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用阿尔新蓝染色后斑马鱼颅面组织的解剖

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DOI：

10.3791/68900

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2025年9月12日

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

本文内容

摘要

本文所述方案提供了一种简单且易于操作的方法，用于对5日龄斑马鱼幼鱼的颅面软骨进行染色和解剖。该方法可用于在不同发育条件下研究这些结构的解剖形态、形状和大小。

摘要

斑马鱼由于其光学透明性，是研究颅面软骨在胚胎中形成机制的优良脊椎动物模型。颅面软骨 broadly 可分为两大类：脑颅（neurocranium）和咽颅（viscerocranium），这两类又可进一步细分为多个软骨群，分别用于支撑大脑以及构成摄食和呼吸装置等。本实验方案首先描述一种在斑马鱼中简单且成熟的染色方法，用于可视化这些软骨群，随后介绍分离脑颅与咽颅的解剖技术。通过这些解剖操作，可轻松获取简单的形态与大小测量参数；在本方案中，以腭部为例进行演示，腭部属于前脑颅的一部分，而该组织在人类大多数颅面发育障碍中常受到影响。本方案可在资源有限的条件下以简便方式重复实施，因此为本科生学习颅面形态学提供了有价值的教育工具。

引言

脊椎动物的颅面软骨起源于一种称为颅神经嵴细胞的多能细胞群体1。这些细胞最初在胚胎早期神经板的背侧边缘被确定，随后长距离迁移至颅面区域和咽弓，再进行分化2,3。驱动这一迁移和分化过程的信号机制在脊椎动物中高度保守4,5。尽管如此，不同物种间各个软骨单元的组织结构、大小和形状各不相同，从而形成了多样的颅面形态6。斑马鱼尤其成为研究颅面形态发生的有力模型系统，因其胚胎在幼体阶段之前具有透明特性。通过简单的软骨标记染色方法，研究人员已在不同信号通路扰动条件下7,8,9，以及胚胎或幼体暴露于环境中常见污染物的情况下10，对斑马鱼多种颅面结构的形态进行了表征。本文所述的用于标记软骨的阿尔新蓝（Alcian blue）染色法采用Walker和Kimmel建立的非酸性条件标准11，此后已被众多研究颅面发育的斑马鱼实验室广泛采用5,12,13,14,15,16,17,18,19，包括在高中教学环境中应用的描述20。无酸染色法可完整保留骨组织结构，从而能够分别使用阿尔新蓝和茜素红（alizarin red）对软骨和骨骼进行联合染色。然而，目前尚缺乏一套详细的染色操作流程以及颅面软骨精确解剖的实验方案，特别是可用于资源有限条件下开展此类研究的标准化指南。

尽管成年斑马鱼的面部骨骼结构相当复杂，由43块软骨衍生的骨骼组成21，但在受精后5天（dpf）刚具备摄食能力的幼鱼中，颅面软骨结构相对简单，可大致分为背侧的神经颅和腹侧的咽颅4。这些结构为脑部提供支撑，参与摄食器官的构成，并为鳃组织提供支持性软骨。本文所述方案将介绍使用阿利新蓝（Alcian blue）对斑马鱼软骨进行染色，随后详细描述将神经颅和咽颅解剖为独立结构的操作步骤，从而实现对这些结构中各类软骨的形态和大小进行细致表征。例如，我们测量了属于神经颅一部分的腭部前区（口腔顶部）——即筛骨板的尺寸。

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方案

本研究中使用的斑马鱼饲养和实验程序已获得机构动物伦理委员会批准，批准文号为 TIFR/IAEC/2023-1。

1. 试剂准备

  1. E3 培养基：
    1. 通过将 3.25 g 磷酸氢二钠（0.458 mM Na2HPO4）、0.29 g 磷酸二氢钾（0.042 mM KH2PO4）、11.93 g 氯化钠（4.084 mM NaCl）和 0.48 g 氯化钾（0.128 mM KCl）溶于 1 L 蒸馏水中，配制 50 倍浓缩液 1。 
    2. 通过将 2.43 g 氯化钙（0.33 mM CaCl2）和 4.07 g 硫酸镁（0.33 mM MgSO4）溶于 1 L 蒸馏水中，配制 50 倍浓缩液 2。
    3. 配制 500 mL 1 倍 E3 培养基时，向 480 mL 蒸馏水中加入各 10 mL 的浓缩液 1 和浓缩液 2（pH = 7.4）。
      注意：配制这些溶液时需佩戴手套。
  2. 1 倍 PBS（磷酸盐缓冲液）中含 4% 多聚甲醛（PFA）：
    1. 将 100 mL 1 倍 PBS 预热至 68 °C，加入 4 g PFA，并在 68 °C 下间歇搅拌孵育，直至 PFA 完全溶解。
      注意：配制该试剂时需佩戴手套和口罩，最好在通风橱中操作，因为 PFA 具有高毒性。
  3. 0.05% MS-222（俗称三卡因）溶液：
    1. 用 E3 配制 4% 三卡因储备液，并于 4 °C 保存。配制 10 mL 三卡因储备液时，将 0.40 g MS-222 溶于 7 mL E3 中，轻轻振荡混匀，再加溶剂定容至 10 mL。配制 50 mL 0.05% 三卡因溶液时，取 625 µL 4% 储备液加入 49.375 mL E3 中。
      注意：配制该试剂时需佩戴手套和口罩。
  4. 70% 乙醇中含 0.4% 阿利新蓝的储备液：
    1. 配制 2 mL 储备液时，将 8 mg 阿利新蓝溶于 1 mL 50% 乙醇中，在 37 °C 下加热 15–20 分钟并间歇搅拌以助溶解。染料完全溶解后，加入 900 µL 100% 乙醇和 100 µL 蒸馏水，使乙醇终浓度为 70%。
      注意：该储备液可在室温下保存最多 2 周。
  5. 染色液 —— 含 0.02% 阿利新蓝、200 mM 氯化镁（MgCl2）和 70% 乙醇：
    1. 配制 5 mL 阿利新蓝染色液时，将 1 mL 1 M MgCl2、3.5 mL 100% 乙醇和 250 µL 0.4% 阿利新蓝储备液（即 8 mg 阿利新蓝溶于 2 mL 70% 乙醇中）加入 250 µL 水中，充分混匀。
      注意：为获得最佳染色效果，应现配现用。
  6. 漂白液：
    1. 等体积混合 3% 过氧化氢（H2O2）和 2% 氢氧化钾（KOH）。配制 2 mL 漂白液时，混合 1 mL 3% 过氧化氢和 1 mL 2% 氢氧化钾。
      注意：应在实验开始前新鲜配制该溶液。由于 H2O2 对光敏感，应尽量避免光照。操作 H2O2 和 KOH 时需佩戴手套。
  7. 溶液 I：20% 甘油 + 0.25% KOH
    注意：甘油黏度较高，移液时需小心。配制这些溶液时需佩戴手套。
    1. 配制 5 mL 溶液 I 时，将 2 mL 50% 甘油和 625 µL 2% KOH 加入 2.375 mL 水中，充分混匀。
  8. 溶液 II：50% 甘油 + 0.25% KOH
    1. 配制 5 mL 溶液 II 时，将 3.570 mL 70% 甘油和 625 µL 2% KOH 加入 805 µL 水中，充分混匀。
  9. 保存液：50% 甘油 + 0.1% KOH
    1. 配制 5 mL 保存液时，将 3.570 mL 70% 甘油和 250 µL 2% KOH 加入 1.180 mL 水中，充分混匀。
  10. 3% 琼脂糖
    1. 将 3 g 琼脂糖溶于 100 mL 蒸馏水中，微波加热至溶液澄清。
  11. 0.1% PBST（含 0.1% Tween 20 的 1 倍 PBS）
    1. 配制 1 L 1 倍 PBS 时，将 8 g NaCl、0.20 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶于 1,000 mL 蒸馏水中，混匀后调节 pH 至 7.4。配制 500 mL 0.1% PBST 时，将 5 mL 10% Tween 20 加入 495 mL 1 倍 PBS 中。
  12. 0.50 µg/mL DAPI 溶液
    1. 用 1 倍 PBS 配制 10 mg/mL DAPI 储备液。配制 10 mL 0.50 µg/mL DAPI 溶液时，取 0.50 µL 储备液加入 10 mL 1 倍 PBS 中，剧烈振荡以确保 DAPI 完全溶解。
      注意：配制这些溶液时需佩戴手套。DAPI 对光敏感，应避光保存。DAPI 储备液可在 4 °C 下保存一年以上。

2. 胚胎收集

  1. 在需要胚胎的前一天晚上，将雄性和雌性斑马鱼成对放入繁殖缸中，用隔板将雄鱼和雌鱼分开。
  2. 次日早晨移除隔板，并在移除隔板后15–20分钟内收集胚胎。
    注意：移除隔板的时间有助于斑马鱼胚胎和幼鱼的发育分期。
  3. 将胚胎在28.5 °C条件下培养至5 dpf。
    注意：务必每两天将E3培养基更换为一批预热至28.5 °C的新鲜E3培养基。

3. 阿利新蓝染色

注意：进行本实验时请佩戴手套

  1. 使用含有0.05%三卡因的溶液在2 mL微量离心管（MCT）中麻醉20-25条5日龄的斑马鱼幼鱼。
  2. 待幼鱼完全停止活动（通常需要约4-5分钟）后，吸除麻醉液，并加入1.5 mL 4%多聚甲醛（PFA），在室温（RT）下以60 rpm转速于摇床上固定2小时。
  3. 用移液器尽可能吸除固定液，向样品中加入1.5 mL 50%乙醇，于室温下以60 rpm转速在摇床上孵育10分钟。
  4. 用移液器尽可能吸除乙醇，加入1.5 mL阿辛蓝染色液。
  5. 将固定后的幼鱼在染色液中于室温下以60 rpm转速在摇床上孵育18-20小时。
    注意：孵育时间过短或过长可能导致软骨某些区域染色不足或过度染色。本实验中，18-20小时的染色时间最有利于清晰显示5日龄幼鱼的神经颅和咽颅结构。
  6. 吸除染色液，加入1.5 mL蒸馏水，在室温下以60 rpm转速于摇床上孵育1-2分钟。
    注意：此步骤可作为染色终止点，用于观察解剖后软骨中的细胞边界。然而，若在此步骤停止染色流程而不进行后续透明化处理，神经颅和咽颅的边界仍会略显模糊，从而增加精确解剖的难度。
  7. 向样品中加入1 mL漂白液，在室温下敞口孵育20分钟（培养板或孔板不得加盖）。
    注意：此步骤中不得封闭MCT管，因为过氧化氢与氢氧化钾反应会产生氧气，若管盖密闭可能导致盖子弹开。
  8. 吸除漂白液，并进行以下组织透明化步骤。
    1. 向样品中加入1.5 mL溶液I，在室温下以60 rpm转速于摇床上处理40分钟。
    2. 吸除溶液I，加入1.5 mL溶液II，在室温下以60 rpm转速于摇床上处理2小时。
      注意：透明化步骤有助于去除多余的染料，提高样品的光学透明度，从而更高效地完成解剖操作。更换溶液时应小心操作样品，任何损伤都可能影响后续形态学分析。
  9. 吸除溶液II，加入1.5-2 mL保存液。由于甘油的存在，染色后的样品会在10分钟内逐渐沉降至管底。
    注意：染色后的样品可在4 °C条件下保存超过一年。

4. 颅面骨骼的解剖

  1. 将3%琼脂糖溶液放入微波炉中加热至溶液变得澄清。
    注意：不要过热，以免溶液从烧瓶中溢出。执行此步骤时需密切观察溶液状态。
  2. 向一个90 mm的培养皿中倒入熔化的琼脂糖，覆盖培养皿深度的三分之一，待其凝固，以完成3%琼脂糖的包被。后续解剖操作将在该培养皿中进行。
    注意：包被有琼脂糖的培养皿可提前一周制备，并于4 °C保存。琼脂糖涂层提供较柔软的基底，可防止解剖过程中损伤镊子。
  3. 用70%乙醇清洁将要使用的镊子，并用干净的标准实验室纸巾擦拭。
  4. 使用巴斯德移液管，将3-4条染色后的幼体连同0.5 mL保存液转移至包被琼脂糖的培养皿中。
    注意：与在E3溶液中操作相比，使用保存液可提供更佳的光学清晰度，有利于解剖操作。
  5. 将一条染色幼体侧卧放置（图1A），用镊子小心刮除幼体体部的卵黄。
    注意：图1B显示的是已去除卵黄的胚胎。建议在继续后续解剖步骤前，将已去除卵黄的胚胎转移至新的培养皿中，以避免漂浮的黏性卵黄团干扰解剖过程。
  6. 去除卵黄后，用一把镊子夹住幼体尾部区域，用另一把镊子小心去除眼睛。
    注意：图1C显示的是已去除卵黄和眼睛的胚胎。去除眼睛时需格外小心，因其靠近颅面骨骼，可能干扰解剖操作。
  7. 用镊子小心牵拉并夹除位于神经颅背侧的脑组织及其他组织。用一对镊子固定幼体，用另一对镊子在中部进行切开（图1C，红色箭头），随后夹除 组织（图1D）。
    注意：执行此步骤时，需特别注意靠近神经颅最前端区域的组织去除，以免软骨随组织一同被剥离。
  8. 将幼体头部与身体其余部分分离。此步骤完成后，头部区域主要包含神经颅和黏附于其上的咽颅，二者在前后两端各有一个连接点，此外还有一些小的未染色组织附着于这些颅面结构上（图1E）。
    注意：直接附着于神经颅和咽颅上的未染色组织很难完全去除。尽管可能存在少量残留组织，但由于其未被染色，不会影响后续的形态或大小分析。
  9. 小心切断神经颅与咽颅之间的两个连接点，使其分离（图1F，红色虚线）。参见图2，了解完整及解剖后胚胎中神经颅和咽颅的图像。
  10. 在洁净的载玻片上滴加一至两滴100%甘油。借助镊子，小心将解剖得到的神经颅或咽颅转移至载玻片上。用镊子轻轻盖上盖玻片，确保无气泡产生，并用指甲油密封所有载玻片的盖玻片边缘。
    注意：这些玻片可在4 °C保存超过一年，染色不会褪去。

5. 筛板尺寸的量化

  1. 使用连接到体视显微镜的相机获取腭部图像（图 2D）。若无科研级相机，可将普通智能手机连接至体视显微镜以获取图像。
  2. 为进行定量分析，将腭部图像载入 FIJI 软件中22 然后，使用 线条工具 测量筛板的宽度和高度（单位：微米）（参见 图3A- C）并利用相机的像素分辨率确定其尺寸。
  3. 在筛骨板周围绘制轮廓，然后单击 分析 | 设置测量 | 面积 以获得筛板的面积（图3D，E).

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结果

斑马鱼颅面骨骼在受精后5天（dpf）完全由软骨构成，因此可以使用阿利新蓝（Alcian blue）进行染色。阿利新蓝是一种碱性染料，能够与软骨中大量存在的糖胺聚糖结合23。染色后软骨呈蓝色（图1），在大多数本科实验室常见的体视显微镜下即可将其与幼鱼中的其他组织区分开来。刮除卵黄（图1B）并移除眼睛（图1C）后，从头部背侧和腹侧分别观察，可清晰看到神经颅和咽颅结构（图2B、C）。随后可将神经颅与咽颅分离（图2D、E），并进一步解剖出感兴趣的特定颅面软骨，以便对其形态和尺寸进行表征分析。

通过这些神经颅和咽颅的简单示意图（图2D

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讨论

颅面畸形占人类所有出生缺陷的大多数，常导致婴儿死亡。然而，大多数颅面异常的潜在病因仍有待阐明25。在任何脊椎动物中，颅面结构都十分复杂；从本科教学的角度来看，首要需求是拥有一种教育工具，能够为学生提供颅面区域不同结构的总体概述。然而，在大多数教学环境中，获取哺乳动物胚胎是不可行的。相比之下，斑马鱼在小型实验设施中更易于维持26，因而成为更简便的模式系统，并且在早期幼体阶段具有透明体和相对简单的颅面解剖结构等额外优势4。

尽管本研究中描述的实验方案已在大多数从事颅面形态发生研究的斑马鱼实验室中得到广泛应用且十分成熟，但尚未以一种简洁明了的形式进行清晰阐述，尤其缺乏便于本科生实验室将其作为实践工具采用的详细说明。本方案所描述的染色方法操作简便、易于掌握，能够实现对深藏于头部内部的颅面组织进行可视化观察，甚至无需将其解剖分离。然而，该方法仅适用于检测明显的形态学变化；若需对单个颅面结构的大小和形状进行精确表征，则仍需将其解剖取出。该实验方案仅需两...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢Kalidas Kohale博士及其团队对鱼类养殖设施的维护。SRN感谢印度政府原子能部（DAE）（项目编号：RTI4003，DAE文件号：1303/2/2019/R&D-II/DAE/2079，日期：2020年2月11日）、马克斯·普朗克学会伙伴小组项目（M.PG.A MOZG0010）以及科学与工程研究委员会启动研究资助（SRG/2023/001716）提供的经费支持。我们感谢实验室的Shweta Verma博士对本文提出的宝贵意见。我们感谢Swetha Nagarajan和Upal Chatterjee在 manuscript 插图制作过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Lonza bioscience50004用于包被培养皿
阿利新蓝 8G Sigma-AldrichA3157用于染色软骨
氯化钙二水合物Sigma-Aldrich12022用于配制缓冲液
相机OlympusDP28用于图像采集
DAPIRoche Life Sciences10236276001用于细胞核标记
乙醇Honeywell32221阿利新蓝染色的溶剂
FIJI版本：ImageJ 1.54f
镊子DumontDumont用于解剖操作
甘油MP biomedicals193996用于配制洗涤液和封片样品 
过氧化氢MP biomedicals194057用于配制漂白液
六水合氯化镁SARD BiosciencesSBRC0217用于配制缓冲液
七水合硫酸镁Sigma-AldrichM2773用于配制缓冲液
MS-222（三卡因）Sigma-AldrichA5040用于麻醉幼虫
氯化钾Sigma-AldrichP9541用于配制缓冲液
氢氧化钾Sigma-Aldrich484016用于配制缓冲液
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP0662用于配制缓冲液
氯化钠Sigma-AldrichS3014用于配制缓冲液
磷酸氢二钠Sigma-Aldrich71640用于配制缓冲液
体视显微镜OlympusSZX61用于解剖操作
吐温-20HIMEDIATC287去垢剂，用于细胞通透处理

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