出芽酵母细胞周期依赖性过程的作和分析

Summary

该协议详细介绍了酵母细胞周期停滞和可选释放的两种方法，并详细阐述了使用荧光显微镜来研究 酿酒酵母细胞周期依赖性过程。

Abstract

真核细胞遵循保守的细胞周期，调节多种过程，包括 DNA 维持和细胞器稳态。通常需要以细胞周期依赖性的方式研究细胞过程，以正确解释实验结果。有化学和遗传方法可用于在包括脊椎动物模型在内的广泛生物体的培养细胞中产生细胞周期同步，从而能够研究细胞周期依赖性过程。然而，在模式生物中，出芽酵母由于其特别强大的同步方法、较短的生成时间和遗传易处理性，仍然是细胞周期分析的动力源。酵母与其他真核生物共享核心细胞周期机制，这使得细胞周期调节方面取得了里程碑式的发现。该协议详细介绍了酵母细胞周期分析的方法，重点关注G1停滞释放和有丝分裂停滞释放实验，包括菌株构建，培养制备和显微镜检查。提出了用于生产适合细胞周期停滞的菌株和荧光显微镜的PCR标记方法。使用肽信息素α因子实现 G1 停滞，短暂洗涤导致同步释放和细胞周期进展。在释放到细胞周期后的不同时间点采集样品，并固定用于显微镜检查。第二种方法通过耗尽细胞周期调节剂 Cdc20 来阻止酵母细胞的有丝分裂，以实现中期停滞的群体，以及可选的释放到后期。样品被固定并准备用于释放前和释放后成像，并进行成像和分析。图像分析侧重于对细胞周期中蛋白质的动态定位和群体丰度变化进行编目。这些同步方法适用于各种细胞周期作，虽然这里重点介绍了它们在固定细胞成像中的应用，但它们可以适用于许多其他分析，包括活细胞成像以及生化和分子测定。

Introduction

真核细胞分裂通过称为细胞周期的程序受到高度调节。细胞周期中发生的高度保守和动态过程使研究本身变得有趣，但也具有广泛的影响，为其他细胞生物学过程的研究提供信息——例如，许多细胞器在细胞分裂过程中经历了戏剧性的重塑，并且许多蛋白质的丰度和定位^{在整个过程中}受到高度调节^1,2,3.尽管与酵母相比，后生动物系统中存在一些额外的复杂性，包括更多种类的调节激酶和蛋白质，以及后生动物中来自外部信号传导的额外输入，但细胞分裂在所有真核生物中总体上都是非常高度保守的^4,5。在酵母中完成了许多基础工作，建立了对细胞周期进程和关键调节步骤的关键见解，并且由于^{多种原因，}它仍然是一种极具吸引力的生物体，用于研究细胞周期相关问题^6,7。其中最主要的是可用于纵细胞周期的多种方法，允许在各个阶段停滞并同步细胞。其他优点包括酵母的短细胞周期（~90-150 分钟，取决于温度和培养基条件）、易于遗传作以及广泛的条件等位基因，可以在其他野生型环境中进行研究。

细胞周期不同阶段的进展是由几种关键激酶的活性驱动的，包括普遍存在的细胞周期蛋白依赖性激酶 （Cdk）、Polo 样激酶和极光激酶。细胞周期检查点调节整个细胞周期的进展，确保除非满足特定条件，否则细胞不会进入下一阶段的分裂 ^8,9。研究人员可以劫持这些检查点及其调节的过渡，以实现长期停滞，或瞬时停滞和释放以同步细胞群（图1）。例如，细胞周期承诺检查点（限制点或酵母中的开始）确保细胞在开始 DNA 复制¹⁰ 之前有足够的营养物质来承诺分裂。该检查点可以在单倍体酵母中进行纵，以利用与细胞周期相互作用的酵母交配程序来实现 G1 停滞。在面包酵母（酿酒酵母）中，单倍体细胞具有两种交配类型之一，即 MATa 或 MATα，这是由交配类型基因座遗传决定的。一种交配类型的酵母对另一种交配类型的交配信息素敏感，并通过激活 MAP 激酶信号级联反应，最终磷酸化并稳定 Cdk 抑制剂 Far1，从而通过与 Cln1/2-Cdk 复合物结合并阻断其活性来阻止细胞周期进入 11,12,13。对交配信息素做出反应的细胞可以通过交配投射或shmoo的存在来直观地确定（图1）。因此，化学合成的α因子可以添加到MATa细胞的培养物中以实现G1停滞。研究人员可以针对酵母细胞同步的另一个细胞周期转变是中期到后期的转变。在有丝分裂过程中，纺锤体组装检查点 （SAC） 监测着丝粒与微管的附着情况，并在检测到未连接的着丝粒时通过螯合其激活剂 Cdc20 来抑制后期促进复合物/环粒 （APC/C）。APC/C 是一种 E3 连接酶复合物，对于进入后期至关重要。当 SAC 得到满足时，Cdc20 结合 APC/C，APC/C 泛素化几种蛋白质，主要是 securin 和细胞周期蛋白 B，靶向它们进行降解，并促进染色体分离和有丝分裂退出^14,15。虽然Cdc20本身不是SAC的组成部分，但其抑制作用是SAC激活的靶标;因此，可以利用Cdc20的诱导性耗竭来阻止中期的酵母培养物（图1）¹⁶。

该协议包含两种酵母细胞周期作方法，以及每种方法的示例应用。在第一个中，α因子用于阻滞 G1 中的细胞，然后是洗涤步骤以将细胞从停滞中释放出来，从而导致同步细胞周期重新进入。同步细胞将持续贯穿整个细胞周期，使研究人员能够跟踪和研究每个细胞周期阶段的细胞。在这种方法中，始终监测感兴趣的GFP标记蛋白Stu2的动态定位，并跟踪其与有丝分裂纺锤体的关联。该方法还利用了标记的纺锤体极体（SPB）组件Spc110-mCherry，它能够测量有丝分裂纺锤体长度，并且是细胞周期进程的极好代表¹⁷。该方法展示了细胞周期停滞和释放如何实现细胞群的同步，从而促进整个细胞周期中蛋白质或其他感兴趣成分的研究。

在第二种方法中，通过使用生长素诱导的去体（AID）系统¹⁸通过耗尽Cdc20来实现有丝分裂停滞。在表达 TIR1（一种植物来源的 F-box 蛋白）的细胞中，任何带有 AID 标签的蛋白质都会在添加生长素后泛素化和降解。在这里，我们使用带有 AID 标记的 Cdc20 来实现 Cdc20 的诱导降解，从而导致中期停滞。然后使用标记的着丝粒蛋白 Mtw1-mCherry 作为基准标记，监测该细胞群以招募标记的 SAC 成分 Bub1-GFP 到着丝粒。尽管Bub1在着丝粒中起SAC非依赖性作用，并在早期有丝分裂中定位于着丝粒，但其在停滞细胞中的持续着丝粒定位表明着丝粒-微管附着不当¹⁹。我们通过用微管毒物诺考达唑处理细胞来证明这一点，诺考达唑会破坏着丝粒-微管附着。该实验强调了如何使用高度可调的停滞方法研究特定于不同细胞周期阶段的过程。我们进一步证明生长素可以从 cdc20-AID 培养物中洗掉，从而允许释放到后期并进入新的细胞周期，尽管根据我们的经验，这些培养物不会像α因素停滞释放那样同步释放。这两种停滞释放方法既有效又易于实施，但酵母研究人员可以使用许多其他方法来阻止不同细胞周期阶段的细胞 20,21,22,23。这些方法的更多详细信息可以在讨论中找到。

Protocol

1. 构建用于细胞周期分析和成像的菌株

1. 使用品客薯片标记质粒（pFA6a质粒）²⁴设计引物以C端标记目标基因。简而言之，设计 F2 和 R1 引物，当与 pFA6a 系列质粒一起使用时，会产生可直接转化为酵母的 PCR 产物，以生成目标基因的“标记”版本。使用 表1 中包含的引物对和质粒来标记该协议中感兴趣的基因。Longtine等人²⁴详细描述了酵母基因C端标记的质粒和引物设计策略。
   注意：该方法可用于生产用于成像的荧光标记蛋白，或生长素诱导型脱格隆（AID）标记蛋白，以促进细胞周期停滞和其他通过目标蛋白降解实现的实验¹⁸。例如，为了用 AID （IAA7） 标签标记 CDC20 ，前向标记引物由终止密码子之前的 CDC20 基因的 25-40 个碱基组成，不包括 STOP 密码子（5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
   CAGCCAATATTTGATCAGG 3'），以及附加到 3' 端的 Pringle 质粒 F2 接头序列 （5' cggatccccgggttaattaa 3'） 以产生最终引物序列 （5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
   CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'）。反向 CDC20 标记引物包含紧接在 STOP 密码子之后的 25-40 个碱基对的反向补体（5' ATTATATGCCTTGACATGAA
   CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTA 3'）和品客片质粒 R1 接头序列（5' gaattcgagctcgtttaaac 3'）产生最终引物序列（5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
   TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'）。同样重要的是要注意，使用短于 40 个碱基对的 PCR 引物会降低整合到酵母基因组中的效率。
2. 在分子生物学级水中将引物稀释至 10 μM。
3. 按照 表2中包含的热循环仪程序，使用标准方法对F2和R1质粒对以及适当的标记质粒进行PCR，然后通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的大小。
4. 接种酵母菌株转化为25mL酵母提取物蛋白胨腺嘌呤葡萄糖（YPAD）培养物，并在23°C下生长过夜。 为了构建 cdc20-AID 酵母（用生长素处理后会降解Cdc20），转化的菌株可能已经含有从异位位点表达的 OsTIR1 ，或者 OsTIR1 可能在后期¹⁸中杂交。
5. 第二天早上，检查隔夜培养物的OD600。如果培养物OD<2.0，则继续执行步骤1.6。如果OD>2.0，则稀释至~0.2-0.4，并允许2-3个生长周期。
6. 在OD600 = ~0.4-2.0下收获细胞，以确保它们处于对数生长阶段。每次转化收获 5 OD 的细胞（例如，5 mL OD600 = 1.0）。如果对同一菌株进行多次转化，则可以在此阶段合并细胞。通过在23°C下以3,000 x g 离心5分钟来收获细胞。
7. 弃去上清液并用 25 mL 水洗涤细胞沉淀，然后在 23 °C 下以 3,000 x g 离心 5 分钟。
8. 弃去上清液并将细胞重悬于 1 mL 0.1 M 醋酸锂 （LiAc） 中，然后转移到 1.6 mL 管中。如果进行多次转化，则将 1 mL 重悬液分成多个试管（例如，对于 2 次转化，将 2x 500 μL，对于 3 次转化，将 3x 333 μL 分开，依此类推）。
9. 在23°C下以1,000 x g 离心细胞2分钟，然后弃去上清液。
10. 将以下物质添加到细胞沉淀中（按此顺序）：i）240μLPEG（50%），ii）36μL1.0M LiAc，iii）20μL = 50μg鲑鱼精子DNA，预煮5分钟，iv）54μL水。
11. 将 10 μL PCR 产物（在步骤 1.3 中获得）添加到细胞中并涡旋 1 分钟，确保所有东西充分混合。
12. 将细胞在 30°C 下在温暖房间的滚筒或热摇床中以 1000 rpm 孵育 30 分钟。
13. 在水浴中在42°C下热休克电池15分钟。
    注意：最佳热休克时间可能因酵母菌株背景而异。该协议针对 W303 菌株背景进行了优化。
14. 在23°C下以1,000 x g 离心细胞2分钟。 除去上清液并轻轻重悬于 100 μL 水中。
15. 对于使用 KanMX 或其他药物选择的转化，将细胞接种在 YPAD 上并在 23°C 下孵育板，然后在第二天将板复制到药物板。
    注意：允许在YPAD上生长一天对于允许在转化细胞中表达耐药基因至关重要。
16. 对于使用营养缺陷型标记物（URA、HIS等）的转化，将细胞直接接种在选择性培养基上。
17. 将板在23°C下孵育3天，以使酵母转化菌落生长。
18. 通过基因组 PCR 或蛋白质印迹验证基因的正确标记。Burnette²⁵ 和 Chu 等人²⁶ 详细描述了这些方法。
    注意：对于生产具有多个标记等位基因的菌株，不建议在没有回交的情况下重复转化，因为转化可能是一个诱变过程。例如，为了生产含有 Stu2-GFP 和 Spc110-mCherry 的菌株，我们建议分别转化菌株以生产 Stu2-GFP 和 Spc110-mCherry，然后通过酵母杂交、孢子形成、四分体解剖和基因型分析将这些等位基因组合成一个单倍体菌株。有关酵母杂交的更多信息，可从 Stansfield 和 Stark²⁷ 以及 Morin 等人 ²⁸ 获得。为了进行α因素停滞释放，所使用的单倍体菌株必须是 MATa。

2. 酵母培养和细胞周期同步：α因素停滞释放

1. 将酵母菌接种到25mL的YPAD培养物中，在23°C下过夜，第二天早上OD600 = 0.5-2.0。
   1. 如果早上细胞高于OD600 = 2.0，则稀释回OD600 = 0.2-0.4，让它们生长至少1个细胞周期（23°C下2-3小时）。
2. 将细胞稀释回OD600 = 0.5，并加入α因子至终浓度为1μg/mL（DMSO中的储备液为10mg/mL）。理想情况下，细胞会有 bar1 突变（例如 bar1-1），这使它们对α因子更加敏感。 BAR1 野生型细胞对α因子不太敏感，需要至少高一个数量级的α因子浓度才能正确拦截，这不太经济。
3. 在逮捕后2.5-3.5小时，通过计算未出芽的shmooed细胞的百分比来检查逮捕程度。当 90-95% 的细胞被 shmoo（在 G1 中停滞）时，继续释放。时间会因酵母菌株、生长培养基和温度而异。
4. 通过在23°C下以3,000 x g 离心机旋转3-5分钟，然后倒出上清液，将细胞从α因子停滞中释放出来。
5. 通过将沉淀重悬于 25 mL YPAD + 1% DMSO 中来洗涤细胞。
6. 重复步骤 2.4-2.5 两次，总共洗涤 3 次，第一次洗涤后更换一次用过的试管。
7. 将 YPAD 添加到细胞中，使最终体积达到 25 mL，并将细胞转移到新烧瓶中。
   注意：使用新烧瓶对于消除可能阻止释放的微量α因子至关重要。
8. 取时间点（0 分钟）样品并固定（参见步骤 4.1 至 4.4 中的固定说明）。
9. 如果生长发生在 23 °C 时，则继续每 15 分钟采集一次时间点样品。 这个时间会根据细胞生长的速度在其他温度下发生变化。
10. 在时间点60 min，通过在光学显微镜下检查均匀的小芽（芽大小<25%母细胞大小）来判断释放的同步性。
11. 可选）在释放后 60 分钟，再次添加 α 因子至终浓度为 1 μg/mL，以防止进展到下一个细胞周期。通过在添加前验证均匀的小芽形态来确认同步细胞释放。
12. 继续采集时间点样品长达 180 分钟，或根据需要采集时间点样品。在 23 °C 时，中期发生在释放后 ~45-60 分钟，后期发生在释放后 ~60-90 分钟，大多数细胞将在释放后 120 分钟处于新的 G1 中。

3. 酵母培养与细胞周期同步：Cdc20耗竭停滞释放

1. 在23°C下接种酵母过夜培养物，使其在第二天早上达到OD600 = 0.5-2.0。
   1. 如果第二天早上细胞高于OD600 = 2.0，则稀释回OD600 = 0.2-0.4，并让它们生长至少1个细胞周期（23°C下2-3小时）。
2. 稀释回OD600 = 0.5，并将生长素从1M储备液（500x）添加到所有培养物中，终浓度为500μM。对于接受其他药物（诺考达唑）的培养物，将它们与生长素同时以适当的浓度（例如，~10 μg/mL诺考达唑）添加。
3. 在停滞后2小时，通过计算大芽细胞的百分比来检查停滞程度（大芽确定为芽的存在>母细胞大小的25%）。当 90-95% 的细胞在有丝分裂中停滞时，根据实验应用继续收集样品或释放停滞细胞。如果90%的细胞没有被阻止，则让培养物继续生长，并每15-30分钟检查一次。时间会因酵母菌株、生长培养基和温度而异。
   注意：如果释放，不建议让停滞持续太久（大于4小时），因为长时间停滞可能会降低细胞活力。
4. 为了从 Cdc20 耗竭停滞中释放，请在 23°C 下以 3000 x g 离心 3-5 分钟收获培养物。
5. 通过将沉淀重悬于 25 mL YPAD + 1% DMSO 中来洗涤细胞，然后在 23 °C 下以 3,000 x g 离心 3-5 分钟收获。
6. 重复步骤 3.4-3.5，总共洗涤 2 次。
7. 将 YPAD 添加到细胞中，使最终体积达到 25 mL，并将细胞转移到新烧瓶中。
   注意：使用新烧瓶对于去除可能阻止释放的微量生长素至关重要。
8. 取时间点 0 并固定（参见步骤 4.1 至 4.4 中的固定说明）。
9. 继续每 10-15 分钟获取一次时间点，以达到所需的时间过程长度。在23°C时，大多数细胞将在50-70分钟后从停滞中释放出来。
   注意：细胞不会像α因子停滞那样同步释放Cdc20耗竭停滞。然而，研究后期或有丝分裂退出事件可能很有用。此外，这种停滞释放的一个技术限制是，在释放后的较晚时间点，更难区分尚未释放的中期细胞和较早释放并已达到下一个细胞周期中期的细胞。如果需要，可以通过进行活细胞成像以跟踪单个细胞从停滞中释放时或通过在培养物中添加α因子（假设细胞是 MATa）以在有丝分裂退出后阻止G1中的细胞来克服这一点。

4.酵母固定

1. 在 23 °C 下以最大速度 （~20,000 x g） 离心 1 mL（或 0.5-1.5 OD）培养物 1 分钟。
2. 吸出上清液并将细胞重悬于 500 μL 固定溶液（3.7% 甲醛在 0.1 M 磷酸钾 （KPi） pH 6.4 中）。
3. 将细胞在固定溶液中孵育2-15分钟，以下温度
   23°C。 对于时间过程实验，通常建议将细胞固定15分钟，以在取样时对齐离心细胞的时间。
   注意：应针对特定的荧光团和感兴趣的蛋白质优化固定时间。
4. 在 23 °C 下以最大速度离心细胞 1 分钟，吸出上清液，并重悬于 500 μL 0.1 M KPi （pH 6.4） 中。KPi 中的细胞可以储存在 4 °C 下，直到准备好成像。
   注意：固定细胞荧光信号可持续长达2周，具体取决于荧光团，但是，为了定量荧光信号，请在7天内收集图像。

5. 准备用于成像的载玻片

1. 准备成像时，在23°C下以最大速度离心细胞1分钟，并弃去上清液。将细胞重悬于 10-100 μL Triton/DAPI/山梨糖醇溶液（1.2 M 山梨糖醇、1% Triton、0.1 M KPi、pH 7.5、2 μg/mL DAPI）中。
2. 将 ~0.8 μL 细胞直接移液到干净的盖玻片上。使用移液器吸头将细胞液滴轻轻地扩散到盖玻片中心约 1 cm² 的圆圈中。
3. 将盖玻片放在显微镜载玻片上。使用 Kimwipe 轻轻按压载玻片周围以分布样品。
4. 用指甲油密封盖玻片的边缘。
5. 可选择在成像前在阴凉避光处储存长达 4-6 小时，以帮助细胞沉降并防止过度运动。

6. 成像

1. 将载玻片带到配备 60x/1.42 油物镜和红、绿、蓝、远红激光和滤光片组的显微镜上。也可以使用更高的放大倍率物镜（高达 100 倍）。
2. 将显微镜聚焦在粘附在盖玻片上的酵母细胞上。
   注意：如果酵母细胞移动过多，载玻片可以放在阴凉黑暗的地方20-60分钟以沉淀。
3. 酵母聚焦后，调整每个通道的曝光设置以产生至少 3：1 的信噪比，确保没有荧光点过度曝光。
   注意：例如，在我们与科学 CMOS 相机一起使用的成像系统上，使用 60x 550 物镜和折射率为 n = 1.516 的浸油，将红色通道的最大信号设置为 1000-2000 au，绿色通道设置为 3000 au，蓝色通道设置为 3000 au，DIC 通道设置为 4000-5000 au，可产生高质量的图像。
4. 调整采集设置以采用 14-20 个 0.2 μm Z 堆栈，总跨度为 2-4 μm。
5. 对于配备后处理模块的显微镜，请为每个堆栈选择 “去卷积” 和 “快速投影 ”。
6. 收集细胞的 Z 堆栈，拍摄足够的图像以捕获每个条件或时间点的 ~100-200 个细胞。
7. 请参阅 补充文件 1 ，了解带有成像软件屏幕截图的软件说明。

7. 图像分析

1. 在 ImageJ 中打开投影图像并调整亮度和对比度以查看不同的通道。如果用于成像的显微镜没有后处理模块，请在此阶段对 Z 堆栈进行最大投影。
2. 要确定细胞周期进程，请在每个时间点计数 100 个细胞，并将它们分类为包含一个或两个细胞核。或者，计算纺锤体长度或纺锤体极体之间的距离以定义细胞周期状态。Spc110病灶<1.5μm之间的距离对应于中期细胞，>1.5μm的距离对应于后期细胞。
3. 要计算蛋白质点的强度（例如，Stu2-GFP），请使用 手绘选择工具 在感兴趣信号的边界周围绘制。通过按 T 或使用 菜单将此信号添加到 ROI（感兴趣区域）管理器。在 ROI 管理器 中，选择 度量 以计算每个选定点点的强度。要查看点信号随时间的变化，请在折线图上绘制每个时间点的平均强度和 95% 置信区间。
4. 要计算具有 Bub1-GFP 点的细胞百分比，请确保不同图像的绿色通道最小和最大亮度设置相同。具有Bub1-GFP点点的细胞与Mtw1-mCherry点重叠，计数为定位于着丝粒的Bub1;否则，该单元格将计为阴性。每个条件计数 ~100 个细胞。Aravamudhan 等人 ²⁹ 包含有关 Bub1 定位到动粒的更多信息。
5. 要计算大芽单核细胞的百分比，请计算群体中具有大芽和一个细胞核（一个 DAPI 信号）的细胞数，然后除以细胞总数。
6. 请参阅 补充文件 1 了解带有成像软件屏幕截图的软件说明。

Results

使用我们在这里描述的方法可以轻松完成通过荧光显微镜分析细胞周期依赖性蛋白质定位的变化。我们小组长期以来一直对有丝分裂纺锤体的动态调节和功能感兴趣。在酵母中，纺锤体极体（由成分 Spc110 标记）充当微管组织中心，微管丝从中发出以形成有丝分裂纺锤体³⁰ 的结构。微管结合蛋白 Stu2 通过聚合微管³¹ 在纺锤体形成中发挥作用。Stu2 还在许多细胞位置发挥不同的作用，包括着丝粒、纺锤体极体和微管加端，整个细胞周期定位的变化促进了这些功能 32,33,34,35。带有标记的 Spc110 和 Stu2 的荧光显微镜可用于了解它们在细胞周期中的定位和功能。

Discussion

利用出芽酵母中的细胞周期同步可以研究各种细胞过程的重要机制。将 G1 停滞释放与α因子处理一起使用允许细胞群在细胞周期的各个阶段同步进展，并且正如我们所展示的，可以揭示细胞调节因子（如 Stu2³⁶）的动态定位模式。细胞周期停滞也可以使用遗传手段通过耗尽细胞周期调节因子（如 Cdc20） 来 实现，Cdc20 用于阻止中期细胞。这允许评估有丝分裂特异性过程，例如在没有纺锤体张力的情况下 Bub1 募集到着丝粒³⁷。

还有许多其他遗传手段可以在出芽酵母中产生细胞周期停滞。cdc34（泛素连接酶 SCF 复合物的一种成分）的温度敏感突变体通过阻断蛋白体介导的 G1/S 转变所需的细胞周期调节剂的蛋白水解，在 G1 晚期产生停滞⁴⁰。在非允许温度下，cdc34-ts 细胞在复制其纺锤体极体后但在开始 DNA 复制之前停滞

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
？-因素	犹他大学核心合成设施		序列：WHWLQLKPGQPMY
1.5毫升埃彭多夫管	阿克西根	MCT-175-C
10mM dNTP 混合	热力科学	R0193
50毫升锥形管	格赖纳生物一号	227 261
5个Phusion HF反应缓冲液	新英格兰生物实验室	B0518S
醋酸，冰川	费舍尔化学	BP2401C-212
腺嘌呤半硫酸盐	西格玛-奥尔德里奇	A9126-100G
琼脂，颗粒状	Apex化学品与试剂	20-275
琼脂 糖	Apex生物研究产品	20-102GP
高压灭菌器 Amsco 世纪蒸汽灭菌器	斯特里斯	SV-1262
高压消毒DI水
生长素	西格玛-奥尔德里奇	猫#I3750-5G-A;CAS：87-51-4
嘉吉激光液	嘉吉实验室	20130
D-山梨醇	西格玛-奥尔德里奇	S1876-500G
DAPI（40,6-二酰胺-2-苯哚，二盐酸盐）	分子探针	编号#D1306
来自鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐	西格玛-奥尔德里奇	D1626
右旋糖	费舍尔化学	D16-10
二钠乙二胺四乙酸酯	费舍尔化学	S811-10
DMSO	热力科学	20688
FIJI/ImageJ2 与 2.14.0/1.54f 比较	图片J2	https://imagej.net/software/fiji/
定速涡旋混合器	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
荧光显微镜DV Ultra	徕卡	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	序列号#：NV01063。不再支持
甲醛	费舍尔化学	猫#F79-500
凝胶装置	热力科学	猫头鹰易铸B1
GeneRuler DNA 梯形混合	发酵	SM0333
玻璃珠	费舍尔科学	11312A
玻璃幻灯片	VWR	48300-026
Innova 2300 平台摇动器	新不伦瑞克省	NB-2300
金威兹	金科技	06-666
1.5 mL管用实验室离心机	埃彭多夫	2525
50毫升管的实验室离心机	埃彭多夫	5804
醋酸锂二水合物	西格玛-奥尔德里奇	L4158-250G
Master cycler nexus X2	埃彭多夫	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
微量移液器p2、p20、p200和p1000及其对应的尖端	雷宁	L-2XLS+R，L-20XLS-R，L-200XLS-R，L-1000XLS-R
显微镜盖玻璃	费舍尔科学	12541014
诺可达唑	化学	猫#487928;CAS：31430-18-9;拍品#B35705
橙色G	西格玛-奥尔德里奇	O7252
楔子	汉普顿研究	HR2-591
颗粒化的肽类;	费舍尔生物试剂	BP9725-5
Phusion HF DNA 聚合酶	新英格兰生物实验室	M0530L
皮佩特-X	雷宁	PX-100R
磷酸钾，二干性	热力科学	424195000
磷酸钾，单碱性	热力科学	424200025
动力来源	生物辐射	23786
开始获取Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	用DV Ultra获得
特里斯基地	费舍尔生物试剂	BP152-10
特里顿 X-100	西格玛-奥尔德里奇	9002-93-1
管式旋转器	VWR	10136-084
水浴	VWR	WBE10A11B
水，超纯净	Apex生物研究产品	18-194
颗粒化酵母提取物	费舍尔生物试剂	BP9727-5