方法文章

利用多点硫黄素T荧光检测突变型P53 V157F乳腺癌细胞中的聚集倾向行为

DOI：

10.3791/68921

⸱

2025年12月30日

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1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

携带 p53 V157F 突变的 Hs578T 乳腺癌细胞表现出显著高于 MCF7 细胞的硫黄素 T 荧光，表明其蛋白质聚集程度更高。多点荧光测量可提高检测富含 β-折叠聚集体的准确性和可靠性，凸显了易聚集型 p53 突变在癌症研究及治疗策略开发中的重要性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由TP53基因编码的肿瘤抑制因子p53在维持基因组稳定性中发挥核心作用。TP53基因突变，特别是热点变异，在约50%的人类癌症中被发现，可能导致肿瘤抑制功能的丧失，或获得功能增益特性，包括聚集形成类朊病毒结构。

本研究评估了Hs578T乳腺癌细胞中p53 V157F突变相较于表达野生型p53的MCF7细胞的蛋白聚集倾向。采用硫磺素T（ThT）染色结合96孔板荧光定量法检测蛋白聚集情况。细胞经ThT/ Hoechst溶液染色后洗涤，并在特定激发/发射参数下使用酶标仪进行分析。通过单点和四点荧光读数的定量分析显示，Hs578T细胞的ThT荧光强度较MCF7细胞升高3.20至4.26倍，表明其富含β-折叠或类淀粉样蛋白聚集体水平显著增加。多点测量结果证实了蛋白聚集体在孔板表面广泛且一致地存在。这些结果支持采用多点读板法在基于细胞的实验中准确检测蛋白聚集现象。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TP53 基因编码肿瘤抑制蛋白 p53，在约 50% 的人类癌症中该基因发生突变1,2。此类突变不仅会消除 p53 的肿瘤抑制功能，而且在某些热点突变体中，还会促进形成类朊病毒样聚集体3,4。这些突变型 p53 的聚集形式常获得功能增益特性，包括对抗癌治疗的耐药性增强5,6。因此，确定哪些 p53 热点突变易于发生聚集，对于指导 p53 突变型癌症的有效治疗策略开发至关重要7,8。

在我们之前的研究中，我们观察到头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和乳腺癌细胞系中特定的 p53 突变表现出强烈的硫黄素T（ThT）染色信号，表明存在聚集的蛋白质。ThT 是一种苯并噻唑染料，可特异性结合富含β-折叠的淀粉样结构，结合后荧光显著增强9。例如，携带 p53 R175H 突变的 HNSCC 细胞系 Detroit 562 表现出强烈的 ThT 荧光信号10。类似地，另外两个 HNSCC 细胞系 TW01 和 HONE-1，均携带 p53 R280T 突变，也显示出明显的 ThT 染色11。在这些情况下，ThT 信号与 p53 共定位，支持存在聚集态 p53 的结论10,11。

在乳腺癌细胞中，MDA-MB-231（p53 R280K 突变）和 T47D（p53 L194F 突变）同样表现出强烈的硫黄素T（ThT）染色，并且p53与ThT存在明显的共定位12。相比之下，表达野生型p53的MCF7细胞以及MDA-MB-468细胞（p53 R273H突变）均仅显示出微弱的ThT信号12。类似地，携带p53 V173L突变的OECM-1头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞也表现出较低水平的ThT染色10。

与其他蛋白质聚集检测方法（如滤膜滞留实验、透射电子显微镜（TEM）或使用聚集物特异性抗体的免疫染色）相比，ThT荧光分析具有多项优势。该方法无损、快速，适用于活细胞和固定细胞，且无需复杂的前处理步骤。尽管滤膜滞留实验能够有效捕获不溶性聚集物，但其需要强烈的变性条件，因而不适用于活细胞检测。13透射电镜可直接观察纤维的形态，但操作繁琐且通量较低14. 特异性聚集物免疫染色可实现 原位 使用构象依赖性抗体进行检测，尽管抗体的可获得性和特异性可能受限15相比之下，硫磺素T（ThT）荧光检测——尤其是结合多点平板读数时——为检测富含β-折叠或类淀粉样结构提供了一种简单、定量且空间重复性良好的方法。

实际操作中的考虑因素对于可重复性也至关重要。ThT 荧光信号在较宽的浓度范围（0.2–500 µM）内与淀粉样蛋白浓度呈线性相关，通常在 20–50 µM 时达到峰值信号，具体数值取决于蛋白质种类；然而，当 ThT 浓度 ≥5 µM 时可能出现自身荧光，更高浓度还可能影响聚集动力学16。因此，通常建议采用约 10–20 µM 的工作浓度，以在保证检测灵敏度的同时尽量减少对聚集过程的潜在干扰16。在本实验方案中，1,000 倍浓缩的 ThT 储存液（12. mM）按 1:1,000 比例稀释，得到约 12. µM 的工作浓度，处于推荐范围内。

ThT 优先结合富含β-折叠的淀粉样结构，这种结构是淀粉样纤维的特征。这种特异性源于染料与淀粉样纤维的交叉β-折叠结构之间的相互作用，其中由β-链段形成的表面为 ThT 提供了结合位点。因此，ThT 可能无法有效检测其他不具有这种富含β-折叠结构的错误折叠蛋白聚集体或非淀粉样聚集体17。因此，尽管 ThT 是鉴定淀粉样纤维的一种有价值工具，但仍建议采用互补的验证方法——例如与 p53 免疫荧光共定位或生物物理方法——以确认所检测到的聚集体的身份和特异性10,18。

结构预测研究表明，p53 V157F突变体相较于野生型蛋白更倾向于形成易于聚集的构象19。在本研究中，我们比较了携带易聚集型p53 V157F突变的Hs578T乳腺癌细胞与表达野生型p53的MCF7乳腺癌细胞之间的硫黄素T（ThT）荧光信号。通过基于多点酶标仪的ThT染色检测方法，我们旨在评估p53 V157F相对于野生型p53的聚集倾向性。

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方案

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1. 细胞接种

  1. 为评估细胞活力，取10 µL台盼蓝与10 µL用1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬的细胞混合于微量离心管中，充分混匀。
  2. 取10 µL上述混合液加入计数载片，使用自动细胞计数仪计数活细胞。
  3. 根据细胞活力计数结果，将30,000个活细胞接种至96孔培养板的每孔中，其中一孔设为未染色对照，其余三孔用于染色。

2. 孵育

  1. 将培养皿放入 CO2 培养箱中，在 37 °C 条件下孵育 12 小时。

3. 新鲜硫黄素T染色原液（1,000倍）的配制

  1. 称取 0.02 g（20 mg）ThT 粉末，溶于 5.0 mL 去离子水中，充分混匀直至粉末完全溶解。
    注意：此配制方法可得到浓度为 4 mg/mL 的 1,000 倍 ThT 储存液，相当于 12.5 mM（ThT 的分子量约为 318.85 g/mol。4 mg/mL 的溶液等于 4 g/L，将 4 g/L 除以 318.85 g/mol 可得 0.0125 mol/L，即约 12.5 mM）。

4. 使用核复染剂制备硫黄素T染色缓冲液

  1. 配制染色液：将以下试剂加入 1 mL 的 1x DPBS 中，轻轻混匀以确保溶液均匀。
    1. 加入 1 µL 新鲜配制的 1,000 倍 ThT 储存液，终浓度为 12.5 µM（1x）。
    2. 加入 1 µL 浓度为 1 mg/mL 的 Hoechst 33342 储存液，终浓度约为 1 µg/mL（=1.6 µM）。

5. 染色

  1. 移除每个孔中的培养基。向每个染色孔中加入 100 µL 配制好的 ThT/Hoechst 染色缓冲液。向未染色对照孔中加入 100 µL 1× DPBS。

6. 孵育

  1. 将培养皿置于室温（25 °C）避光处，静置 30 分钟。

7. 清洗

  1. 小心吸出或弃去每孔中的染色液，注意不要扰动细胞单层。
  2. 向每孔中加入 100 µL 的 1× DPBS，并可选择性地轻轻浸泡 30 秒。
  3. 小心吸出或弃去 DPBS 洗涤液。
  4. 通过向每孔中加入 100 µL 新鲜的 1× DPBS 重复洗涤一次，同样可选择性地轻轻浸泡 30 秒，然后弃去 DPBS 洗涤液。
  5. 第二次洗涤后，向每孔中加入 100 µL 新鲜的 1× DPBS。

8. 荧光检测

  1. 在读取荧光信号之前，取下96孔板的盖子。采用以下两种方法之一测量荧光：单点读数或四点读数。
  2. 将96孔板放入微孔板读数仪中，并使用以下参数测量荧光：ThT荧光：激发波长450 nm，发射波长490 nm；Hoechst 33342荧光：激发波长360 nm，发射波长460 nm；读数仪设置：读取前震荡5秒；读数方式：顶部读数；积分时间：140 ms；读数高度：1.00 mm；每孔读数点数：1（终点法）或4（孔扫描）；孔扫描设置：（密度设置：2；点间距：2.5）。

9. 数据分析

  1. 按如下方法计算蛋白质聚集：
    聚集信号公式，ThT 和 Hoechst 吸光度，用于淀粉样蛋白聚集分析的方程。
  2. 通过将 MCF7 细胞中的 ThT 荧光强度比值设为 1（基线对照）进行归一化处理。

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结果

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为研究乳腺癌细胞中富含β折叠的蛋白质聚集体的存在情况，对MCF7和Hs578T细胞系进行了硫黄素T（ThT）染色，随后进行荧光定量分析。如图1所示，将细胞接种于96孔板的四个孔中，其中一个孔设为未染色对照。其余三个孔按照标准方案用ThT染色。荧光信号通过两种方法测定：（1）从每个孔的中心位置进行单点读数；（2）通过获取每个孔内四个不同位置的信号并取平均值进行四点读数，以校正空间差异性。定量分析显示，两种细胞系之间的ThT荧光存在显著差异（图2）。采用单点读数法时，Hs578T细胞的ThT荧光强度较MCF7细胞升高了3.20 ± 0.05倍（补充表S1）。在后续的四点读数中，从信号值中减去了未染色孔的平均背景荧光（补充表S2）。进一步分析Hs578T细胞中ThT荧光的空间分布，结果显示在全部四个测量点均呈现一致升高（图3）。具体而言，在第1、2、3和4点，Hs578T细胞的ThT荧光强度分别比M...

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讨论

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将细胞接种到96孔板时，通常难以实现细胞在孔底表面的均匀分布，因为通过轻柔振荡或轻敲培养板以分散细胞的方法并不总是可行。这种分布不均会导致同一孔内不同区域的信号强度出现显著差异。多点荧光读数结果显示，同一孔内的不同区域之间存在明显的信号变异，凸显了这种偏差的存在，以及仅测量单一点位可能带来的误导性结果。因此，依赖单一中心读数点可能会低估信号的异质性，掩盖不同细胞系或处理条件之间ThT荧光的细微差异。此类偏差可能导致标准差（SD）估计值偏低，从而产生精确度较高的假象。为了获得更可靠且客观的数据，我们强烈建议在ThT荧光检测中采用多点读数方法。该方法通过对孔内多个位点的信号进行平均，更真实地反映数据的内在变异性，并提高检测蛋白质聚集程度微小变化的敏感性，包括药物处理所诱导的变化。在评估弱聚集倾向或评价抑制聚集化合物的效力时，多点分析尤其有用。

关于荧光归一化，我们目前采用的多点ThT荧光方法是基于点水平的测量值进行信号归一化，而非基于整个孔的总荧光强度。选择基于点的归一化方法是因为它能够减少由细胞贴壁不均、边缘效应以及局部聚集热点所引入的偏差，而这些因素在仅依赖孔平均值时可能被掩盖。然...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者衷心感谢义守大学医学院基础医学核心实验室提供的技术协助。本研究得到了义大医院 [EDAHJ114001，授予 C.-C.C.] 和中国台湾国家科学与技术委员会 [NSTC 112-2813-C-214-032-B，授予 B.-H. C] 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔培养板SimplyPC396-0100
计数载玻片InvitrogenC10228
Countess II FL 全自动细胞计数仪Thermo Fisher Scientific AMQAF1000
dPBSSimplyCC704-0500
Ep管SimplyPC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Molecular Devices735-0391 
硫黄素TSigma-AldrichT3516
台盼蓝InvitrogenT10282

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

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P53 T TP53 Hs578T

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