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基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

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DOI：

10.3791/68932

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2025年12月30日

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

本文内容

摘要

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema hermaphroditum）中利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑的技术，该线虫是一种昆虫病原性（EPN：寄生昆虫的）线虫，正逐渐成为一种新兴的遗传学研究模型。该技术可用于构建突变体，有助于阐明与线虫生物学中互利共生和寄生性共生相关的基因功能。

摘要

斯氏线虫属（Steinernema）和异小杆线虫属（Heterorhabditis）的昆虫病原线虫分别与共生细菌致病杆菌属（Xenorhabdus）和发光杆菌属（Photorhabdus）维持互惠共生关系。这些线虫-细菌组合可侵染并杀死主要来自鳞翅目（Lepidoptera）和鞘翅目（Coleoptera）的昆虫幼虫，构成一个易于研究的三界互作体系，可用于解析互惠共生与寄生关系的分子基础。充分开发利用该模型的关键一步是在昆虫病原线虫中建立稳定且可跨代遗传的遗传 工具。本文中，我们展示了在新兴模式生物——雌雄同体斯氏线虫（Steinernema hermaphroditum）中建立的一种可靠的CRISPR–Cas9基因组编辑平台。该物种易于在体内（in vivo）和体外（in vitro）培养，并且对性腺显微注射具有高度可操作性。尤为重要的是，其雌雄同体的繁殖方式极大地简化了纯合突变系的建立与维持。我们提供了一套详细的实验方案，通过显微注射递送Cas9核糖核蛋白复合物，实现高效、靶向的基因敲除。作为概念验证，我们对保守的肌肉相关基因unc-22进行了修饰，获得了特征性的抽搐表型，证实了该系统中靶向诱变的有效性。该CRISPR–Cas9平台为在S. hermaphroditum中开展稳定的遗传操作（例如外源基因表达）打开了大门，并为拓展至其他具有农业与生态重要性的昆虫病原线虫物种提供了可借鉴的技术框架。

引言

昆虫病原线虫（EPNs）是一类能够杀死昆虫的寄生性线虫，其与细菌共生体形成物种特异性的互利共生关系1。EPNs 包含两个科：斯氏线虫科（Steinermatidae）和异小杆线虫科（Heterorhabditidae），分别与革兰氏阴性菌Photorhabdus 属和Xenorhabdus 属共生2,3。在斯氏线虫属（Steinernema）线虫的自由生活感染期幼虫阶段（IJ），Xenorhabdus 细菌被储存在线虫肠道内的一个称为“ receptacle”（ receptacle，贮菌器）的特化结构中；当线虫侵入昆虫血腔后，细菌被释放出来，随后大量增殖，并通过败血症杀死昆虫宿主3,4。在这种互利共生关系中，细菌产生抗菌和杀虫化合物，以抵御昆虫宿主的免疫反应，并为线虫提供营养支持5。作为回报，细菌则得益于线虫宿主提供的保护，避免受到环境中其他微生物的侵害，并借助线虫实现向新的昆虫猎物的传播6,7。

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方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 显微注射前的线虫准备

  1. 制备接种细菌的线虫生长培养基（NGM）平板 Xenorhabdus griffiniae 和 Comamonas aquaticus.
    注意：培养 S. hermaphroditum 线虫与其天然共生细菌 Xenorhabdus griffiniae 显微注射前培养线虫以促进其生长，并在细菌上回收注射后的线虫 Comamonas aquaticus 提高注射后的存活率14.
    1. 划线接种细菌 X. griffiniae 在LB-丙酮酸琼脂平板（2.5 g酵母提取物，5 g胰蛋白胨，2.5 g氯化钠，0.5 g丙酮酸钠，7.5 g琼脂溶于500 mL水中）上培养，并于30 °C过夜孵育。
    2. 划线接种细菌 C. aquaticus 在LB琼脂平板上培养，并于37 °C过夜孵育。
    3. 挑取单个细菌菌落 接种于避光的LB液体培养基（每升水中含5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨、5 g氯化钠）中，于有氧条件下培养细菌过夜（最长时间16小时）。 ....

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结果

设计了两种CRISPR RNA（以Pam位点编号命名——Pam 3和Pam 5），靶向S. hermaphroditum中unc-22的同源基因，其Pam位点信息来自已发表的研究14（图2A）。每种crRNA与tracrRNA结合形成单导向RNA（sgRNA），并按步骤3.1所述整合入Cas9蛋白，形成核糖核蛋白复合物。本方案中设计了两种靶向同一基因的crRNA；然而，若采用先前为C. elegans开发的共CRISPR（co-CRISPR）方法31，可将crRNA #2替换为针对目标基因的crRNA。或者，也可将unc-22 crRNA添加至两个靶向目标基因的crRNA中，但需确保总crRNA与tracrRNA的比例保持1:1。

显微注射前一天，挑选摄食良好、具有可见性腺臂的早期J3期线虫（图1A.......

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讨论

非常规的遗传模式动物系统为在这些性状自然发生的生态和生理背景下研究真核生物基因功能提供了宝贵的机会，例如在寄生宿主存在的情况下或生物体自身的原生微生物组环境中。在昆虫病原线虫（EPNs）中，基因操作主要依赖于某些基于RNA干扰（RNAi）的方法13,32。尽管RNAi可在某些物种中实现功能性的 遗传学研究，但其应用受限于双链RNA（dsRNA）的瞬时性，且基因沉默可能无法稳定遗传。这些局限性凸显了对稳定、可跨代遗传的遗传工具的需求33,34。本研究描述了首个针对斯氏线虫科（Steinernematids）的精确基因组编辑方案，斯氏线虫科是小杆目（Rhabditida）中两个EPN科之一，相关方法已在Cao（2023）14中得到验证。

成功的CRISPR-Cas9诱变依赖于对线虫的.......

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Margaret McFall-Ngai 和 Edward Ruby 提供共聚焦显微镜的使用机会。感谢 Alexis (Cody) Hargadon 和 Grischa Chen 在共聚焦显微镜操作方面的培训，以及 Carly R. Myers 在图像获取和抽搐视频分析方面的帮助。我们还感谢 Stephanie Hampton 为购买显微注射系统的经费分配。本研究工作得到了卡内基科学研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖（80-100 目）Fisher ScientificBP26411也用于LB丙酮酸平板
琼脂糖Fisher Scientific16500500也用于基因分型
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3IDT1081058
硼硅酸盐针头世界精密仪器公司1B120F-4
氯化钙（CaCl₂）Sigma AldrichC4901
胆固醇 VWR4335 mg/mL，溶于乙醇
Comamonas aquatica (DA1877)
琼脂糖垫用盖玻片脑科学研究实验室#4860-1D48 × 60 mm，1号厚度
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich4723010.5 M
DNA纯化与浓缩试剂盒-5 Zymo ResearchD4014
FemtoJet 4x 微注射仪，配备 Grip 头部组件，4 号尺寸 0 针 holderEppendorf/Calibre5253000017
甘蓝夜蛾第五龄幼虫GrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
凝胶成像系统Azure400AZI400-01
上样缓冲液赛默飞世尔科技B72
明胶（2%）Sigma AldrichG1393
GelRedBiotium#41003
基因分型引物：DNA寡核苷酸，25 nmolIDTN/A
Gibco Bacto 胰蛋白胨Fisher ScientificDF0118-17-0
Gibco Bacto 胰蛋白胨Fisher ScientificDF0123-17-3也用于暗LB、LB丙酮酸盐平板 
Gibco Bacto 酵母提取物Fisher ScientificDF0127-17-9也用于暗LB、LB丙酮酸盐平板 
4号持针钳 Grip Head 套装校准EPE-5196083008（与硼硅酸盐针头 1B120F-4 配对使用）
卤代烃油 700Sigma AldrichH8898
用于日常维护的硬质铂金丝线虫挑取工具Tritech ResearchPT-9901
CRISPR编辑推断（ICE）SynthegoN/A用于分析Sanger测序结果以鉴定插入缺失突变的软件
KClSigma AldrichP9541
激光拉针仪 P-2000SutterP-2000G
氯化镁（MgCl2）Sigma AldrichM8266
硫酸镁（MgSO4）Sigma AldrichM7506用于M9缓冲液，也用于NGM
Microloader尖端 2x96ST校准器930001007
蔡司 Axio Observer 和 Axiovert 200 显微镜用显微操作仪安装适配器Tritech ResearchNZ-19-2
显微镜TritechSMT1
尼古丁Sigma AldrichN3876
NP-40赛默飞世尔科技85124
无核酸酶双链缓冲液IDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
移液器储存盒Sutter InstrumentsBX10
氯化钾（KCl）Sigma Aldrich793590
磷酸氢二钾（K2HPO4）Sigma AldrichP3786KOH用于NGM
磷酸二氢钾（KH2PO4）Sigma AldrichP5655用于M9缓冲液，也用于NGM
蛋白酶KSigma AldrichP6556
石英针Sutter InstrumentsQF100-70-10
S. hermaphroditium 基因组NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNAIDTN/A
氯化钠（NaCl）VWRSS0430也用于M9、暗LB、LB丙酮酸盐平板
磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）Sigma AldrichS9390M9 缓冲液
丙酮酸钠Sigma AldrichP2256也用于LB丙酮酸平板 
用于显微注射的软质铂金丝挑虫针Surepure Chemetals6824铂90%，铱10%合金丝，直径0.002英寸，长5英尺
标准持针器Tritech ResearchHI-7
斯氏线虫属 Hermaphroditum 种
体视显微镜LeicaInveta 3
海藻糖Cole-ParmerEW-88195-990.08 M
Tris Fisher ScientificAM9855GpH 8.0
Tween 20Sigma AldrichP1379
垂直显微操作器安装适配器Tritech ResearchNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

参考文献

  1. Stock, S., Blair, H. G. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  2. Murfin, K. E., et al. Nematode-bacterium symbio....

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