本研究探讨富含血小板纤维蛋白（PRF）中生长因子释放的昼夜节律变化，并分析其与皮质醇水平的相关性，旨在优化基于PRF的再生治疗操作时机。
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摘要
摘要
富血小板纤维蛋白（PRF）在牙科领域具有广泛的临床应用，尤其在软硬组织再生、拔牙窝愈合、牙周缺损治疗、上颌窦提升以及黏膜牙龈手术中。PRF 是一种来源于血小板、富含生长因子的生物材料，通过单步离心法即可制备。via 单步离心方案制备。本研究旨在评估 PRF 来源的生长因子在早晨与傍晚之间是否存在昼夜节律性变化。20 名健康志愿者参与了研究，每人分别在 08:00 和 20:00 各采集三份静脉血样本。每个时间点的三份样本分别用于全血细胞计数、血清皮质醇分析以及 PRF 制备（以 708 × g 离心 12 分钟）。采用 ELISA 法在 24 小时和 72 小时检测 PRF 中的生长因子（IGF-1、PDGF、FGFR、VEGF、TGFβ-1）水平，并比较不同时间点之间的差异，同时与血清皮质醇水平进行相关性分析。结果显示，傍晚采集样本中 FGFR 在 72 小时的水平显著高于 24 小时；然而，IGF-1、PDGF、VEGF 和 TGFβ-1 在早晨与傍晚之间的水平均无显著差异。早晨样本中，皮质醇水平在 72 小时时与 PDGF 呈负相关；傍晚样本中，皮质醇水平在 72 小时时与 IGF-1 呈负相关；但未观察到其他具有统计学意义的相关性。这些结果提示，采血时间对 PRF 中生长因子含量无显著影响，表明在临床操作中关于采样时间的选择具有灵活性。
引言
富血小板纤维蛋白（PRF）是一种第二代血小板浓缩物，因其自体来源、制备简便以及富含生物活性成分，常用于再生牙科治疗1通过不含抗凝剂的全血离心制备，富血小板纤维蛋白（PRF）可提供富含血小板和白细胞的纤维蛋白基质，这些细胞可分泌多种生长因子，如血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子受体（FGFr）。这些生物分子在细胞增殖、血管生成、细胞外基质重塑及组织再生过程中发挥核心作用。2与需要抗凝剂和外源性激活的富血小板血浆（PRP）相比，富血小板纤维蛋白（PRF）的制备无需抗凝剂和外源性激活 通过 一种单步、无需抗凝剂的处理过程，可生成含有包埋白细胞和血小板的生理性纤维蛋白支架。该结构可支持生长因子和细胞因子更缓慢、更持久的释放，有望增强伤口稳定性及早期组织修复，同时降低操作复杂性和成本1,2此外，由于不含抗凝剂和激活剂，可最大限度减少因操作带来的变异，更有利于保持血小板的天然行为，从而在临床椅旁应用及不同操作者间的标准化方面提供实际优势。2.
尽管富血小板纤维蛋白（PRF）在临床上广泛应用，但其生物活性成分的时间动态变化仍不甚清楚。昼夜节律是一种内在的24小时生物周期，影响着多种生理系统，包括免疫功能、激素分泌和血液学参数3,4。皮质醇作为主要的昼夜节律激素，其水平在清晨达到峰值，并在一天中逐渐下降5。重要的是，研究表明，血小板活性、聚集能力及计数也可能受到昼夜节律机制的调节，这对凝血和伤口愈合具有重要意义6。
由于富血小板纤维蛋白（PRF）直接来源于外周血，采血的昼夜节律时间可能影响血小板的活化状态，以及纤维蛋白聚合过程中生长因子的后续释放。尽管Aoto等人此前已分析过富血小板血浆中血小板计数和生长因子的昼夜变化7，但尚无研究系统地探讨在一天中不同时间制备的PRF是否在生长因子组成上表现出可测量的差异。因此，本项初步研究旨在通过比较健康个体在早晨和傍晚采集的样本，探讨PRF来源生长因子的昼夜节律变化。此外，我们还评估了每个时间点的血清皮质醇水平，并探索其与PRF生长因子释放之间的相关性。了解此类时间上的变异性可能有助于优化临床方案，并促进基于PRF的再生治疗的标准化。本研究的零假设为：采血的昼夜节律时间对从富血小板纤维蛋白（PRF）中释放的生长因子浓度无显著影响；然而，基于已知的血小板活性和激素分泌的昼夜节律调控机制，我们初步假设采血时间（早晨与傍晚）可能改变PRF中的生长因子含量。从临床角度来看，明确PRF生长因子含量是否对昼夜节律变化敏感，对于再生治疗方案的标准化具有重要意义。如果生长因子的释放在整个白天保持相对稳定，临床医生便可确信静脉穿刺的时间不会显著影响治疗效果，从而在安排操作时间上具有更大的灵活性。相反，如果某些特定因子（如参与血管生成或组织修复的因子）出现细微差异，则可在需要最大化再生潜力的情况下优化采血时间，例如在愈合能力受损的病例中。
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方案
本研究在土耳其阿达纳的Çukurova大学牙科学院牙周病学系进行，共有20名健康志愿者参与。在纳入研究前，所有参与者均被告知研究的目的、方法和操作流程，并签署了书面知情同意书。本研究已获得Çukurova大学医学院临床研究伦理委员会的伦理批准（批准号：125/55，日期：2022年9月16日）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）与疾病控制与预防中心（CDC）指南8，包括处理人血样本所需的基本生物安全指导，以及对生物危害材料和化学试剂的废弃物处置说明。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 受试者选择
纳入研究的受试者为18至25岁之间的健康个体，无任何已知的全身性疾病，并在操作过程中表现出足够的配合性。若个体存在任何全身性疾病、处于妊娠或哺乳期，或正在使用可能影响血液学或激素参数的药物或激素类制剂，则被排除在外。
2. 血液采集与分组
每位参与者共采集六份10 mL静脉血样本，其中三份在早晨（08:00）采集，三份在晚上（20:00）采集。研究中使用无添加剂的无菌PRF玻璃管（10 mL）。早晨采集时，1号管用于全血细胞计数（CBC），2号管用于血清皮质醇分析，3号管用于PRF制备及后续生长因子分析。晚上采集时，4号管用于全血细胞计数（CBC），5号管用于血清皮质醇分析，6号管用于PRF制备及生长因子分析。根据采血时间，样本分为两组：第一组为由早晨血液（08:00）制备的纯PRF，第二组为由晚上血液（20:00）制备的纯PRF。
3. PRF 制备
血液样本使用配备40°固定角转子和10 mL玻璃管的离心机，在室温下以708 × g离心12分钟。所用设备的转子半径可在88 mm至110 mm之间调节；本研究中选择88 mm的半径以标准化操作流程。操作过程中未使用任何抗凝剂。离心后，对获得的富血小板纤维蛋白（PRF）进行宏观评估，以确保其正确形成，其特征为表面光滑均匀、呈弹性圆柱形，且结构致密坚实。
4. 生长因子ELISA分析
使用无菌剪刀将富血小板纤维蛋白（PRF）凝块小心地从红细胞层分离。每个凝块称重后，根据重量以1:1的比例（g = mL）加入RPMI-1640培养基，以标准化所有样本的孵育环境，并确保可溶性生长因子从PRF基质中的一致扩散。该比例可根据凝块大小实现成比例提取，从而减少因凝块质量不均导致的生长因子浓度差异。样本在3 °C条件下，于100 rpm的摇床中分别孵育24小时和72小时，以促进生长因子从PRF基质均匀扩散至培养基中。孵育结束后，收集上清液并储存在−8 °C直至分析。采用商用ELISA试剂盒对生长因子浓度进行定量检测，包括FGFR、VEGF、IGF-1、PDGF和TGF-β1，操作步骤严格按照制造商提供的制备方案进行9,10。
5. ELISA 步骤
将标准品和样品（各100 µL）加入孔中，在3 °C孵育90分钟。随后用洗涤缓冲液洗涤孔板三次。接着，每孔加入100 µL生物素标记的抗体，在3 °C孵育60分钟，之后再进行三次洗涤。然后，每孔加入100 µL辣根过氧化物酶（HRP）溶液，在3 °C孵育30分钟。再次洗涤三次后，每孔加入100 µL底物试剂，孵育15分钟。最后，每孔加入50 µL终止液，并在450 nm处测定吸光度。
6. 统计学分析
分类变量以频数和百分比表示，数值变量则根据情况以均值 ± 标准差或中位数（最小值-最大值）表示。数值变量的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估。对于不符合正态性假设的变量（特别是生长因子浓度和皮质醇水平），采用非参数检验进行分析，包括用于配对比较的Wilcoxon符号秩检验和用于相关性分析的Spearman秩相关系数。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics软件完成。以 p 值 <0.05 为差异具有统计学意义。所有比较均在个体内部进行，以控制个体间变异的影响。
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结果
所有20名志愿者（10名女性和10名男性，年龄在18至25岁之间）均完成了研究，无任何样本丢失。全血细胞计数结果证实，所有样本的血小板及血液学参数均在正常参考范围内，表明PRF制备物的可靠性。
早晨与傍晚血液参数的比较
皮质醇水平在早晨样本中显著高于傍晚（p < 0.001），反映了生理性的昼夜节律。白细胞计数在傍晚样本中较高（p = 0.001），而红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）和红细胞压积（HCT）在早晨显著升高（所有指标 p < 0.001）。（表1）血小板计数（PLT）和血小板分布宽度（PDW）未见显著差异。然而，平均血小板体积（MPV）（p < 0.001）、大型血小板比率（PLCR）（p = 0.002）和血小板压积（PCT）（p < 0.001）在傍晚样本中显著升高。
皮质醇、白细胞和血小板指标中观察到的显著昼夜差异支持了以下假设：系统性生理参数随一天中的时间变化，可能影响富血小板纤维蛋白（PRF）的组成。
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讨论
基于已知的血小板活性和激素分泌的昼夜节律调控，最初假设血液采集时间（早晨 vs. 晚间）可能影响富血小板纤维蛋白（PRF）中生长因子的含量。本研究旨在检验是否存在此类时间差异，以及这种差异是否与血清皮质醇水平和血液学参数相关。本研究设计为一项初步探索性研究，以考察PRF来源的生长因子释放是否存在昼夜节律性变化。因此，未进行正式的样本量计算。然而，事后功效分析表明，当前样本量（n = 20）已足以提供初步数据，用于估计未来研究的效应量。
研究结果表明，大多数生长因子（IGF-1、PDGF、VEGF 和 TGF-β1）在早晨和傍晚样本之间无显著差异，而 FGFR 水平在 72 小时后傍晚样本中显著升高。这些结果提示，PRF 来源的生长因子释放全天基本稳定，仅在部分标志物中观察到有限的昼夜节律敏感性。
多项研究已记录到血小板生物学的昼夜节律调节，包括血小板计数、反应性及血栓形成风险的变化，这些指标通常在清晨达到高峰，原因是血小板聚集增强和纤溶活性降低6。这一现象被认为...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | DUO | 913023410238 | |
| ELISA试剂盒 | Fine Test, 武汉菲恩生物科技有限公司 | IGF-1（目录号：EH0165） | |
| ELISA试剂盒 | Fine Test, 武汉菲恩生物科技有限公司 | PDGF（目录号：EH3531） | |
| ELISA试剂盒 | Fine Test, 武汉菲恩生物科技有限公司 | FGFR（目录号：EH0715） | |
| ELISA试剂盒 | Fine Test, 武汉菲恩生物科技有限公司 | VEGF（目录号：EH0327） | |
| ELISA试剂盒 | Fine Test, 武汉菲恩生物科技有限公司 | TGF-β1（目录号：EH0287） | |
| PRF管 |  | 6370 |
参考文献
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