细胞周期调节方面取得了里程碑式的发现。该协议详细介绍了酵母细胞周期分析的方法，重点关注G1停滞释放和有丝分裂停滞释放实验，包括菌株构建，培养制备和显微镜检查。提出了用于生产适合细胞周期停滞的菌株和荧光显微镜的PCR标记方法。使用肽信息素α因子实现 G1 停滞，短暂洗涤导致同步释放和细胞周期进展。在释放到细胞周期后的不同时间点采集样品，并固定用于显微镜检查。第二种方法通过耗尽细胞周期调节剂 Cdc20 来阻止酵母细胞的有丝分裂，以实现中期停滞的群体，以及可选的释放到后期。样品被固定并准备用于释放前和释放后成像，并进行成像和分析。图像分析侧重于对细胞周期中蛋白质的动态定位和群体丰度变化进行编目。这些同步方法适用于各种细胞周期作，虽然这里重点介绍了它们在固定细胞成像中的应用，但它们可以适用于许多其他分析，包括活细胞成像以及生化和分子测定。

Introduction

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真核细胞分裂通过称为细胞周期的程序受到高度调节。细胞周期中发生的高度保守和动态过程使研究本身变得有趣，但也具有广泛的影响，为其他细胞生物学过程的研究提供信息——例如，许多细胞器在细胞分裂过程中经历了戏剧性的重塑，并且许多蛋白质的丰度和定位在整个过程中受到高度调节1,2,3.尽管与酵母相比，后生动物系统中存在一些额外的复杂性，包括更多种类的调节激酶和蛋白质，以及后生动物中来自外部信号传导的额外输入，但细胞分裂在所有真核生物中总体上都是非常高度保守的4,5。在酵母中完成了许多基础工作，建立了对细胞周期进程和关键调节步骤的关键见解，并且由于多种原因，它仍然是一种极具吸引力的生物体，用于研究细胞周期相关问题6,7。其中最主要的是可用于纵细胞周期的多种方法，允许在各个阶段停滞并同步细胞。其他优点包括酵母的短细胞周期（~90-150 分钟，取决于温度和培养基条件）、易于遗传作以及广泛的条件等位基因，可以在其他野生型环境中进行研究。

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Protocol

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1. 构建用于细胞周期分析和成像的菌株

  1. 使用品客薯片标记质粒（pFA6a质粒）24设计引物以C端标记目标基因。简而言之，设计 F2 和 R1 引物，当与 pFA6a 系列质粒一起使用时，会产生可直接转化为酵母的 PCR 产物，以生成目标基因的“标记”版本。使用 表1 中包含的引物对和质粒来标记该协议中感兴趣的基因。Longtine等人24详细描述了酵母基因C端标记的质粒和引物设计策略。
    注意：该方法可用于生产用于成像的荧光标记蛋白，或生长素诱导型脱格隆（AID）标记蛋白，以促进细胞周期停滞和其他通过目标蛋白降解实现的实验18。例如，为了用 AID （IAA7） 标签标记 CDC20 ，前向标记引物由终止密码子之前的 CDC20 基因的 25-40 个碱基组成，不包括 STOP 密码子（5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'），以及附加到 3' 端的 Pringle 质粒 F2 接头序列 （5' cggatccccgggttaattaa 3'） 以产生最终引物序列 （5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cg....

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Results

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使用我们在这里描述的方法可以轻松完成通过荧光显微镜分析细胞周期依赖性蛋白质定位的变化。我们小组长期以来一直对有丝分裂纺锤体的动态调节和功能感兴趣。在酵母中，纺锤体极体（由成分 Spc110 标记）充当微管组织中心，微管丝从中发出以形成有丝分裂纺锤体30 的结构。微管结合蛋白 Stu2 通过聚合微管31 在纺锤体形成中发挥作用。Stu2 还在许多细胞位置发挥不同的作用，包括着丝粒、纺锤体极体和微管加端，整个细胞周期定位的变化促进了这些功能 32,33,34,35。带有标记的 Spc110 和 Stu2 的荧光显微镜可用于了解它们在细胞周期中的定位和功能。

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Discussion

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利用出芽酵母中的细胞周期同步可以研究各种细胞过程的重要机制。将 G1 停滞释放与α因子处理一起使用允许细胞群在细胞周期的各个阶段同步进展，并且正如我们所展示的，可以揭示细胞调节因子（如 Stu236）的动态定位模式。细胞周期停滞也可以使用遗传手段通过耗尽细胞周期调节因子（如 Cdc20） 来 实现，Cdc20 用于阻止中期细胞。这允许评估有丝分裂特异性过程，例如在没有纺锤体张力的情况下 Bub1 募集到着丝粒37。

还有许多其他遗传手段可以在出芽酵母中产生细胞周期停滞。cdc34（泛素连接酶 SCF 复合物的一种成分）的温度敏感突变体通过阻断蛋白体介导的 G1/S 转变所需的细胞周期调节剂的蛋白水解，在 G1 晚期产生停滞40。在非允许温度下，cdc34-ts 细胞在复制其纺锤体极体后但在开始 DNA 复制之前停滞

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Disclosures

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提交人声明没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

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我们感谢犹他大学细胞成像核心维护 Delta Vision 显微镜设施。这项工作部分得到了 NIH 拨款 F31CA2717405（给 M.G.S.）和 T32GM141848（给 M.G.S. 和 T.C.S.）、5 For the Fight（给 M.P.M.）、皮尤生物医学学者（给 M.P.M.）和 NIH 拨款 R35GM142749（给 M.P.M.）。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
？-因素犹他大学核心合成设施序列：WHWLQLKPGQPMY
1.5毫升埃彭多夫管阿克西根MCT-175-C
10mM dNTP 混合热力科学R0193
50毫升锥形管格赖纳生物一号227 261
5个Phusion HF反应缓冲液新英格兰生物实验室B0518S
醋酸，冰川费舍尔化学BP2401C-212
腺嘌呤半硫酸盐西格玛-奥尔德里奇A9126-100G
琼脂，颗粒状Apex化学品与试剂20-275
琼脂 糖Apex生物研究产品20-102GP
高压灭菌器 Amsco 世纪蒸汽灭菌器斯特里斯SV-1262
高压消毒DI水
生长素西格玛-奥尔德里奇猫#I3750-5G-A;CAS：87-51-4
嘉吉激光液嘉吉实验室20130
D-山梨醇西格玛-奥尔德里奇S1876-500G
DAPI（40,6-二酰胺-2-苯哚，二盐酸盐）分子探针编号#D1306
来自鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐西格玛-奥尔德里奇D1626
右旋糖费舍尔化学D16-10
二钠乙二胺四乙酸酯费舍尔化学S811-10
DMSO热力科学20688
FIJI/ImageJ2 与 2.14.0/1.54f 比较图片J2https://imagej.net/software/fiji/
定速涡旋混合器VWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
荧光显微镜DV Ultra徕卡https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE序列号#：NV01063。不再支持
甲醛费舍尔化学猫#F79-500
凝胶装置热力科学猫头鹰易铸B1
GeneRuler DNA 梯形混合发酵SM0333
玻璃珠费舍尔科学11312A
玻璃幻灯片VWR48300-026
Innova 2300 平台摇动器新不伦瑞克省NB-2300
金威兹金科技06-666
1.5 mL管用实验室离心机埃彭多夫2525
50毫升管的实验室离心机埃彭多夫5804
醋酸锂二水合物西格玛-奥尔德里奇L4158-250G
Master cycler nexus X2埃彭多夫https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
微量移液器p2、p20、p200和p1000及其对应的尖端雷宁L-2XLS+R，L-20XLS-R，L-200XLS-R，L-1000XLS-R
显微镜盖玻璃费舍尔科学12541014
诺可达唑化学猫#487928;CAS：31430-18-9;拍品#B35705
橙色G西格玛-奥尔德里奇O7252
楔子汉普顿研究HR2-591
颗粒化的肽类;费舍尔生物试剂BP9725-5
Phusion HF DNA 聚合酶新英格兰生物实验室M0530L
皮佩特-X雷宁PX-100R
磷酸钾，二干性热力科学424195000
磷酸钾，单碱性热力科学424200025
动力来源生物辐射23786
开始获取Ultra 1.2.2softWoRx Cytiva用DV Ultra获得
特里斯基地费舍尔生物试剂BP152-10
特里顿 X-100西格玛-奥尔德里奇9002-93-1
管式旋转器VWR10136-084
水浴VWRWBE10A11B
水，超纯净Apex生物研究产品18-194
颗粒化酵母提取物费舍尔生物试剂BP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

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