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使用 Cell-ACDC 分析多维显微镜数据

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DOI：

10.3791/68954

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2025年11月7日

 ,  ,  , 
1Institute of Functional Epigenetics, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, 2Institute of Network Biology, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, 3Institute of AI for Health, Computational Health Center, Helmholtz Zentrum München

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

对多维显微图像数据的准确分析需要复杂的流程。本文演示了如何使用软件 Cell-ACDC。该软件采用先进的由人工智能驱动的模型，用于显微图像数据的分割、追踪、细胞谱系分析和定量。尤为重要的是，它结合了一种创新的框架，可对模型输出结果进行半自动校正。

摘要

生命科学领域定量显微镜技术的最新进展，使实验生物学家能够以前所未有的分辨率和速度对细胞进行探测。与此同时，人工智能的革命显著提升了从多维显微镜数据中可提取的信息量。然而，生成的数据量巨大，且最先进的AI模型结构复杂，这在图像分析阶段造成了严重瓶颈。Cell-ACDC 是一款开源、用户友好的软件，为多维显微镜数据中单细胞的分割、追踪和定量分析提供了强大的端到端解决方案。该软件专为可能缺乏实施此类模型所需高级技术专长的实验生物学家设计。本文展示了如何利用该框架，轻松应用最新的模型，并结合多种智能及半自动化数据校正工具，以最大化可获取的生物学信息。Cell-ACDC 支持多通道、延时和 z 轴层析显微镜数据，并为每种数据维度类型提供专门的工具集。由于其模块化设计，新模型可无缝集成并由生物学家直接调用，因此 Cell-ACDC 有望成为显微镜数据分析的参考工具。

引言

显微成像技术已成为推动生命科学研究与开发各个阶段生物发现的基础工具，从基础科学研究1,2,3到药物研发与测试4,5，其应用范围广泛，涵盖从细胞培养到组织6,7、类器官8,9乃至完整生物体10等多种尺度。然而，这些先进的显微成像技术存在两个主要缺陷。首先，显微成像数据本身体量庞大11，尤其是在获取多维数据（例如时间序列和三维体积）时尤为显著。其次，准确提取数据中蕴含的丰富生物学信息，需要依赖先进的图像分析框架，而这些框架通常基于人工智能模型。这一任务对实验生物学家而言可能极具挑战性。因此，数据处理、分析等环节往往会显著拖慢科研进程，并限制新发现的潜力。理想情况下，生物图像分析软件框架应能在分析的每个步骤中为用户提供支持，从原始显微图像文件的读取，到分割与追踪，再到下游生物学信息的提取分析。然而在实际中，尽管生物图像分析新软件的快速发展是积极现象，但也带来了一个副作用：形成了大量仅针对特定分析步骤的工具，且许多工具要求用户具备高级编程技能。这使得用户不得不面对构建完整分析流程的难题，常常导致次优的分析流程——数据在不同工具间需多次保存、处理和格式转换以实现兼容。此外，生物图像分析领域并未统一采用单一编程语言，许多工具以 ImageJ12 或 QuPath13 插件（Java）的形式开发，或作为 Napari 插件（Python）14，或直接为 Python 脚本。在某些情况下，这种复杂的环境促使科研人员选择手动分析，而这种方式不仅效率低下，还引入人为偏差，阻碍研究的可重复性。

为解决这一问题，开发了 Cell-ACDC（Cell-Analysis of the Cell Division Cycle）15，这是一套基于 Python 编写的开源图形用户界面（GUI）软件工具集，用于分析多维显微镜数据。关键的是，Cell-ACDC 提供了大量预实现且按需自动安装的前沿模型，涵盖分割（如 Cellpose、StarDist、Segment Anything、YeaZ、YeastMate 等16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28）和追踪（如 Trackastra、Trackpy、Bayesian Tracker、Cell-ACDC 等19,29,30,31,32,33,34）任务。这些模型还配备了一套用于可视化标注数据及计算机辅助手动校正的框架。此外，在同一框架内，Cell-ACDC 为图像分析流程的每个步骤提供了独立模块，可自动完成数据处理、分析与保存（图 1）。更具体而言，该工具使用户能够执行实例分割（例如单个细胞）、目标追踪、细胞状态标注（例如细胞周期阶段），以及多种定量分析，包括对可用荧光通道的分析。

Cell-ACDC 的主要优势之一在于对活细胞延时显微成像数据的分析，此类分析由于需要在不同时间点之间保持一致性而面临显著挑战。尽管目前已存在多种用于单细胞自动分割与追踪的模型，但在解决复杂的生物学问题时，人工校正仍然至关重要。Cell-ACDC 提供了一套专门设计的工具，旨在简化校正流程。它集成了智能算法，以最大限度减少所需的人工干预。值得注意的是，校正结果会自动传播至所有相关联的前后帧，从而在整个分析过程中保持数据的完整性。鉴于其模块化设计和不断增长的用户群体，该软件的持续开发已成为优先事项，未来工作将持续聚焦于整合新模型并满足科研社区不断变化的需求。

方案

注意：Cell-ACDC 的设计力求对无编程背景的用户尽可能清晰直观。这主要通过将分析流程分解为更小、易于跟随的步骤，并通过工具提示和信息按钮提供附加信息来实现。由于 Cell-ACDC 涵盖了广泛的步骤，且这些步骤的执行顺序通常并非线性，因此在图2中展示了决策流程图。以下指南将通过一个具体示例进行说明。步骤10和步骤11可用于导入其他数据，而非使用在步骤3中下载的提供的数据。

1. 安装 Cell-ACDC

注意：Cell-ACDC 目前通过 Python 软件包索引（PyPI）以 Python 软件包的形式分发，可使用命令 pip install "cellacdc[torch]" 进行安装。

  1. 设置 Miniforge
    1. 从 Miniforge 网站下载安装程序（详见材料表）。
    2. 安装 Miniforge：对于Windows系统，运行下载的安装程序并按照提示操作；对于Mac 或 Linux系统，打开终端并运行以下命令：
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
    3. 安装完成后，按照以下说明打开正确的终端：
      1. 对于Windows系统，按下Win + S，输入Miniforge Prompt，然后按Enter。
      2. 对于Mac/Linux系统：打开终端应用程序。
  2. 管理虚拟环境。
    1. 在命令提示符中输入以下命令以创建虚拟环境，然后按Enter执行该命令。
      conda create -y -n acdc python=3.12
    2. 通过运行以下命令激活环境：
      conda activate acdc
  3. 安装
    1. 在激活环境后，运行以下命令安装 Cell-ACDC：
      pip install "cellacdc[torch]"
    2. 安装完成后，运行 Cell-ACDC -y 以完成软件的初始化设置。

2. 运行 Cell-ACDC

  1. 打开正确的终端（参见步骤 1.1.3）。
  2. 运行以下命令以激活环境：
    conda activate acdc
  3. 运行以下命令启动 Cell-ACDC：
    Cell-ACDC

3. 下载示例数据

注意：示例数据将下载到 Windows 系统的 "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8"，以及 MacOS 和 Linux 系统的 "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8"。如果未显示欢迎指南，请在主 Cell-ACDC 启动器窗口的菜单栏中选择 帮助 > 欢迎指南 （图 3B）（图 1）。

  1. 选择下载并使用延时成像示例进行测试（图3B）。
  2. 等待下载完成。
  3. 点击不，谢谢，以停止将数据直接加载到图形用户界面中。

4. 数据预处理模块

注意：数据可以在分割前进行对齐，并且可以选择感兴趣区域（ROI）。如果视野随时间发生位移，或仅对数据的某些部分感兴趣，则这些步骤虽为可选，但具有益处。

  1. 在主窗口中点击 启动数据预处理模块... ，以打开数据预处理模块（图 1A，数据预处理模块）。
  2. 选择包含数据的文件夹。
    1. 在新窗口的工具栏中点击 文件夹图标，以加载显微镜数据（图 4A）。
    2. 选择包含数据的文件夹，然后点击 选择文件夹 确认选择。
  3. 使用下拉菜单选择 phase_contr 通道，以用于对齐过程。然后点击 确定 确认选择（图 4B）。
  4. 点击 确定 确认图像属性（图 4C）。
    注意：如果处理的是 z-stack 数据，但仅需使用一个切片进行分割，请使用 滑块 选择合适的 z 切片。如有需要，可使用工具栏中的按钮将该选择应用到其他帧。
  5. 运行对齐过程。
    1. 点击位于工具栏中的 开始 按钮（图 5A）。
    2. 点击 是 以开始对齐过程。
      注意：点击 否 可跳过对齐。
    3. 点击 确定，以确认已知悉填充信息。
      注意：对齐所需时间取决于数据大小。
    4. 对齐完成后，点击 确定 结束对齐。
  6. 设置感兴趣区域（ROI）和背景 ROI。
    1. 使用数据预处理图形界面底部的帧选择滑块，跳转到分割视频的最后一帧。
    2. 通过拖动图像或使用菱形控制点调整自动添加的背景 ROI，确保背景 ROI 内不包含任何细胞。保持 ROI 不变（图 5B）。
      注意：如需定义额外的 ROI，可点击工具栏中的 添加裁剪 ROI 按钮，并在查看器中进行选择。通常，ROI 应尽可能小，同时覆盖所有相关帧中的目标细胞。但为确保本方案的可重复性，建议不要修改 ROI。
  7. 如需将选定的 ROI 裁剪为新的图像文件，请点击最左侧的 裁剪 按钮。
    注意：此步骤为可选。若无需裁剪图像，可直接关闭窗口。所有 ROI 和背景 ROI 的坐标将自动保存，可用于后续的分割。若未修改 ROI，则这些按钮将不执行任何操作。裁剪选项包括 XY 方向、z 切片或特定时间范围。每个按钮均标注了将被裁剪的维度。
  8. 保存对齐后的数据
    1. 使用窗口关闭按钮（例如，Windows 系统右上角的 X ，或 macOS 与 Linux 系统左上角的红色圆点）关闭窗口。
    2. 点击 是，保存对齐数据 以保存对齐后的数据。
    3. 再次点击 是，保存对齐数据 确认保存。
  9. 如果未跳过步骤 4.7 且未修改 ROI，则保存裁剪后的数据。
    1. 选择 是，保存裁剪数据 以保存裁剪后的数据。
    2. 点击 是，进行裁剪 确认保存裁剪结果。
    3. 点击 确定 确认默认文件夹路径。
      注意：如需保留未裁剪的数据，请选择其他文件夹。
    4. 若此前已使用默认路径，请选择 是，覆盖 以确认。
    5. 处理完成后，点击 确定 确认。

5. 寻找最佳的分割模型与参数

注意：Cell-ACDC 提供带有实时反馈的图形用户界面，用于寻找最佳分割参数（图6）。通常，这些模型由第三方提供，各自具有独立的文档说明。用户需自行确定最合适的分割模型及其最优参数，建议查阅所使用模型的相关文档以获取进一步信息。

  1. 在主窗口中点击 启动图形界面... （图1A，可视化与校正模块）。
  2. 加载样本数据。
    1. 在新窗口的工具栏中点击 文件夹图标，以打开文件夹选择菜单。
    2. 选择包含数据的文件夹，然后点击 选择文件夹 以确认选择。
  3. 选择一个用于可视化的通道。使用下拉菜单选择用于分割的通道 phase_contr，然后点击 确定 以确认。
  4. 完成数据加载。
    1. 点击 确定 以确认默认的分割掩膜名称。
    2. 点击 已加载位置的确定 以确认图像属性。
    3. 选择 否 以避免加载额外的荧光数据。
  5. 在 模式选择器（图6，"模式选择器"）中，选择 分割与追踪 模式。
  6. 寻找最佳预处理设置。
    1. 在顶部菜单栏中导航至 图像 > 预处理...，以打开自定义预处理窗口（图7A）。
    2. 在下拉菜单中选择 去除热点像素 或其他所需的预处理步骤。
    3. 使用 齿轮图标 初始化并更改某一步骤的设置。使用 信息按钮 查看该步骤的说明及可用参数。保持设置不变。
    4. 使用 加号图标 添加额外步骤。
    5. 选择 重缩放强度，并通过重复步骤 5.6.1 和 5.6.2 确认设置。
    6. 勾选 预览复选框 以实时查看各步骤的效果。
    7. 点击 应用到所有帧（图7B）。
    8. 点击 保存预处理数据 以开始保存过程。
    9. 点击 确定 以确认默认名称。
    10. 关闭 预处理流程 窗口。
  7. 寻找最佳分割设置。
    1. 在顶部功能区中选择 分割 > 分割当前显示帧，然后选择 YeaZ_v2（图8A）。
    2. 如提示，点击 确定 以下载 YeaZ_v2。
      注意：下载可能需要几分钟。进度将在控制台窗口中显示。下载期间请勿关闭图形界面，即使界面无响应。
    3. 保持默认参数不变。
      注意：大多数参数均配有 信息 按钮，提供详细指导。
    4. 勾选 后处理分割参数 以启用后处理（图8B）。
    5. 点击 确定 接受参数。
      注意：分割可能需要一定时间，具体取决于模型复杂度、图像大小和计算机配置。特别是 Cellpose 版本 4 可能非常缓慢。
    6. 若提示是否启用自动分割，请选择 否。
    7. 验证分割结果是否良好。
    8. 重复步骤 5.7.1 以重新打开分割参数设置。
    9. 若分割结果符合预期，点击 将所有参数保存至流程文件。否则，调整分割参数并重复步骤 5.7.4 至 5.7.8。
    10. 使用 文本输入框 将该分割流程命名为 test。
    11. 点击 确定 接受名称。
    12. 点击 确定 完成工作流程的保存。
    13. 关闭 参数选择界面。
  8. 关闭图形界面窗口
    1. 关闭图形界面窗口。
    2. 点击 否，关闭前不保存。

6. 分割与追踪（批量处理）

  1. 在主窗口中点击 启动分割模块…（图1A，"分割与追踪"模块）。
    1. 选择样本数据。使用 Cell-ACDC 的文件夹选择器选择包含数据的文件夹，然后点击 选择文件夹 以确认选择。
  2. 设置批量处理参数。
    1. 选择通道 phase_contr_preprocessed 作为用于分割的通道。点击 确定 以确认选择。
      注意：某些模型使用额外通道作为输入。该通道可在后续设置其他分割参数时进行选择。
    2. 点击 确定 确认图像属性。
  3. 设置分割模型参数。
    1. 选择 YeaZ_v2 作为用于分割的模型，然后点击 确定 确认选择。
    2. 点击 加载已保存的方案... 按钮，以加载先前保存的方案。
    3. 从列表中选择 segmentation_recipe_test.ini ，然后点击 确定 确认选择。
    4. 点击 确定 关闭加载成功提示信息。
    5. 选择 确定 确认参数设置。
  4. 确认其他分割设置。
    1. 点击 确定 接受分割文件的默认名称。
    2. 选择 否 以确认应对整幅图像进行分割。
    3. 选择 确定 将终止帧设置为延时成像的最后一帧。
  5. 设置追踪参数。选择 YeaZ 作为将使用的追踪方法，然后点击 确定 确认选择。
  6. 运行分割与追踪流程。
    1. 点击 立即运行 以执行分割与追踪流程。
      注意：根据图像大小、模型复杂度及计算机配置，此过程可能需要数小时。在测试运行中，使用 YeaZ_v2 对测试数据进行分割在无 GPU 的设备上耗时约 2 分钟。
    2. 点击 确定 完成分割过程。

7. 修正分割和追踪错误

注意：通常情况下，与前一帧相比当前帧中缺失的细胞以黄色轮廓和编号标示。新检测到的细胞以红色编号和粗轮廓显示。已被确认为丢失的细胞以绿色轮廓和编号显示。

  1. 在主窗口中点击 启动图形界面... （图1A，“"可视化与校正"模块）。
  2. 加载样本数据。
    1. 在新窗口的工具栏中点击 文件夹 图标。
    2. 选择包含数据的文件夹，然后点击 选择文件夹 以确认选择。
  3. 选择用于可视化的通道。使用下拉菜单选择通道 phase_contr_preprocessed，然后点击 确定 以确认。
  4. 选择分割掩膜名称。点击 加载所选 以加载上一步生成的分割文件。
  5. 完成数据加载过程。
    1. 点击 已加载位置的确定 以确认图像属性。
    2. 选择 否 以避免加载额外的荧光数据。
  6. 使用 模式选择器（图6，“"模式选择器"）选择 分割与追踪 模式。
    注意：使用图形界面底部的复选框更改显示的注释内容。左右图像可显示不同的注释。
  7. 选择实时追踪器。在菜单栏（图6，“"菜单栏"）中，依次选择 追踪 > 选择实时追踪算法 ，并选择所需的实时追踪器。对于出芽酵母，请使用 Cell-ACDC 或 Cell-ACDC 两步法；对于其他生物体，请使用 Cell-ACDC 对称分裂 。
  8. 校正分割与追踪结果。
    1. 使用 左右箭头键 在各帧之间切换。
    2. 跳转至第 10 帧。
    3. 按下 S 键以激活手动芽体分离工具。
    4. 使用 右键单击 自动分割细胞1的掩膜。
    5. 跳转至第 14 帧。
    6. 按下 B 键以激活画笔工具。
    7. 使用 鼠标左键 绘制缺失的芽体分割掩膜。
    8. 逐帧浏览后续图像，并校正分割与追踪错误。使用可用工具（图6，“"编辑工具栏"）。至少校正至第42帧。
      注意：大多数工具均配有说明其功能的工具提示。将鼠标悬停在工具上即可显示提示信息。

8. 细胞周期注释

注意：仅在完成所有感兴趣帧的分割和跟踪校正后，才进入此步骤。根据细胞分裂类型（对称分裂，例如哺乳动物细胞，或不对称分裂，例如出芽酵母）使用相应的标注模式。对于示例数据，请参见"不对称分裂细胞"中的步骤 8.1。步骤 8.2 描述了对称分裂细胞的一般工作流程。

  1. 不对称分裂的细胞
    注意：对于芽殖酵母等生物，可以将芽体分配给母细胞。两个对象必须同时存在于同一帧中。默认情况下，将显示基于芽殖酵母注释所预测的细胞周期阶段。芽体的细胞周期阶段以红色显示，其他所有对象的细胞周期阶段以白色显示。母细胞与其芽体之间用一条黄色虚线连接。
    1. 使用模式选择器激活细胞周期分析功能（图6，"模式选择器"）。
    2. 当系统提示时，选择是，跳转至第1帧。
    3. 使用左右箭头键在各帧之间导航。
    4. 导航至第41帧。当系统提示时，点击确定以接受细胞周期注释表的初始化。
    5. 右键单击细胞1或其芽体，以断开连接并注释该细胞分裂事件。
    6. 继续操作，直到查看完所有相关帧。使用可用工具修正自动母-芽分配中的错误（图6，"编辑工具栏"）。
    7. 可用工具
      注意：除断开/重新绑定母-芽关联工具外，这些工具均可通过自定义快捷键或点击工具栏中的对应按钮来激活。
      1. 将芽体分配给母细胞（A）：激活将芽体分配给母细胞工具。在芽体上按住鼠标右键，拖动至对应的母细胞后释放鼠标按钮。
        注意：当芽体与母细胞的自动分配不正确时，请使用此工具。
      2. 注释未知谱系（U）：激活注释未知谱系工具。使用鼠标右键点击需要标记为谱系未知的细胞。
        注意：此工具用于手动标注谱系未知的细胞，有助于修正自动推断不足导致的谱系模糊问题。
      3. 重新初始化细胞周期注释
        注意：使用此选项可从当前帧开始重新运行细胞周期注释算法，确保与最近对分割/追踪数据所做的修正或更新保持一致。
      4. 断开/重新绑定母-芽关联：确保未选择其他任何工具。右键单击现有的母-芽配对以断开关联，再次右键单击可重新建立连接。
  2. 对称分裂的细胞
    注意：此功能目前处于测试阶段，即将正式发布。可将两个或多个子代细胞分配给单个母细胞。潜在的母细胞是指在前一帧中存在但在当前帧中消失的细胞，而潜在的子代细胞则是在当前帧中新出现的细胞。
    1. 使用模式选择器激活正常分裂：谱系树模式（图6，"模式选择器"）。
    2. 当系统提示时，选择是，跳转至第1帧。
    3. 使用左右箭头键在各帧之间导航。
    4. 使用可用工具修正自动母-子分配中的错误（图6，"编辑工具栏"）。
    5. 当系统提示时，点击传播以传播更改。
    6. 可用工具
      注意：这些工具可通过快捷键或工具栏中的对应按钮激活。
      1. 为新细胞ID查找母细胞（F）：激活为新细胞ID查找母细胞工具。右键单击新细胞以在候选母细胞间循环切换。Shift + 右键单击可反向循环候选母细胞。
        注意：使用此工具可为子代细胞分配或修改其母细胞。
      2. 设置母细胞未知（U）：激活设置母细胞未知工具。右键单击母细胞未知的细胞。
        注意：使用此工具可手动将某细胞的母细胞标记为未知。

9. 保存数据

  1. 在顶部功能区中，导航至 文件 > 保存。
  2. 点击 设置测量值... 以选择所需的测量项目。
  3. 勾选 mCitrine 指标 旁边的复选框，或任何其他需要的测量项目。
  4. 点击 确定 进行确认。
  5. 点击 是 以保存测量结果。
  6. 点击 确定 以确认应保存测量值的帧数范围。
  7. 当提示数据拼接时，点击 否。

10. 创建数据结构

注意：本节介绍如何为分割和追踪准备显微镜数据。当使用示例数据时，此步骤可以跳过，示例数据可在"下载示例数据"中下载。即将生成的数据结构如图9所示。

  1. 将显微镜文件放入一个空文件夹中。
    注意：支持的显微镜格式包括 .czi（Zeiss）、.lif（Leica）和 .nd2（Nikon），以及单个 .tif 和 .png 文件。
  2. 在主窗口中点击模块 0. 创建数据结构…（图 1A，"Create data structure" 模块）。
  3. 选择 BioIO 或 Fiji Macro。
    1. 若使用 Windows，请点击 使用 BioIO；若使用 MacOS 和 Linux，请选择 使用 Fiji Macro。
      注意：以下内容均假设使用 Windows 系统。
    2. 如果提示安装 BioIO，请点击 确定 进行安装。
    3. 选择显微镜文件的排列方式。使用下拉菜单选择与显微镜文件排列方式匹配的选项，然后点击 确定 确认。
  4. 选择源文件夹、目标文件夹及数据加载策略
    1. 点击 完成 确认文件位于一个其他内容为空的文件夹中。
    2. 使用 Cell-ACDC 的文件夹选择器选择包含文件的文件夹。
    3. 点击 选择文件夹 以选择文件夹。
    4. 再次点击 选择文件夹，将同一文件夹选为目标文件夹。
      注意：原始显微镜文件不会被删除。
    5. 选择 是，一次性加载整个位置。
  5. 如果提示安装 BioIO 子包，请点击 确定 进行安装。
  6. 设置输入文件的元数据。
    1. 修正元数据。
      注意：通过点击 通道名称字段旁的小眼睛图标 ，仔细核对"维度顺序"。无法从原始文件加载的其他元数据将被高亮显示。
    2. 点击 确定 确认元数据。
    3. 点击 是 确认维度顺序。
  7. 等待处理完成。
  8. 处理完成后，点击 是 关闭窗口。
    注意：创建数据结构所需时间可能长达数小时，具体取决于数据大小。

11. 数据预处理工具

注意：在进入分析之前，主窗口中提供了多种图像处理选项。要访问这些工具，请转到主窗口菜单栏中的实用工具下拉菜单（图1B，"Utilities"），将鼠标悬停在图像预处理上，然后选择应使用的选项。两个示例如下：

  1. 合并通道：用于合并两个或多个图像通道。
    注意：例如，可以对两个荧光通道进行平均。
  2. 调整图像大小：用于减小非常大的图像数据集的尺寸。
    注意：这可以显著缩短处理时间，并且在许多情况下对分割质量几乎没有或完全没有影响。

12. 问题排查

  1. 如果 Cell-ACDC 崩溃，请前往 Cell-ACDC 的 GitHub 页面，在 Issues 选项卡中点击绿色的 New issue 按钮以创建错误报告。请按照提供的模板填写诊断和解决问题所需的全部相关信息。您也可以选择在 image.sc 论坛中寻求帮助，使用标签 #cell-acdc，或联系任意一位通讯作者。在许多情况下，尤其是在安装软件包后，简单地重启软件即可解决问题。
  2. 如果 Cell-ACDC 冻结或无响应，请检查控制台以获取进度更新。当使用计算量较大的模型（例如 Cellpose 版本 4）或处理大型数据集时，较长的分割时间属于正常现象。如果 Cell-ACDC 仍无响应，请参考 步骤 12.1 获取进一步操作说明。
  3. 如果自动分割错误地包含了背景区域，请检查预处理步骤是否过度平滑了背景。许多分割模型是在原始（未经预处理）图像上训练的，当背景缺乏足够纹理时，模型性能可能会下降。

结果

三维肿瘤球体中细胞核体积的定量分析

自动化的三维显微成像（z轴堆栈）使科学家能够可视化复杂的多细胞系统，例如类器官。为了在单细胞水平上量化形态学和荧光信号特性，通常需要进行三维细胞分割。以下示例展示了 Cell-ACDC 如何利用细胞核染色通道对包含数千个细胞的类器官中的细胞核进行分割，并量化其体积（数据来自参考文献9）。分割使用了一个定制的 Cellpose 模型完成，该模型已在参考文献9中训练并发布。通过在图形用户界面（GUI）中选择 Cellpose v2 的模型参数时提供权重文件路径，即可在 Cell-ACDC 中直接使用该训练好的 Cellpose 模型。分割过程使用 Cell-ACDC 的第二个模块批量处理所有图像（图1A，“分割与追踪”模块）。随后，在第三个模块的图形界面中对结果进行可视化（图1A，“可视化与修正”模块）。该模块经过优化，可对数千个独立对象进行可视化，并支持多种标注选项（例如轮廓线、叠加的分割掩膜或文本ID）。在基于三维掩膜计算出测量数据后，所有可用的测量参数会直接在图形界面中记录。用户可通过顶部菜单栏（图6，“菜单栏”），选择 测量值 菜单，然后点击 设置测量值… 进行访问。弹出的对话框允许用户通过信息按钮获取特定测量值的说明，并选择需要保存的测量项目。在 图10 所示的代表性结果中，使用了“cell_vol_fl_3D”这一参数，该参数表示每个对象的体积，其计算方式为：将对象内的总体素数乘以像素面积（像素大小的平方）再乘以体素深度。这些参数信息可从显微镜原始文件中自动提取，或由用户手动输入。通过该图形界面计算测量值需要加载原始图像。因此，为简化流程并实现批量处理，也可通过 工具 菜单（图1B，“工具”）中的子菜单 测量值 下的 为一个或多个实验计算测量值 功能来完成测量计算。最后，将细胞核体积分布绘制成代表性结果（图10）。该分析揭示了存在大量体积较小的细胞核，这可能是由分割伪影所致。这些小体积对象可通过在分割掩膜中过滤掉小尺寸对象轻松去除。同时，体积异常大的细胞核可能源于分割过程中多个细胞核被错误合并。建议始终绘制对象（例如单个细胞）的体积分布图，以识别伪影并获取有关细胞大小的额外生物学信息。

时间序列显微镜数据的量化分析

通过延时显微镜，可以在单细胞水平直接观察细胞动态。除了细胞分割之外，提取时间动态信息还需要进行额外的分析，包括细胞追踪和细胞谱系注释。由于这些分析步骤之间相互依赖，早期流程中引入的错误可能会传播到后续步骤中。因此，持续地对分割、追踪和注释错误进行可视化检查与校正十分必要。以下结果表明，Cell-ACDC 适用于完成这些任务。本研究选取了两种不同模式生物的两个数据集：1）出芽酵母（菌株 DCY001-1，来源参考文献35，其中两种组蛋白 H2B 蛋白 Htb1 和 Htb2 被标记为 mCitrine），以及 2）小鼠胚胎干细胞（mESCs，数据来自参考文献22）。

这两个数据集展示了 Cell-ACDC 中提供的两种标注模式：不对称分裂和对称分裂（即对称性细胞分裂，或“正常”细胞分裂）。由于分裂方式不同，这两种生物需要采用不同的追踪和注释框架。

在不对称分裂过程中，母细胞形成一个芽体，该芽体生长并最终分离成为子细胞。分裂后，母细胞保留其原有的细胞编号，其代数增加一，而子细胞被赋予新的细胞编号，其代数设为一。出芽阶段对应于细胞周期的S/G2/M期，在Cell-ACDC中被相应地标注。这些标注方式有助于解答与芽殖酵母细胞周期相关的典型生物学问题。

在“对称”分裂的情况下（例如哺乳动物细胞），母细胞分裂为两个子细胞。母细胞即其编号在分裂后消失，两个子细胞获得新的编号。此外，子细胞的代数相对于母细胞增加一代。Cell-ACDC 还会记录父代编号、根编号（谱系起始时的原始祖先细胞）以及姐妹细胞编号。

对于两种标注模式，均开发了一种创新框架以校正标注错误，该框架可将校正结果自动传播至所有相关的历史和未来时间点。可视化、标注及校正操作均在第三个模块的图形用户界面中完成（图1A，“可视化与校正”模块，以及图6）。为对数据集1中的细胞进行分割与追踪，相位差通道应用了模型YeaZ_v226，而细胞核（组蛋白）通道则使用了StarDist25模型。随后，通过工具追踪与谱系 > 追踪和/或计数亚细胞结构（图1B，工具菜单栏），Cell-ACDC将每个细胞核分配其对应细胞的细胞ID，从而确保由细胞和细胞核掩膜生成的表格之间的一致性。

对于数据集2，采用了DeepSea22分割模型。这三种模型均已集成于Cell-ACDC中，体现了将多种分割模型整合至软件中的优势。

在修正了细胞分割与追踪错误后，对细胞谱系进行了注释，计算了数值特征，并开展了后续分析。对于数据集1，将列TaYFP_amount_autoBkgr以及被分割的细胞核数量（图11A）随时间作图。“TaYFP”是核通道的名称。“amount_autoBkgr”是来自落射荧光图像的细胞总蛋白量的代理指标36，其计算方法为：每个细胞掩膜内的平均荧光强度与背景中位值之差，乘以细胞面积（以像素为单位）。此处，背景中位值由所有未被分割为细胞的像素计算得出。如预期所示，H2B蛋白量在芽体出现时开始增加（图11A-ii），并在核分裂前达到稳定值（图11A-iii）。这是组蛋白蛋白稳态的一项重要质量控制指标，因为组蛋白蛋白的含量应依赖于细胞周期。此外，将细胞核数量随时间变化作图也证实，组蛋白蛋白量在核分裂前后达到峰值。

对于数据集2，绘制了经历细胞分裂的选定细胞随时间变化的细胞面积。如预期所示，细胞面积逐渐增加，直至达到最大值（图11B-i）；随后，细胞发生收缩，面积逐渐减小，直至完成细胞分裂（图11B-ii）。最后，两个子细胞重新开始这一周期。这是另一种推荐的分析方法，因为检测细胞周期中细胞大小的变化对于确认细胞是否正常生长和分裂（或在特定突变体中是否异常）至关重要。

显微镜数据处理流程图；Cell-ACDC 中的图像分析、分割和特征提取。
图 1：Cell-ACDC 模块。（A）可从主 Cell-ACDC 启动器启动的四个主要模块概览。在完成显微镜数据的分割、追踪和标注后，数值特征可通过第三个模块（“可视化与校正”）或（B）顶部菜单栏中的 Utilities 菜单进行计算。“Utilities”是指可无需用户干预、自动在多个数据集上运行的程序。除计算测量值外，其他功能还包括将多个输出表格合并为单个表格、亚细胞结构的追踪以及图像预处理。Cell-ACDC 支持 2D、3D（z-stack 或延时成像）和 4D 数据（随时间变化的 z-stack），并可包含任意数量的附加通道。包含数值特征的输出表格可用于后续分析和生物学发现（图 10 和 图 11）。为此，Cell-ACDC GitHub 页面上提供了 Jupyter Notebook 示例，其中包含从输出表格生成的图表示例。请点击此处查看此图的放大版本。

使用 Cell-ACDC 和 Fiji 宏工具进行显微图像处理的细胞分割工作流程图。
图 2：Cell-ACDC 决策流程图。 该流程图概述了根据数据集类型和分析需求应使用的模块。请点击此处查看此图的放大版本。

用于显微镜数据分析的 Cell-ACDC 软件界面；指南和下载功能已标出。
图 3：下载示例数据。（A）打开欢迎指南。（B）下载用于复现本实验方案所需的示例数据。请点击此处查看该图的放大版本。

Cell-ACDC 软件使用步骤：打开文件、选择通道、查看图像属性；数据处理。
图 4：加载数据以进行数据预处理。（A）将数据加载到数据预处理图形用户界面中。（B）选择要加载的通道。（C）编辑并确认图像元数据。请点击此处查看该图的放大版本。

使用软件界面进行细胞分析；显微镜图像制备；数据裁剪与感兴趣区域设置。
图 5：运行数据预处理流程。（A）启动流程。（B）设置感兴趣区域（用于裁剪）和背景感兴趣区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

带有注释选项、模式选择器和工具栏界面的细胞分割与追踪图形用户界面。
图6：用于可视化和校正结果的第三个模块图形用户界面。 第三个模块的图形用户界面截图（见图1A中的“可视化与校正”），图中高亮显示了各项功能。请注意，工具栏上的大多数按钮都配有工具提示（将鼠标指针悬停在按钮上即可查看），说明如何使用特定功能。模式选择器可用于在5种模式之间切换：“查看器”、“分割与追踪”、“细胞周期分析”（适用于不对称分裂的细胞）、“正常分裂：谱系树”（适用于对称分裂的细胞，例如哺乳动物细胞）以及“自定义注释”。请注意，其他图形用户界面中也常包含工具栏或菜单栏（例如“数据预处理”模块，图1）。编辑工具栏包含所有可用于编辑和校正分割与追踪错误的功能（例如画笔、橡皮擦、编辑ID等）。加载的图像以双面板视图显示，这在需要不同注释选项时非常有用（例如左侧图像显示细胞周期信息，右侧图像显示细胞ID）。右侧图像也可以关闭（右键单击图像并取消选择显示镜像图像）。每个图像面板侧面均配有LUT滑块，可快速调整强度水平。通过右键单击LUT控件，用户可以选择不同的颜色映射方案用于强度图像。此外，在右侧还有一个LUT选择器，用于设置分割标签的颜色，以便叠加在强度图像上（注释选项称为Segm. masks）。在左侧图像的注释选项左侧，还有额外的切换开关用于控制某些设置，例如自动保存、字体大小等。请点击此处查看此图的放大版本。

图像处理软件界面、预处理步骤、示意图、数据重缩放和像素校正。
图7：在主图形用户界面中可视化预处理过程。（A）打开预处理对话框。（B）已初始化本实验方案所用参数的预处理对话框。请点击此处查看该图的放大版本。

分割参数界面；图像分析软件；后处理；相差方法。
图8：在主图形用户界面中可视化分割结果。（A）选择一个分割模型。（B）设置分割参数。请点击此处查看该图的放大版本。

实验文件夹结构示意图、元数据文件、按组织位置排列的图像通道。
图 9：Cell-ACDC 所需的文件夹结构。要使用 Cell-ACDC，数据必须按照特定的文件夹结构进行组织。尽管 Cell-ACDC 提供了一个模块可自动生成该结构，但理解该结构的具体形式仍然非常重要。首先，所有文件必须位于一个名为 Images 的文件夹内。其次，所有文件名必须以相同的名称开头，即所谓的“basename_”。最基本的一组必需文件包括一个单通道 TIFF 文件（2D、3D z-stack 或 3D+时间序列）以及一个以 "_metadata.csv" 结尾的 CSV 文件。该 CSV 文件必须是一个包含两列的表格，第一列为 Description，第二列为 values，且至少包含 SizeT 和 SizeZ 两项，分别表示时间帧数和 z 层切片数。如果图像文件不包含 z 层切片，则 SizeZ 必须设为 1；同样，若非延时成像，则 SizeT 必须设为 1。作为 CSV 文件，每一项为一行 Description,value，以逗号分隔，例如 SizeZ,1。对于多通道图像，需为每个通道生成一个独立的 TIFF 文件。Images 文件夹随后必须置于名为 "Position_1" 的文件夹内。允许多个位置，且必须按连续编号命名。在将数据加载到任意 Cell-ACDC 模块时，用户可选择特定的 Position 文件夹，也可选择整个实验文件夹。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞核分割过程；三维成像分析；荧光显微镜；直方图结果。
图10：肿瘤类器官的三维定量分析。 将一个代表性肿瘤类器官（数据来自9）载入Cell-ACDC软件第三模块图形用户界面的截图（左图），带有红色轮廓的示例z切片，用于突出显示分割掩膜（中图），以及基于三维分割掩膜计算得到的细胞体积分布直方图（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞追踪分析软件界面，显示H2B蛋白和细胞面积随时间变化的图表。
图11：延时显微镜数据的定量分析。（A）出芽酵母细胞的延时显微镜数据载入Cell-ACDC第三模块图形用户界面的截图（左），以及代表性细胞周期中组蛋白H2B蛋白含量随时间的定量结果（右）。放大图像显示了示例细胞及其芽体（白色箭头）在细胞周期开始时（i）、芽体出现时（ii）和核分裂时（iii）的状态。数据来自Chatzitheodoridou等人的研究35。（B）小鼠胚胎干细胞的延时显微镜数据载入Cell-ACDC第三模块图形用户界面的截图（左），以及代表性细胞分裂过程中细胞面积（µm2）随时间变化的曲线图（右）。放大图像显示了示例细胞及其子代细胞在分裂前达到最大细胞面积时（i）、分裂为两个子细胞时（ii）以及分裂后最后一个被分析的帧（iii）的状态。数据来自Zargari等人的研究22,33。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

多维显微镜数据的分析通常需要使用前沿的由人工智能驱动的模型。然而，这些工具开发迅速，且在采用时存在较高的入门门槛。此外，生物学家通常需要对结果进行可视化，以实现有效的错误校正。本文展示了科学家如何利用 Cell-ACDC 来应对这些挑战。

本方案中的关键步骤是选择最优的分割模型。Cell-ACDC 包含一个图形用户界面，支持可视化选择（图1A，“"可视化与校正"模块）。同时提供了用于数据准备和多数据集批量处理的工具（图1A，创建数据结构、数据预处理、分割与追踪模块，以及实用工具）。鼓励用户在 image.sc 论坛（使用标签 #cell-acdc）或通过 Cell-ACDC GitHub 页面提交问题报告并提供反馈。

尽管Cell-ACDC已应用于相对较大的数据集，例如包含数千个细胞核的类球体图像9，或每帧包含数百个细胞的芽殖酵母延时成像数据，但该程序必须将整个单通道数据加载到内存中才能正常运行。建议可用内存至少为图像文件大小的三倍，以确保运行稳定。目前，超出系统可用内存的数据集无法处理，但未来计划通过整合OME-Zarr37实现对非核心（惰性）加载的支持。

目前，Cell-ACDC 的主要局限之一是对 3D+时间序列数据集的支持尚不完整，因为大多数工具仅针对 3D z-stack 或 2D+时间序列数据开发。因此，未来版本的 Cell-ACDC 将扩展其功能，以全面支持 3D+时间序列数据。此外，我们正在努力扩展细胞谱系注释框架，以适用于"对称分裂"的细胞（例如哺乳动物细胞），即母细胞分裂为两个子细胞的情况（与芽殖酵母相反，芽殖酵母的母细胞每个细胞周期仅通过出芽产生一个子细胞）。最后，目前 Cell-ACDC 仅限于单通道数据能够完全载入内存的数据。因此，我们计划如上所述实现惰性加载功能。

自发布以来，Cell-ACDC 持续得到改进，例如增加了新的分割与追踪模型、新的标注框架（如适用于哺乳动物细胞的框架，目前正在内测阶段），以及多项性能优化。得益于这些进展，科研人员可利用 Cell-ACDC 加速研究进程并推动科学发现6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49。与现有方法相比14,27,50,51，该软件框架的独特之处在于其能够利用并补充现有模型，从而受益于学术界的整体发展。Cell-ACDC 的持续开发正被积极维护，旨在将其确立为分析多维显微镜数据的参考框架。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢Mario Vitacolonna和Rudolf Rüdiger分享图10中的类球体数据，感谢功能表观遗传学研究所的同事Pascal Falter-Braun和Carsten Marr提供的宝贵讨论。特别感谢多位用户提供的宝贵反馈、对新功能的测试以及耐心报告的问题。本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）项目416098229、亥姆霍兹协会以及慕尼黑数据科学联合研究学院资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
婴儿Julian Pietsch10.7554/eLife.79812分割与追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
贝叶斯追踪器Kristina Ulicna10.3389/fcomp.2021.734559追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
Cell-ACDCFrancesco Padovani10.1186/s12915-022-01372-6软件
Cellpose 生殖系细胞核模型Cristina Piñeiro López / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana figure-materials-1avka10.17912/MICROPUB.BIOLOGY.001062分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
Cellpose 版本 2Carsen Stringer10.1038/s41592-020-01018-x分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
Cellpose 版本 3Carsen Stringer10.1038/s41592-025-02595-5分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
Cellpose 版本 4（Cellpose-SAM）Marius Pachitariu10.1101/2025.04.28.651001分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
计算机--参见下方推荐配置
计算机 - CPU任意-推荐最低配置：4 核，2.5 GHz 
计算机 - GPUNvidia（优先） -（可选）推荐最低配置：8 GB 显存
计算机 - 硬盘空间任意-4 GB + 显微图像文件大小的 3 倍
计算机 - 操作系统Microsoft、Apple、其他-支持 Windows、macOS 和 Linux
计算机 - 内存（RAM）任意-单个位置文件大小的 3 倍，最低 16 GB
DeepSeaAbolfazl Zargari10.1016/j.crmeth.2023.100500分割与追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
DeLTA Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O’Connor10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797分割与追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
InstanSegThibaut Goldsborough10.48550/arXiv.2408.15954分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
Miniforgeconda-forge-从 Miniforge 官网下载安装程序的链接：https://conda-forge.org/download/
OmniposeKevin Cutler10.1038/s41592-022-01639-4分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
pomBseenMakoto Ohira10.1371/journal.pone.0291391分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
SAM（任意分割模型）Alexander Kirillov10.48550/arXiv.2304.02643分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
StarDistUwe Schmidt / Martin Weigert10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
TAPIRCarl Doersch10.48550/arXiv.2306.08637追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
TrackastraBenjamin Gallusserhttps://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
TrackpyDaniel Allan10.5281/zenodo.1213240追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
YeastMateDavid Bunk10.1093/bioinformatics/btac107分割软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装
YeaZNicola Dietler10.1038/s41467-020-19557-4分割与追踪软件，可选，可通过 Cell-ACDC 自动安装

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