本文介绍一种用于构建独特双层微流控装置的实验方案，以研究上皮组织稳态的电机械调控机制。该装置可施加垂直于组织平面的静态生理性电流，影响细胞间黏附、增殖及细胞挤出过程。通过活细胞成像和机械应力测量，揭示这些生物学过程的作用机制。
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摘要
摘要
细胞行为和细胞命运受到内源性或外源性电流传导或电场的影响。静态电信号可通过定制的微流控装置施加，以模拟发育、伤口愈合和稳态等缓慢生理过程中的电环境。一类重要的细胞电学研究是利用简单的微流控通道中静态平面内的伽伐尼电流来调控细胞迁移，模拟伤口电流，其电流密度约为 0.1–1000 A/m2。然而，由于几何结构不匹配，这些装置不适合研究组织稳态中的电效应，因为在组织稳态中，细胞具有顶-基底极性并形成跨上皮电位差（TEPD）。本文详细介绍了一种独特的基于微流控的装置，该装置可将生理离子流垂直施加于融合的上皮细胞层平面，以扰动跨上皮电位差，并研究电调控对组织稳态的影响。该装置由两层紫外光固化聚合物构成，内嵌柔软的聚丙烯酰胺凝胶基底，并在表面包被可选择的细胞外基质蛋白。该微流控装置提供了合适的几何结构和可渗透基底，可在厘米尺度的细胞层上诱导相对均匀的离子流。该系统兼容共聚焦活细胞成像和牵引力显微镜技术，可用于推断跨上皮电流诱导的机械应力。引人注目的是，在融合的上皮组织中，细胞的增殖、挤压和迁移会集体受到离子流方向的影响，从而诱导出一种新的组织状态，其特征表现为不同的细胞间相互作用强度、细胞事件（死亡与增殖）以及组织结构。这些受电调控的细胞行为可被理解为电诱导的机械应力及细胞响应。这一新型微流控装置与实验方案为力学生物学与生物工程领域提供了研究组织稳态中电效应所需的工具与详细操作文档，并有助于开发新型的组织工程应用。
引言
生物电信号是调控细胞行为的重要生物物理因素。最著名的例子是神经元和心肌细胞的动作电位，其可在长距离（长达一米）和高频率（高达数百赫兹）下传递电信号1。通过电极施加的电脉冲可用于刺激动作电位的产生，在科研和医学应用中具有重要意义2。在发育、伤口愈合和稳态等缓慢生理过程中，内源性生物电信号也已被测量，其持续时间可达数小时至数天3,4,5,6,7,8，并被证实存在9,10。一个重要的例子是汇合的上皮层，其主动维持数毫伏至数十毫伏范围内的跨上皮电位差（TEPD）4,11。这些汇合层中的切口或伤口会产生由组织电活动驱动的短路电流12,13。已有不同技术报道检测到高达数十 µA/cm2 的伤口电流和高达数百 mV/mm 的电场。研究表明，这些电信号为细胞提供了朝向伤口或感染部位迁移的方向性提示，在愈合过程中发挥重要作用3,6,14。总体而言，静态（或缓慢变化）和快速变化的电信号均具有重要意义，并可触发不同的细胞或组织反应。
在缓慢变化的信号领域中，一个重要的现象是电驱动的迁移过程，称为 "电趋性"在具有简单通道的微流控装置中，可施加可控的平面内伽伐尼电流以模拟伤口电流，同时研究细胞迁移随电流密度的变化情况15,160.1–1000 V/m 的电场（对应的电流密度为 0.1–1000 A/m²）2) 在多种细胞类型中被发现可驱动细胞迁移 体外 设置17，而参与趋化性（由化学梯度引导的细胞迁移）的经典信号通路（如PI3K）也已被证实参与电趋性7,18. "极简的" 用于研究电趋性（galvanotaxis）的微流控装置可通过标准的软光刻和微加工技术制备19这些装置通常由单通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底与载玻片键合而成（通道横截面尺寸：数百微米，长度：厘米级）。用于提供直流电流的电极安装在细胞区域之外，通过或不通过盐桥进行连接。盐桥连接可通过在PDMS基底上打孔、微流控连接器以及充满琼脂的管路实现。通道下方的简单玻璃载片（通常厚170 µm）还支持在电趋性实验期间进行高分辨率的活细胞成像，这是研究该过程的一个关键特性。
内源性电信号在维持组织稳态中的作用，相较于其在伤口愈合中的作用，研究仍十分有限。其中一个重要原因是缺乏适用于完整组织中研究这些效应的适当工具。由于几何结构的限制，现有的用于电趋性的微流控装置仅支持平面内电流，因而不适用于此类研究。在上皮稳态的研究背景下，亟需一种新型装置，以调控和干扰跨过融合上皮层的跨上皮电位差（TEPD）或垂直于平面的电流。为实现对单层细胞施加相对均匀的离子电流密度这一目标，我们设计并制备了一种在装置几何结构、材料选用及 原位 生物力学测量能力4后一种功能非常重要，因为电效应可能通过与生物力学和力学生物学通路的耦合作用影响细胞行为，而该功能可用于研究此类效应。
该新装置具有多项创新特性。其设计采用双层结构，而非传统电趋性装置中的单通道结构（几何设计上的创新），同时保持了与电极室的连接方式与后者相似。第一层微流控层设有通道，用于引导离子电流流向（或远离）组织区域；而第二层则设有一个开口，可将电流垂直引导穿过位于该第二层微流控层上方的上皮组织（图1A，B）。采用微加工技术制备足够薄的层，使得即使微流控层堆叠增加了样品厚度，仍可实现高分辨率共聚焦成像。另一项重要创新是，在装置中部引入了一种聚丙烯酰胺（PA）合成水凝胶，该水凝胶起着关键作用（图1A，B）。该凝胶的理化特性，如可修饰以包被细胞外基质蛋白的化学基团、对离子的通透性以及已知的弹性模量，分别对细胞黏附与生长、施加面外电流以及在电刺激过程中测量机械应力20至关重要。在组织区域的第一层中集成了屏障结构，用于限制PA凝胶前体溶液的扩散，这一设计此前已在微流控装置中应用21（图1A，B）。最后但同样重要的是，由于PA凝胶在对氧气具有通透性的PDMS表面会发生氧抑制聚合，因此装置 fabrication 采用了另一种材料22，以允许PA凝胶顺利聚合并实现牢固结合。所有这些创新特性对该新装置的正常运行均至关重要。
总体而言，这种新设备使得对完整组织稳态过程中静态或缓慢变化的生物电信号进行深入研究成为可能，其操作流程将在下文详细说明。本文所述的实验方案及结果主要针对Madin Darby犬肾上皮细胞II系（MDCK II），包括由电流诱导的细胞事件（增殖、死亡、脱落和迁移）以及组织结构的变化。这些研究对于希望应用该技术研究上皮细胞运输的电调控机制，以及细胞层乃至更复杂系统（如原代细胞和二维类器官）中细胞事件和细胞命运变化的科研人员也具有指导意义。
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方案
注意：本方案提供了构建一套装置的步骤，该装置可施加静态电流以干扰融合上皮细胞的跨上皮电势差（TEPD），并通过活细胞成像和力学生物学技术研究其效应（图1）。该装置由微流控芯片与卡盒、插件和支架键合而成，支架可用于在显微镜上容纳多个装置以进行多重实验；还包括一对连接至源表和装置的电极室，以及用于维持适当活细胞培养条件的活细胞培养室盖（图1C）。卡盒及其他关键组件的设计原理和CAD文件图纸详见补充文件1。本方案包含以下步骤：1）PDMS软光刻；2）芯片制备与装置组装；3）装置组装完成；以及4）单层细胞培养与活细胞实验。本方案所用试剂与材料的详细信息见于材料表。
1. PDMS 软光刻技术
注意：本节详细说明如何从 SU-8 晶圆（图 2A、B）制备 PDMS 弹性体，以模制微流控芯片中基于紫外光固化胶黏剂的各层结构。
- PDMS 软光刻
- 使用光刻技术分别为微流控层1和层2制备独立的SU-8基晶圆（补充文件 2 和 补充文件 3).
注意：如果向微加工/洁净室设施提交申请，晶圆制备可能需要一个月时间。也可采用硅刻蚀技术进行晶圆制备。 - 硅烷化硅片以利于PDMS脱模19.
- 使用加压氮气吹枪清洁晶圆。通过施加短时氧气等离子体处理（30秒，30 W，20 sccm O₂）活化晶圆表面。2 在1–3 mbar反应压力下的气体流速23.
- 在洁净的塑料盖（直径 60 mm，高度 15 mm）中加入 200 µL 十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷。将塑料盖置于硅片旁，放入真空干燥器中（仅用于硅烷化处理）。开启真空泵，抽真空 1–2 h，使气化的硅烷在硅片表面沉积形成单分子层。
警告：硅烷具有腐蚀性和毒性。操作时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱中进行，以确保安全。
注意：新硅烷化处理的硅片可用于制备10–20个PDMS模具。抽真空时间取决于真空泵的工作状态。过度硅烷化会导致涂层厚度不均，出现浑浊外观，应避免此情况。硅片在不使用时应存放于湿度可控的容器中。使用新硅片制备的PDMS结构可通过扫描电子显微镜（SEM）进行检测。
- 在培养皿（直径 150 mm，高度 25 mm）中将足量的基础 PDMS 树脂与交联剂充分混合（质量比 10:1，总质量 70–80 g），持续数分钟。确保混合物中均匀产生微小气泡，以确认混合充分。将混合物转移至 50 mL 离心管中，在 550 × g 条件下离心 g 3 分钟，以彻底去除气泡。
注意：聚二甲基硅氧烷（PDMS）液体具有黏性且难以清除；倾倒时需小心。若PDMS混合物洒落在实验台表面，需用异丙醇清洁。 - 将PDMS混合物轻轻倒入平底的塑料或玻璃培养皿（直径150 mm，高度25 mm）中的硅片上，然后下压硅片以排出硅片底部的PDMS。使用真空泵对混合物进行脱气处理。
注意：清除晶圆底部的液态PDMS非常重要；底部过厚的PDMS层会使晶圆难以从塑料培养皿中取出，增加晶圆破裂的风险。 Alternatively，可沿晶圆边缘将PDMS切割，并将晶圆保留在培养皿中。确保第一层PDMS厚度约为1.5 mm，以保证模具在后续加工步骤中的柔韧性。确保第二层PDMS厚度约为2.5 mm，以降低后续加工过程中发生下垂的可能性。PDMS厚度在PDMS模具被切割成所需形状后，使用直尺进行测量。 - 在80 °C的烘箱中固化PDMS 2小时，并确保在此过程中培养皿尽可能水平放置。让PDMS模具和晶圆冷却至室温。使用锋利的手术刀和带垫镊子小心地将PDMS模具整体从晶圆上剥离。
注意：剥离PDMS时需小心，避免划伤晶圆表面。检查PDMS剥离后晶圆表面是否残留PDMS残余物，若出现残余物，表明晶圆表面需重新进行硅烷化处理。 - 将PDMS模具切割成包含目标结构的块状，并在不使用时将这些块状物存放于洁净的培养皿（直径150 mm，高度25 mm）或真空干燥箱中。操作PDMS模具时应避免触碰关键结构区域。
- 使用光刻技术分别为微流控层1和层2制备独立的SU-8基晶圆（补充文件 2 和 补充文件 3).
2. 芯片制备与器件组装
注意：使用低粘度、可紫外光固化的聚合物（最大紫外吸收波长范围为350-380 nm）通过PDMS模具制备微流控芯片。紫外光固化胶可实现聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的集成，作为透明、离子可渗透且具有弹性的细胞基底。PA凝胶的特性使其可作为组织力学应力传感器，支持活细胞成像和静态电流刺激。该芯片最终将连接至一个容纳培养基并连接电极室的卡盒。
- 玻璃盖玻片基底制备
- 用金刚石切割刀将所需数量的矩形玻璃盖玻片（170 µm）划刻至37 × 24 mm大小2，以适配卡匣尺寸（补充文件 4).
注意：盖玻片厚度为170 µm，适用于高分辨率成像，但质地较脆，需小心操作。操作时应佩戴手套和护目镜。一旦矩形玻璃盖玻片出现任何可见裂纹，应立即丢弃，因其碎片可能导致泄漏风险。也可直接向盖玻片制造商订购合适尺寸的盖玻片。避免用手直接接触矩形玻璃盖玻片表面，以免留下污渍，影响成像质量。 - 将矩形盖玻片放入洁净的培养皿中，避免重叠，然后转移至等离子腔室。抽真空后，在结束时引入少量空气。使用空气等离子体活化矩形玻璃盖玻片表面（时间30秒至5分钟，功率29.6 W，具体参数根据设备状况调整）
注意：仅使用完全暴露于等离子体的侧面（即上表面）进行后续步骤（步骤 2.1.3）。在等离子体处理后 30 分钟内完成步骤 2.1.3。若已产生空气等离子体，此时腔室应呈现粉红色至紫色。若后续键合步骤成功，可为方便起见缩短等离子体处理时间。 - 配制10 mL表面处理溶液，其中含0.3%乙酸和0.5% 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯，溶于100%乙醇中。将矩形玻璃盖玻片置于培养皿（直径150 mm，高度25 mm）中的该溶液内，在摇床中处理5分钟，以促进其与基于紫外光固化胶粘剂的微流控层之间形成良好结合。确保矩形玻璃盖玻片完全浸没于溶液中，并且两面均得到处理。
警告：表面处理液具有腐蚀性，需在通风橱中操作。 - 用100%乙醇冲洗矩形玻璃盖玻片三次，冲洗过程中避免其干燥。使用氮气和吹尘枪逐片干燥矩形玻璃盖玻片，确保足够的气流速度，以彻底清除盖玻片底面的液滴，防止液体残留形成污渍。将矩形玻璃盖玻片存放于洁净的培养皿（直径150 mm，高度25 mm）中。
注意：使用吹尘枪使气流与盖玻片基部平行，避免气流过强导致玻璃破碎。
- 用金刚石切割刀将所需数量的矩形玻璃盖玻片（170 µm）划刻至37 × 24 mm大小2，以适配卡匣尺寸（补充文件 4).
- 第1层制备（图2C)
- 将干净的第1层PDMS模具正面朝上放置于洁净的塑料培养皿盖（直径60 mm，高度15 mm）中并展平。用移液器缓慢加入500 µL液态紫外光固化胶，借助刮刀小心润湿所有凸起结构。去除润湿过程中产生的气泡。
注意：可使用胶带去除灰尘或紫外光固化胶残留物，或用乙醇清洗，以制备洁净的PDMS模具。为额外防护，不使用时应将PDMS模具存放于真空腔室中。 - 轻轻将盖玻片压到PDMS模具上。避免过量的紫外光固化胶粘剂润湿盖玻片的上表面，因为残留的紫外光固化胶可能影响盖玻片的清洁和平整。使用实验室擦拭纸去除多余的紫外光固化胶。
注意：必须确保将PDMS模具的特征结构成功转移至紫外光固化粘合层，并与将要键合的微流控芯片实现精确对齐。为此，可使用可溶性标记笔在盖玻片上标记出芯片中三个孔的中心位置。在将矩形玻璃盖玻片压下时，利用这些标记与PDMS模具上的结构特征进行对准。 - 在均匀照射的紫外光（363–370 nm，224 mW/cm²）下对结构进行部分固化2）10秒。随后用75%乙醇擦去标记。将结构牢固地固定在平面上，缓慢剥离第一层PDMS模具。
注意：部分固化可形成足够坚固的紫外光固化胶层，便于在此阶段剥离PDMS模具。这也有利于在后续步骤中与部分固化的第二层进行键合，以制备双层紫外光固化胶结构。第一层PDMS模具在制备时厚度为1.5 mm（步骤1.2.4），可确保PDMS具有足够的柔韧性，降低剥离过程中薄盖玻片破裂的可能性。PDMS模具可重复使用十至二十次，之后PDMS表面可能出现一层白色紫外光固化胶残留物，导致结构厚度减小。此时应更换新的PDMS模具。
- 将干净的第1层PDMS模具正面朝上放置于洁净的塑料培养皿盖（直径60 mm，高度15 mm）中并展平。用移液器缓慢加入500 µL液态紫外光固化胶，借助刮刀小心润湿所有凸起结构。去除润湿过程中产生的气泡。
- 第2层制备（图 2D)
- 将干净的第二层PDMS模具正面朝下放置于一块平整的PDMS基板上（基板厚度为 > 2.5 mm，以确保高刚性）。使用镊子从上方轻轻敲击特征结构，观察特征下方界面是否变暗或出现光学对比，此现象表明已实现良好接触。
注意：围绕主要结构（两个圆形开口和一条狭缝）的支撑柱对于防止PDMS模具表面下垂至关重要。 - 通过毛细作用将液态紫外光固化胶填充至PDMS模具与平板之间的空隙中。在紫外光下（363-370 nm，224 mW/cm²）对结构进行部分固化。2）10 秒。
- 用带软垫的镊子轻轻将复合的紫外光固化胶层和PDMS模具从PDMS基板上剥离。如有需要，用锋利的剪刀修剪紫外光固化胶层的多余边缘。
- 将干净的第二层PDMS模具正面朝下放置于一块平整的PDMS基板上（基板厚度为 > 2.5 mm，以确保高刚性）。使用镊子从上方轻轻敲击特征结构，观察特征下方界面是否变暗或出现光学对比，此现象表明已实现良好接触。
- 第1层与第2层粘合（图2E)
- 将连接在矩形玻璃盖玻片上的第1层置于平坦表面。将仍附着于其PDMS模具上的第2层与第1层对齐，并用力按压两层，确保 "阴影" 在“功能”下显示。
- 在紫外光（363–370 nm，224 mW/cm²）下照射10秒，使第1层和第2层固化结合，形成微流控芯片的双层结构。轻轻将PDMS模具从芯片上剥离。
注意：为了确保成功将PDMS模具从芯片上剥离，在步骤2.4.1中，使用镊子将每个PDMS支撑柱与UV可固化胶粘层2分离。此操作有助于降低PDMS模具与层2之间的整体粘附力，对剥离过程至关重要。
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳图 2F)
注意：在本步骤之前，需为多重实验准备所需数量的芯片。- 通过轻柔混合下表中的成分，配制所需刚度的PA凝胶前体溶液24 （检查 表1移液时需小心避免引入气泡，因为氧气会抑制凝胶化。
注意：TEMED 和 APS 具有毒性。操作时应在通风橱中进行，并佩戴手套。
注意：由于涉及液体体积较小（每1 mL聚丙烯酰胺凝胶前体溶液中加入1 µL TEMED），需谨慎移液和操作。凝胶刚度可能影响细胞行为，这已在众多力学生物学研究中得到证实。请根据实验需求选择最合适的凝胶刚度。荧光微球用作凝胶形变和力学应力推断的基准标记物。在将微球溶液加入聚丙烯酰胺凝胶前体溶液前，需先涡旋混匀微球溶液。建议不要最后加入小体积的TEMED，因为当两种引发剂均加入后，聚丙烯酰胺凝胶前体溶液即开始凝胶化，而小体积液体在此短暂时间内难以充分混匀。 - 立即在组织区域中央及第二层切口上方滴加10 µL PA凝胶前体溶液（图1B、2F）。用圆形玻璃盖玻片（直径10 mm）轻轻按压，使凝胶表面平整。观察PA溶液经切口流入第一层，并在屏障柱列处停止。
注意：10 µL 的 PA 凝胶前体溶液可在第二层上方形成厚度为 100 µm 的凝胶。根据所需凝胶厚度调整该体积。加入引发剂后，PA 溶液会立即开始聚合，因此应尽快将溶液移液至芯片上。施加适当压力压紧溶液，以防止溶液溢出屏障柱并堵塞通道。若通道被堵塞，则弃用该芯片。对于硬度为 5 kPa 或更低的软凝胶，需使用玻璃疏水剂处理圆形玻璃盖玻片，使其具有疏水性。具体操作为：将盖玻片浸入玻璃疏水剂中 5 分钟，用 100% 乙醇冲洗 3 次，并用氮气吹干。此处理有助于在后续将盖玻片从聚合后的凝胶上剥离时避免破坏凝胶。 - 立即在紫外光（363–370 nm，224 mW/cm²）下固化微流控芯片25分钟。等待至少约1小时，使PA凝胶完全凝固。
注意：这将使芯片完全固化，同时使聚合的PA凝胶与结构结合。步骤2.5.1、2.5.2和2.5.3应连续快速完成。 - 将芯片在HEPES（0.1 M，pH 7.4）中充分孵育至少1小时或更长时间，以润湿凝胶并松解盖玻片与凝胶之间的黏附。用尖头镊子轻轻移除盖玻片。
注意：对于硬度为5 kPa或更低的较软凝胶，需在摇床中延长孵育时间至最多10小时，以确保盖玻片能从凝胶上干净剥离，且不破坏凝胶结构。有时，在矩形盖玻片基底与基于紫外光固化胶的第1层之间会形成尺度为数十至数百微米的结构纹路。这些纹路可能干扰明场成像，但对荧光成像影响较小。可通过如步骤2.1.2所述对矩形盖玻片进行等离子体活化处理以改善此问题。
- 通过轻柔混合下表中的成分，配制所需刚度的PA凝胶前体溶液24 （检查 表1移液时需小心避免引入气泡，因为氧气会抑制凝胶化。
- 芯片与卡盒的键合（图2F)
- 将一个已清洁的医用级聚碳酸酯 cartridge 放置补充文件 4将芯片平放在平面上，底部朝上。从侧面用实验室擦拭纸擦干芯片上的凝胶。将芯片有面朝下与卡盒对齐。
注意：在测试新型盒式设计时，可采用机械加工或3D打印方法。当设计确定后，可采用注塑成型方法大规模生产该盒式组件。 - 用移液器将紫外光固化胶滴入芯片与卡盒之间的缝隙中，胶液将通过毛细作用填充缝隙。使用紫外光（363–370 nm，224 mW/cm²）照射固化。25 分钟
注意：小心避免紫外光固化胶溢出到通道内或盖玻片基底的另一侧。
- 将一个已清洁的医用级聚碳酸酯 cartridge 放置补充文件 4将芯片平放在平面上，底部朝上。从侧面用实验室擦拭纸擦干芯片上的凝胶。将芯片有面朝下与卡盒对齐。
- 去除未聚合的PA溶液
- 使用PDMS塞子和注射器，通过废液排出通道吸取约5 mL HEPES（0.1 M，pH 7.4），以冲洗对细胞有毒性的未聚合PA凝胶前体溶液。
- 将凝胶连同装置一起在每套装置中加入 2 mL HEPES 缓冲液（0.1 M，pH 7.4），置于摇床中孵育 1–2 天，以确保完全去除未聚合的 PA 凝胶前体溶液。
3. 设置完成
注意：制备好装置后，通过在PA凝胶上包被细胞外基质蛋白以用于细胞接种，将装置连接至电极腔室以进行电刺激，并将装置置于插件、支架及活细胞成像室盖中，从而完成设置（图1C），用于多重活细胞成像实验。
- 灭菌组分的制备
- 除设备外，装置的所有组件（材料表应按以下顺序进行超声处理：首先在肥皂水中超声30分钟，然后在MQ水中超声30分钟，最后在75%乙醇中超声30分钟。随后，在60 °C烘箱中干燥，并在生物安全柜中用200-280 nm紫外线照射30分钟，以实现灭菌。
- PA凝胶与细胞外基质蛋白的功能化
- 在生物安全柜中使用紫外线（200-280 nm）对装置进行灭菌。
- 在冰上用1×DPBS配制所需体积的50 µg/mL I型胶原工作液。
注意：胶原蛋白 I 储存液需置于冰上，以防止凝胶化。每个装置需要 100–150 µL 胶原蛋白 I 工作液，以完全浸没凝胶。移液时应轻柔操作，避免形成纤维。 - 在冰上配制所需量的 Sulfo-SANPAH (SS) 工作液。每处理一个凝胶需要约 80 µL SS 工作液，即将 2 µL SS 原液（溶于无水 DMSO）加入 80 µL 冷 HEPES 缓冲液（4 °C 冰箱保存，0.1 M，pH 7.4）中稀释而成。
注意：SS 对湿气敏感；为避免产品凝结水分，使用前需将储备管平衡至室温。为获得最佳效果，请使用无需称量的 SS，并在无水 DMSO 中配制储备液，且应尽快使用。配制 SS 工作液时，使用冷的 HEPES 缓冲液以降低 SS 的水解速率。每块凝胶需用 SS 工作液处理两次，以确保 PA 凝胶表面充分功能化。 - 用实验室擦拭纸轻拍凝胶边缘，将凝胶在装置中干燥。用移液器将80 µL SS工作液加至凝胶上，确保凝胶表面完全浸没于SS溶液中。用紫外光（363–370 nm，24.5 mW/cm²）处理凝胶25分钟以激活SS。用冰冷的HEPES（0.1 M，pH 7.4）洗涤3次。
注意：加样时应小心地将SS加入到 cartridge 的孔中央，以防止SS被孔壁吸附。 - 重复步骤 3.2.4，但在最后用冷的 1x DPBS 洗涤三次。
注意：步骤 3.2.3 至 3.2.5 应迅速连续进行，以防止 SS 水解。若 SS 表面活化成功，此时经洗涤的凝胶应呈现较深的红色。 - 将100 µL I型胶原溶液用移液器加至PA凝胶上，确保完全浸没凝胶。室温孵育1小时，然后用1x DPBS洗涤未结合的胶原三次。使用前将凝胶浸入1x DPBS中。
注意：I型胶原包被的样品可在4 °C冰箱中保存数天。
- 设备与电极室的连接
- 使用螺丝将装置固定在插件上（图1C，螺丝类型：M3 × 10 mm）。然后，将最多四个装置插入组件固定至专为显微镜载物台设计的支架上（螺丝类型：M3 × 5 mm）。
注意：如果未使用最大数量的装置插入组件，建议在所有其他支架插槽中放入空装置以密封空间，从而为后续的成像实验保持良好的活细胞状态。空装置可通过将卡盒粘合到空白的矩形玻璃盖玻片上简单制备而成。 - 用培养基（DMEM++，主孔中每孔2 mL）填充装置。随后通过废液清除通道再吸取2 mL培养基，以冲洗并替换1x DPBS。
- 准备两个带盖的50 mL离心管作为电极室，管盖上打适当大小和数量的通孔，用于固定铂电极和Tygon管，以连接电极室与设备。每个电极室中加入45 mL培养基。
注意：可使用锋利的手术刀片在盖子上轻松打孔。 - 准备电极室与设备之间的连接：在每个设备上安装两个管路连接器。将管夹插入每根Tygon管中图1C用注射器将培养基通过管路抽出，并用夹子将管路夹紧。将装有培养基的管路一端连接至电极室，另一端连接至装置。
注意：使用预热的培养基和/或在真空室中对培养基进行脱气，以降低管路中气泡产生的可能性。为防止在Tygon管路与管路接头连接处的界面形成气泡，可在将管路末端浸入管内培养基前，捏压管路末端使培养基表面鼓出，或对管路接头进行物理固定。 - 使用实验室升降台调节装置与电极室中培养基液面的相对高度。松开管夹，使所有培养基液面平衡至相同高度。
注意：每次移动整个装置时，务必夹紧管路夹，以防止液体溢出。 - 使用源表测量每个器件的电阻，分别进行质量控制。
注意：测量某一装置的阻力时，务必仅松开该装置的管夹，同时确保并联连接的其他装置的管夹仍牢固夹紧。
- 使用螺丝将装置固定在插件上（图1C，螺丝类型：M3 × 10 mm）。然后，将最多四个装置插入组件固定至专为显微镜载物台设计的支架上（螺丝类型：M3 × 5 mm）。
4. 单层细胞培养与活细胞实验
注意：为了形成适当的汇合单层，并实现依赖于单层细胞汇合度和电阻力的均匀分布电流密度，需确保在显微镜下进行长期成像和电刺激实验时具备合适的活细胞培养条件。
- 单层细胞培养
- 使用胰蛋白酶从T25培养瓶中消化脱离MDCK细胞。离心后计数，并计算获得0.1百万个细胞所需的培养基体积。将该数量的细胞悬浮于2 mL培养基中，在离心管中充分混匀。
- 将含细胞的培养基全部用移液器加入芯片的组织区域中。静置15分钟使细胞沉降，随后缓慢将整个装置转移至细胞培养孵箱中。
注意：每个装置的接种密度为0.1百万个细胞，相当于每平方厘米0.06百万个细胞（6 × 104 cells/cm2）。该接种密度较为稀疏，细胞需生长2天后达到融合状态。此过程可形成正确极化且均一的单层细胞，无需冲洗去除未贴附的多余细胞，从而避免对组织造成扰动。沉降步骤必须保持静止，以确保细胞均匀接种。 - 将细胞置于孵箱（37 °C，5% CO2，90%湿度）中培养72小时，使其密度达到>~50个细胞/100 μm2。每日使用倒置显微镜在相差模式下观察，以监测生长过程。
注意：以该细胞数量接种后，MDCK细胞在24小时后达到70%-80%融合度，48小时后完全融合，至72小时时细胞密度进一步增加并完成组织成熟。24小时后，细胞平均长度约为10-20 µm。48小时时，细胞间连接和细胞体在相差成像下具有清晰对比。该对比在72小时后显著减弱。
- 活细胞成像
- 根据实验需求选择落射荧光显微镜或共聚焦显微镜。当细胞表达或染色了荧光标记物时，选择共聚焦显微镜以实现对细胞形态和凝胶基底形变的三维观察。对于二维观察，选择相差和落射荧光显微镜，因其光毒性较低。在将装置移至显微镜前1小时开启活细胞成像系统，使显微镜载物台孵箱稳定至37 °C、5% CO2和90%湿度。
注意：活细胞系统控制器会显示载物台孵箱内的环境条件，并在条件不理想时发出警报。由于载物台孵箱盖需容纳向外延伸的装置管路，与商用型号不同，因此需要重新校准，以确保长时间实验（数天至一周）中的良好活细胞培养条件。校准可依据用户手册进行，且实验中传感器位置应与校准时保持一致。需检查载物台孵箱中培养基的蒸发速率，并使用含酚红的培养基监测pH条件。 - 将装置安装至显微镜上，电极室置于两侧。确保显微镜电动载物台有足够的移动空间，不会碰撞电极室。确保装置与电极室之间的培养基液面高度平衡且一致。
注意：装置孔中的培养基液面（即组织区域所在位置，图1C）对明场和相差成像有显著影响。弯月面会导致不必要的光线聚焦。应确保液面平坦并与孔口齐平，但需注意活细胞成像室中的培养基蒸发会随时间导致该平坦表面发生变形。为解决此问题，一种方案是在液面上放置一片与液面接触的平玻璃盖玻片以展平表面。该盖玻片面积应小于孔径，以免阻碍气体交换，而气体交换对细胞生长至关重要。另一种方案是在培养基表面覆盖一层细胞培养级矿物油。 - 设置软件。
- 使用落射荧光显微镜进行全组织成像时，选择10x或20x物镜；进行高分辨率共聚焦成像时，选择30x物镜（工作距离0.8 mm，数值孔径NA 1.05）。
- 进行全组织成像时，选择多个视野以覆盖组织区域的矩形范围（图1A，例如5行×5列，中间行为覆盖狭缝的区域，其余位于狭缝外）。根据结果部分所用细胞系选择荧光和明场通道（488通道用于绿色荧光，561通道用于红色荧光）。为减少长期成像实验（持续数天）中的光毒性，选择1小时的时间间隔。
注意：若需更大范围观察整个组织，也可选择其他物镜，如4x。
- 根据实验需求选择落射荧光显微镜或共聚焦显微镜。当细胞表达或染色了荧光标记物时，选择共聚焦显微镜以实现对细胞形态和凝胶基底形变的三维观察。对于二维观察，选择相差和落射荧光显微镜，因其光毒性较低。在将装置移至显微镜前1小时开启活细胞成像系统，使显微镜载物台孵箱稳定至37 °C、5% CO2和90%湿度。
- 电刺激
- 检查装置数量、各装置的相对电阻及目标电流，确定整个实验装置在数小时至一周时间内所需的总电流。
- 在电流钳模式下施加电信号。对于三个具有相同通道电阻的装置，设置一个对照组（无电流，管夹夹紧）、一个顶-基底（AtB）电流条件和一个基底-顶（BtA）电流条件（图1D），使用源表提供20 µA的总电流。由此每个装置获得10 µA电流，估算电流密度约为10 µA/cm2，具有生理相关性（详见讨论部分）。
注意：总电压约为数十毫伏，具体取决于Tygon管路长度。该电流可连续施加数天至一周。电极室中的酚红指示剂会变色（正极所在电极室更偏酸性），但在已良好校准的载物台孵箱中不会变色。只要活细胞条件维持良好，细胞将保持健康状态。研究人员可每隔一天更换一次载物台孵箱中的培养基，每数天更换一次电极室中的培养基。更换电极室时应夹紧管夹，防止培养基溢出。如步骤3.1.1所述，记得保留一个空装置以占位，确保活细胞成像室处于正确状态。
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结果
本文所示所有结果均改编自先前的出版物4；更多细节请参考该出版物。
本方案允许在垂直于细胞或组织平面的方向上施加外部离子电流或电场。这种电刺激可扰动内源性的跨上皮电势差（TEPD），从而研究TEPD在调控组织行为中的作用。按照本方案，将野生型及基因编辑的MDCK细胞（GFP-肌动蛋白、H1-GFP和GFP-E-钙黏蛋白MDCK细胞）接种于装置上，并培养三天至完全融合。为研究电流方向的影响，将三个装置置于支架上，并连接至同一电极室和电流源表。其中一个装置作为对照组（无电流，用Tygon管夹闭），另外两个装置则以相反方向放置，使电流方向彼此相反（BtA：电流方向为基底侧至顶侧；AtB：电流方向为顶侧至基底侧）。整个装置安装于共聚焦显微镜上，并配备活细胞培养室，实验开始前平衡1–2小时。为观察整体组织行为，选用10倍或20倍物镜，因其具有较大的视野。在每个芯片上选择多个成像位置，如步骤4.2.3所述。电流根据步骤4.3.1进行施加。
施加电流产生的机电效应被用作初步指标，以检测电刺激是否...
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讨论
本方案提供了用于构建一种新型微流控装置的详细步骤和设计原理，以开展跨上皮电势扰动实验，并通过活细胞成像和力学生物学方法研究生物电效应。与其它相关方法相比，该方法的优势显而易见。例如，一种相关方法使用具有单通道设计的简单微流控芯片，施加平面内静态电流以研究电趋化性（即细胞迁移随电流密度变化的现象）15,16。这两种芯片设计在所施加电流的对称性以及电流所调控的细胞行为方面存在显著差异。诱导电趋化性的电流作用于细胞的前-后极性及细胞迁移过程，而扰动跨上皮电势（TEPD）的电流则作用于细胞的顶-基底极性及组织稳态。另一种与本方案中所述方法可比的技术是利用流体泵和类似微流控芯片结构，施加垂直于上皮平面的流体流动25。在此情况下，两种芯片在物理刺激的对称性方面相同，且不同物理刺激所诱导的细胞行为之间存在相似之处。然而，这两种方法在细胞对物理刺激响应的具体机制（一种源于电学刺激，另一种源于流体动力学刺激）、制造技术、细胞基底以及力学测量能力等方面仍存在差异。此外，本方案中的芯片不含任何机...
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披露
确保所有作者均已披露任何及所有利益冲突。
致谢
XJ、PX、FF 和 TBS 感谢与高绪梅博士、 俞欣如以及西湖大学组织生物物理学实验室其他成员的有益讨论。我们感谢西湖大学定制技术服务设施（CTSF）在示意图绘制方面提供的协助。本工作得到西湖教育基金会、西湖大学生命科学与生物医学实验室以及西湖大学未来产业研究中心（RCIF）的支持。
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材料
参考文献
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