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研究文章

Klotho在缺氧-复氧所致心肌细胞损伤中的保护作用 通过 NF-κB 信号级联的调控

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DOI：

10.3791/68946

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2025年12月5日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

本文内容

摘要

本方案通过分子和功能检测方法，评估在缺氧-复氧条件下klotho过表达对H9C2心肌细胞的保护作用。

摘要

本研究旨在探讨klotho在缺氧/复氧（H/R）损伤的心肌细胞中的保护作用。 体外 采用H9C2大鼠心肌母细胞建立缺氧/复氧（H/R）模型，并用过表达klotho的慢病毒载体转染细胞。细胞分为六组实验组：对照组、H/R组、阴性对照组（NC）、klotho过表达组、PDTC组（NF-κB抑制剂）以及klotho与脂多糖（LPS）联合处理组。采用定量实时PCR和蛋白质印迹法检测klotho的表达水平。细胞活力通过相应方法测定 通过 通过MTT法检测细胞活力，同时采用流式细胞术评估细胞凋亡。NF-κB信号通路相关蛋白的表达通过Western blotting进行分析，细胞内促炎性细胞因子的表达则通过免疫荧光染色进行检测。Klotho过表达显著提高了H9C2细胞中klotho的水平，并与H/R组相比，明显改善了细胞活力，减少了细胞凋亡，降低了促炎性细胞因子的表达。Western blot分析显示，klotho过表达以及PDTC处理均抑制了NF-κB通路的激活，表现为p-P65/P65比值降低和p-IκBα/IκBα水平升高。这些效应在联合LPS处理后部分被逆转。结果表明，klotho通过调控NF-κB信号通路、减轻炎症反应并促进细胞存活，从而对H/R诱导的心肌损伤发挥心肌保护作用。本实验方案为研究心肌缺血-再灌注损伤的分子机制以及klotho在心脏炎症中的治疗潜力提供了可重复的方法。

引言

急性心肌梗死（AMI）主要由缺血后复灌注引起，这促使人们广泛研究心肌缺氧/复氧（H/R）损伤的机制1,2,3。心肌H/R损伤的一个关键方面是细胞凋亡，其在AMI的病理进展中起着重要作用4,5。

近期研究发现，核因子κB（NF-κB）信号通路通过调控对脂多糖（LPS）等刺激物的炎症反应，在心肌缺氧/复氧（H/R）损伤中发挥重要作用。6,7,8NF-κB 的激活发生 通过 两种不同的机制：经典途径和非经典途径9在经典通路中，激活依赖于抑制性κBα蛋白（IκBα）的磷酸化诱导降解10然而，也有报道称，NF-κB 亚基 p65 的磷酸化可诱导细胞凋亡，这一过程可能独立于 IκBα 的降解。11Klotho 是一种单次跨膜蛋白，可调节磷酸盐和钙代谢，并抑制胰岛素信号传导12,13,14越来越多的证据表明，Klotho 在包括肾脏、海马体和衰老细胞在内的多种组织中对 NF-κB 的活化具有抑制作用，从而减轻炎症反应和组织损伤。15,16,17尽管取得了这些进展，Klotho 在急性心肌梗死（AMI）中的作用及其在心肌缺氧/复氧（H/R）损伤期间与 NF-κB 通路的潜在相互作用仍 largely 未被充分探索。

从方法学的角度来看， 体外 使用H9C2大鼠心肌母细胞构建的缺氧/复氧模型相较于动物模型具有多项优势，包括可精确控制氧张力、可重复性高以及实验变异性小。此外，通过慢病毒介导的Klotho基因过表达可实现基因表达的稳定且高效的调控，从而直接探究其功能影响。这些方法使本实验方案在机制研究中具有实用性、成本效益和可及性，同时避免了动物实验相关的伦理和操作难题 体内 实验。

从实际应用的角度来看，H9C2细胞在心血管研究中被广泛使用，因为它们保留了许多类似心肌细胞的特性，尽管并不能完全模拟成熟心肌细胞的表型。所选用的缺氧/复氧条件（5小时缺氧后接1小时复氧）属于常用于模拟缺血-再灌注损伤的实验范围 体外同样，使用感染复数（MOI）约为100的慢病毒转导是实现高效过表达并控制细胞毒性的常规方法。尽管这些特点提高了该方案的适用性，但仍存在一些局限性，例如对目标生物学过程的模拟不够完全 体内 因此，本研究旨在探讨Klotho如何保护心肌细胞免受H/R损伤，并建立可重复的实验方案以评估其与NF-κB信号通路的相互作用。

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方案

所有涉及H9C2大鼠心肌母细胞系（ATCC，CRL-1446）的操作均遵循机构生物安全规定进行。本研究未直接涉及动物或人类受试者。图1展示了实验设计与分析流程的示意图。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 细胞培养

H9C2 大鼠心肌母细胞系（ATCC，CRL-1446）使用冷冻保存液在液氮中冻存，冷冻液成分为添加了10%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，4.5 g/L）。复苏时，将冻存管在37 °C水浴中快速解冻2-3分钟，立即转移至预热的DMEM培养基中。培养液配方为：10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、3.7 g/L 碳酸氢钠和1 mM 丙酮酸钠。细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。所有实验均使用传代次数在6至20代之间的H9C2细胞。早期传代（<P6）和晚期传代（>P20）的细胞均不使用，以避免传代相关的表型漂移。

2. 在 H9C2 细胞中通过慢病毒过表达 Klotho

采用第三代自失活慢病毒载体，在EF1α启动子控制下编码全长大鼠Klotho（Kl）基因，用于在H9C2细胞中建立稳定过表达。该载体包含P2A-EGFP报告基因用于可视化，以及木鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）和中心多聚嘌呤序列（cPPT）以增强转录本稳定性，并含有由PGK启动子驱动的嘌呤霉素抗性表达盒用于筛选。慢病毒颗粒通过在HEK293T细胞中共转染转移质粒与psPAX2（gag/pol/rev）和pMD2.G（VSV-G）质粒（比例为4:3:1）产生，转染使用聚乙烯亚胺（PEI；DNA:PEI = 1:3，w/w）。分别在转染后48 h和72 h收集上清液，经3,000 × g离心10 min澄清，通过0.45 µm PES膜过滤，并在4 °C下以25,000 × g超速离心2 h浓缩。病毒沉淀用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS重悬，通过有限稀释法感染HEK293T细胞并在72 h检测EGFP信号，测定功能滴度（TU/mL）。将H9C2细胞以每孔2 × 105个细胞接种于6孔板中，转导时细胞融合度约为60%。在1 mL新鲜培养基中加入慢病毒颗粒（感染复数MOI为100）及polybrene（8 µg/mL）以提高感染效率。12 h后移除接种液，更换为2 mL完全培养基。感染后72 h，在荧光显微镜下观察EGFP荧光以验证转导效率。为建立稳定细胞系，自感染后48 h开始使用预滴定浓度的嘌呤霉素（2 µg/mL）筛选3–5天，每48 h更换一次培养基。通过RT-qPCR和免疫印迹法确认Klotho的过表达。所有慢病毒操作均在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，所有病毒废弃物在丢弃前均需用10%漂白剂处理至少30 min以灭活。

3. 实验组

将H9C2细胞以每孔3 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板（生长面积为9.6 cm²）中，24小时后细胞融合度达到约70%–80%，符合缺氧/复氧（H/R）处理及后续实验的要求。细胞过夜贴壁后，分为六个实验组：（1）对照组，不进行任何额外处理；（2）H/R组，在密闭的模块化缺氧培养箱中进行缺氧/复氧（H/R）处理，先暴露于缺氧环境（1% O₂、94% N₂、5% CO₂）5小时，随后复氧（5% CO₂）1小时，具体操作如前所述18；（3）阴性对照（NC）组，在H/R处理前24小时转染空载体；（4）Klotho组，在H/R处理前24小时转染编码Klotho的慢病毒载体；（5）吡咯烷二硫代氨基甲酸处理组（PDTC），在H/R处理前使用200 mg/L的NF-κB通路抑制剂PDTC处理24小时19；（6）Klotho + LPS组，在H/R处理前24小时先转染编码Klotho的慢病毒载体，随后用1 mg/L脂多糖（LPS）处理24小时20。

4. qRT-PCR

将H9C2细胞以每孔1 × 10⁶个细胞的密度接种于6孔板中。处理后，采用苯酚-氯仿提取法提取总RNA。简要步骤如下：每孔加入1 mL裂解试剂，随后进行氯仿抽提、异丙醇沉淀，并用75%乙醇洗涤。RNA沉淀经空气干燥后溶解于无RNase的水中。通过分光光度法测定RNA浓度和纯度。对于cDNA合成，取1 µg总RNA，按照制造商说明书，使用商业逆转录试剂盒进行逆转录反应，包括基因组DNA去除和随机六聚体引物启动。采用SYBR Green染料法在实时荧光定量PCR系统上进行定量实时PCR扩增，反应条件如下：95 °C预变性30 s，随后进行40个循环（95 °C变性5 s，60 °C退火延伸30 s）。引物序列使用Primer-BLAST（NCBI）设计，并由商业公司合成：（1）Klotho：F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′，R 5′-GGGCGTTCACACTTATTTAT-3′；（2）β-actin（内参对照）：F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。相对表达水平采用2^-ΔΔCT法计算，扩增特异性通过单一熔解曲线峰确认。

5. 蛋白质印迹

使用含有蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（每6孔板孔200 µL），在冰上提取H9C2细胞中的蛋白质。采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度，并将等量蛋白（每泳道20–30 µg）上样至10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。通过湿转系统在4 °C、100 V条件下电转90分钟，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1小时，随后在4 °C与以下一抗孵育过夜：Klotho（1:500）、磷酸化-p65（1:500）、p65（1:500）、磷酸化-IκBα（1:500）、IκBα（1:500）和β-actin（1:1000）。用TBST洗涤三次后，膜在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:1000）孵育1小时。使用增强型化学发光检测系统显影蛋白条带，并采用ImageJ软件在相同阈值设置下对信号强度进行定量分析。

6. MTT 检测

将H9C2细胞以每孔100 µL完全培养基中2 × 10³个细胞的密度接种于96孔板中，过夜培养以使细胞贴壁。每孔加入10 µL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS），在37 °C、5% CO₂的湿化条件下孵育4小时。孵育结束后，小心吸除上清液，每孔加入100 µL二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲臜结晶，随后在室温下轻轻振荡孵育10分钟。使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。预期的视觉结果为：加入DMSO前，活细胞中可见紫色甲臜结晶；溶解后形成均一的紫色溶液。

7. 流式细胞术

处理后24小时，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并在4 °C下以1,500 × g 离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于100 µL 1×结合缓冲液（10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl₂，pH 7.4）中。Annexin V-APC与碘化丙啶（PI）按1:2比例混合，制备15 µL染色液，加入细胞悬液中。混合物在室温避光孵育10分钟。孵育结束后，加入400 µL相同结合缓冲液，立即使用流式细胞仪进行分析。每样本采集总计10,000个事件。使用FlowJo软件进行数据分析。首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门以排除碎片，随后通过Annexin V与PI的象限设门区分活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）以及晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V+/PI+）。Annexin V阳性/PI阴性染色提示早期凋亡，而Annexin V/PI双阳性染色提示晚期凋亡或坏死。

8. 免疫荧光

将H9C2细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中的无菌玻璃盖玻片上，并进行相应处理。细胞在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，用含0.1% Triton X-100的PBS溶液透化处理10分钟，再用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液在室温下封闭30分钟。盖玻片在4 °C下与针对TNF-α（1:200）、IL-1β（1:200）和IL-6（1:100）的一抗溶液孵育过夜。用PBS洗涤三次后，细胞在避光条件下于室温与PE标记的二抗（1:500）孵育1小时。用DAPI复染细胞核5分钟。将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上，使用荧光显微镜观察荧光信号。采用ImageJ软件（版本1.54）进行图像分析。红色荧光表示细胞因子表达，蓝色荧光标记细胞核。

9. 统计分析

所有数据均使用 SPSS 软件进行分析。结果以至少三次独立实验的均值 ± 标准差（SD）表示。对于多组比较，采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。当 P 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

Klotho 过表达可改善细胞存活并减轻 NF-κB 介导的炎症损伤

为验证基因转导效率，检测了 Klotho 在 mRNA 和蛋白水平的表达。与缺氧/复氧（H/R）组和阴性对照组相比，Klotho 过表达细胞中 Klotho 表达显著升高（p < 0.05；图 2A、B）。在功能上，Klotho 过表达显著提高了细胞在 H/R 损伤后的存活率（p < 0.05；图 2C），并显著减少细胞凋亡，流式细胞术结果证实了这一点（p < 0.01；图 2D）。此外，免疫荧光染色显示，H/R 显著诱导了 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表达，而与 H/R 组和阴性对照组相比，Klotho 过表达显著抑制了这些细胞因子的表达（p < 0.01；图 3）。

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讨论

本研究探讨了Klotho在暴露于缺氧/复氧（H/R）损伤的心肌细胞中的保护作用，发现Klotho过表达可显著提高细胞活力，减少细胞凋亡，并抑制促炎性细胞因子的表达。这些效应伴随p65磷酸化水平降低和IκBα磷酸化增强，提示NF-κB信号通路的抑制参与了该保护表型的形成。使用PDTC对NF-κB进行药理学抑制所产生的效应与Klotho过表达相似，而脂多糖（LPS）刺激则部分逆转了Klotho的保护作用，进一步支持Klotho与NF-κB调控之间存在机制性关联。这些发现与其他组织中的既往报道21,22,23,24,25一致，并拓展了Klotho在心肌保护中的潜在作用。

多个方法学因素对于获得可重复的结果至关重要。慢病毒转导的效率高度依赖于感染复数以及培养基更换的时...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛BiosharpXG1050
Annexin V APC/PI 染色液ElabscienceE-CK-A217
cDNA 合成试剂盒Qiagen205410
DAPI 溶液BioFroxx1155MG010
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）HyCloneSH30243.01B
ECL 检测试剂盒MeilunbioMA0186-1
电泳电源（POWER PAC 200）Bio-RadPOWER PAC 200
胎牛血清（FBS）VivaCellC04001-500, C04002-500
流式细胞仪（Gallios）Beckman CoulterGallios
荧光显微镜（BK6000）重庆奥特BK6000
甲臜溶剂SolarbioM1020
HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体BethylA120-101P
LPS（NF-κB 通路激动剂）Sigma-AldrichL2630
酶标仪（型号 K3）ThermoK3
模块化孵育舱（缺氧舱）Billups-RothenbergMIC-101
MTT 溶液Cayman21795
PDTC（NF-κB 通路抑制剂）Sigma-AldrichP8765
PE 标记山羊抗兔 IgG 抗体Biossbs-0295G-PE
聚凝胺（Hexadimethrine Bromide）InvitrogenX2351
PVDF 膜MerckISEQ00010
兔抗大鼠 IL-1β 抗体Biorbytorb378927
兔抗大鼠 IL-6 抗体ZEN BIO384702
兔抗大鼠 IκBα 抗体Biorbytorb223182
兔抗大鼠 Klotho 抗体Biorbytorb333711
兔抗大鼠 p65 抗体Biorbytorb229138
兔抗大鼠 磷酸化-IκBα 抗体Biorbytorb223035
兔抗大鼠 磷酸化-NF-κB p65 抗体Biorbytorb304662
兔抗大鼠 TNF-α 抗体Biorbytorb106548
兔抗大鼠 β-actin 抗体HuabioET1702
实时定量 PCR 系统（LightCycler 96）RocheLight Cycler96
RIPA 裂解缓冲液MredaMO52447
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒ElabscienceE-IR-R305
TRIzol 试剂盒Life Technologies15596-018

参考文献

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