建立和维持患者来源的前列腺癌类器官：一份详细的实验方案

摘要

前列腺癌的异质性和治疗耐药性仍是当前面临的挑战。本文介绍一种用于建立患者来源类器官（PDOs）的实验方案，该类器官可保留亲本肿瘤的关键特征。这一标准化模型有助于药物筛选及精准医学的发展。

摘要

前列腺癌（PCa）是一种高度异质性的恶性肿瘤，也是男性癌症相关死亡的主要原因之一，在治疗耐药性和疾病进展方面存在显著的临床挑战。现有的临床前模型，如二维（2D）细胞系和患者来源的异种移植瘤（PDXs），在真实再现前列腺癌复杂性方面存在局限性，包括肿瘤异质性、雄激素受体（AR）依赖性信号通路以及微环境相互作用。为弥补这一不足，本研究提出了一种稳健且可重复的患者来源类器官（PDOs）建立方案，能够保留亲本肿瘤的遗传、表型和组织学特征。该方法可用于培养来自局限性和晚期前列腺癌的类器官，为研究疾病机制、药物反应及生物标志物发现提供了具有生物学相关性的模型。结果表明，该方案能够从多种临床样本中成功生成类器官，并可应用于高通量药物筛选和精准医学。通过提供一种标准化的操作流程以解决关键技术难题，本研究强调了PDOs作为推动前列腺癌研究和开发更有效治疗策略的多功能工具的重要性。

引言

前列腺癌（PCa）仍是全球男性中最常见的恶性肿瘤之一，其癌症相关死亡率仅次于肺癌。根据近期的流行病学研究，全球前列腺癌的发病率持续上升，预计每年新增病例数将从2020年的140万例增至2040年的290万例¹。尽管在早期检测以及新型疗法（包括雄激素剥夺治疗（ADT）和靶向药物）的开发方面取得了进展，但由于前列腺癌具有高度异质性，且在疾病进展过程中不可避免地产生治疗耐药性，尤其是在晚期阶段，该病仍构成重大的临床挑战²。在ADT治疗失败后出现的去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是该疾病的一种致死性形式，其特征是生存预后差且治疗选择有限³。因此，阐明驱动疾病进展和耐药的分子机制，对于发现新的治疗靶点并改善患者预后至关重要。

开发能够准确模拟人类前列腺癌复杂性的临床前模型，对于推动该领域的研究至关重要。尽管传统的二维细胞培养技术被广泛使用，但其无法重现体内所观察到的细胞异质性、肿瘤结构以及微环境in vivo⁴。因此，这些模型的转化应用价值有限，尤其是在研究肿瘤进展、药物耐药性以及癌细胞与肿瘤微环境之间动态相互作用方面⁵。相比之下，患者来源的异种移植模型（PDX）和类器官培养技术已成为更为先进的工具，能够在传统细胞系与临床肿瘤之间架起....

方案

本研究经无锡市第二人民医院医学伦理委员会审查并批准（批准文号：Y-38 (2023)）。所有参与者均签署了书面知情同意书。患者数据经过去标识化处理，以确保符合伦理标准的隐私保护。

1. 样品采集

1. 组织获取
   1. 取样前准备
      1. 纳入标准：确保所有参与者均经病理学或影像学检查确诊为前列腺癌。肿瘤样本来源于手术切除、活检或其他临床标本。确保所有参与者年龄在18岁及以上，且无其他恶性肿瘤，以排除其他癌症对前列腺癌研究的潜在干扰。从所有参与者处获取书面知情同意书，同意参与本研究并允许其样本用于科学研究。
      2. 排除标准：排除样本中肿瘤组织量不足以进行培养或分析的患者。排除在研究过程中撤回同意或无法提供所需样本的患者。
   2. 前列腺穿刺活检样本：使用专用穿刺针从前列腺组织中获取样本。立即将组织置于保存液（Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) 培养基 + ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释））中，并在冰上运输，确保在24小时内送达实验室。
      注：应精确定位前列腺癌组织，并在不同解剖区域进行多点取样。每个部位进行1-2次穿刺，每次获得≥1 cm的组织芯样本。
   3. 根治性前列腺切除术样本：采集后立即将样本放入保存液（adDMEM/F-12培养基 + ROCK抑制剂溶液....

结果

患者来源的前列腺癌类器官的形态学与动态生长特征
患者来源的前列腺癌类器官已成功从临床操作中获取的新鲜肿瘤组织建立。通常在培养后5–7天内即可观察到类器官的初始形成（图2）。在明场显微镜下，类器官表现出明显的形态学特征，形成致密、边界清晰的球状结构或类似腺体的结构。来自腺癌样本的类器官呈现出更规则、类似上皮样的组织结构，而来自更具侵袭性或低分化的肿瘤样本的类器官则常形成不规则、松散聚集的细胞团。

值得注意的是，类器官保留了原始肿瘤的结构特征， closely mimicking 组织学切片中观察到的腺体结构。类器官在培养期间表现出稳定的扩增能力，其体积和细胞密度均显著增加，表明其在体外成功适应并持续增殖。in vitro。真正的类器官需要验证其结构完整性、功能能力和遗传稳定性，通常通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）分析进行评估。相比之下，细胞聚集体缺乏空间有序结构和稳定的遗传传递。

为进一步.......

讨论

建立前列腺癌（PCa）类器官是临床前模型研究中的一项关键进展，相较于传统的二维细胞培养和PDX模型具有显著优势¹⁶。本研究提出的方法能够生成在组织学、遗传学和表型特征上高度模拟原始肿瘤的类器官。通过保留肿瘤异质性，包括雄激素受体（AR）信号通路和细胞结构，这些类器官为研究前列腺癌的进展、治疗耐药性以及个体化治疗反应提供了更具生物学相关性的平台¹⁷。该方法可从局限性和晚期前列腺癌样本中均成功培养类器官，确保其适用于不同疾病阶段，填补了当前前列腺癌研究中的一项未满足需求¹⁸。

该方案的一个关键优势在于其可重复性和可扩展性，有助于开展基因组分析、高通量药物筛选和功能研究等下游应用。与PDX模型相比，前列腺癌类器官更具成本效益，所需资源更少，且可在更短的时间内完成培养。此外，本方案包含了优化的冷冻保存和复苏步骤，能够在维持基因组和表型完整性的同时，确保类器官的长期存活能力。这一特性支持类器官生物样本库的建立，可为协作研究、回顾性分析以及群体水平的研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A 83-01	TOCRIS	2939
adMEM/F12	Gibco	12634010
生物安全柜	济南新北西生物科技有限公司
细胞回收溶液	康宁	354253
离心机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	M1416R
离心管	南京易瑞生物技术有限公司
Cultrex PathClear BM	R&研发	3533-010-02
Cultrex 减少生长因子基底膜提取物，2 型	R&研发	3533-005-02
培养容器（24孔低吸附板）	thermo	Nunc-174930-ZX
DHT	ISOREAG	521-18-6
电子天平	南京维立志博生物科技有限公司
胎牛血清	Gibco	10099141
谷氨酰胺Plus-200mM	R&研发	B90210
HEPES	R&研发	1254/10
湿润的细胞培养箱（37°C，5% CO2）	上海和田科学仪器有限公司	HY-160SY
冰盒	南京诺唯赞生物科技股份有限公司
中等大小的培养皿	苦艾素	abs7005
N21-MAX 培养基添加剂（50X）	R&研发	AR008
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165-5G
烟酰胺	R&研发	3533-010-02
Normocin	Invivogen	ant-nr-2
Pipet-aid 移液器辅助装置	南京霍普特科学仪器有限公司
移液器	南京霍普特科学仪器有限公司
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
rhEGF	R&研发	236-EG-01M
rhFGF	R&研发	233-FB-025
rhFGF-10	R&研发	345-FG-025
rhNoggin	R&研发	6057-NG-100
rhR-Spondin 1	R&研发	4656-RS-100
SB 202190	TOCRIS	1264
单细胞悬液制备装置	真实世界数据	DSC-400
组织剪/手术刀	南京易瑞生物技术有限公司
TryplE Express	Gibco	126A04013
人类肿瘤解离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-095-929
镊子	南京宜研生物科技有限公司
水浴锅	常州中捷实验仪器制造有限公司	HH-600
Y-27632 二盐酸盐	R&研发	1254/10