Method Article

使用 Cell-ACDC 分析多维显微镜数据

DOI:

10.3791/68954

⸱

November 7th, 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Functional Epigenetics, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, 2Institute of Network Biology, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, 3Institute of AI for Health, Computational Health Center, Helmholtz Zentrum München

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

准确分析多维显微镜数据需要复杂的工作流程。本文演示如何使用 Cell-ACDC 软件。它利用最先进的人工智能驱动模型进行显微镜数据的分割、跟踪、细胞谱系分析和量化。至关重要的是，它通过一个创新框架来补充这些模型，用于对模型输出进行半自动校正。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生命科学定量显微镜的最新进展使实验生物学家能够以前所未有的分辨率和速度探测细胞。与此同时，人工智能革命极大地增加了可以从多维显微镜数据中提取的信息量。然而，生成的大量数据和最先进的人工智能模型的复杂性在图像分析阶段造成了严重的瓶颈。Cell-ACDC 是一款开源、用户友好的软件，为多维显微镜数据中单细胞的分割、跟踪和定量分析提供了强大的端到端解决方案。它专为可能缺乏实施此类模型所需的先进技术专业知识的实验生物学家量身定制。本文介绍了如何利用该框架轻松利用最新模型，以及许多用于智能和半自动数据校正的工具，以最大限度地获得可获得的生物信息量。Cell-ACDC 支持多通道、延时和 z 堆栈显微镜数据，并提供针对每种数据维度定制的专用工具集。由于其模块化设计，允许新模型无缝集成并由生物学家直接访问，Cell-ACDC 有潜力作为显微镜数据分析的参考工具。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

显微镜已成为加速研发每个阶段生物发现的基础，从基础科学 1,2,3 到药物发现和测试 4,5，以及从细胞培养物到组织 6,7、类器官 8,9 和整个生物体10 的各种规模.然而，这些先进的显微镜技术有两个主要缺点。首先，显微镜数据本质上是大的11，尤其是在获取多个维度（例如时间和体积）时。其次，准确提取数据中丰富的生物信息需要部署通常基于人工智能模型的高级图像分析框架。对于实验生物学家来说，这项任务可能是一项艰巨的任务。因此，数据处理、处理和分析的步骤会大大减慢科学研究的速度，同时降低新发现的潜力。理想情况下，用于生物图像分析的软件框架应帮助用户完成分析的每一步，从原始显微镜文件处理到分割和跟踪，再到提取生物学见解的下游分析。在实践中，用于生物图像分析的新软件的快速开发虽然是一个积极的结果，但也产生了副作用，即创建特定于特定分析步骤或需要高级编程专业知识的工具的分散环境。这给用户带来了组装分析工作流程的艰巨任务，通常会导致次优的管道，其中数据被多次保存、作和转换以使其与下一个工具兼容。此外，生物图像分析的开发并没有标准化为单一的编程语言，许多工具被开发为 ImageJ12 或 QuPath13 插件 （Java）、Napari 插件 （Python）14 或 Python 脚本。在某些情况下，这种充满挑战的环境导致科学家选择手动分析，这一过程不仅缓慢，而且会引入人为偏见并阻碍可重复性。

为了解决这个问题，开发了Cell-ACDC（细胞分裂周期的细胞分析）15，这是一个用Python编写的基于GUI的开源软件工具集，用于分析多维显微镜数据。至关重要的是，Cell-ACDC 为两种分割（Cellpose、StarDist、Segment Anything、YeaZ、YeastMate 等）提供了大量预先实现和自动安装（需要时）的最先进的模型（Cellpose、StarDist、Segment Anything、YeaZ、YeastMate 等16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27,28）和跟踪（Trackastra、Trackpy、贝叶斯跟踪器、Cell-ACDC 等19,29,30,31,32,33,34）。这些模型辅以用于可视化注释数据和计算机辅助手动校正的框架。此外，在同一框架内，Cell-ACDC 为图像分析管道的每个步骤提供了一个模块，自动处理、处理和保存数据（图 1）。更具体地说，它使用户能够执行实例分割（例如，单个细胞）、对象跟踪、细胞状态注释（例如，细胞周期阶段）和各种形式的定量，包括对可用荧光通道的分析。

Cell-ACDC 的主要优势之一是对活细胞延时显微镜数据的分析，由于需要跨时间点的一致性，这带来了重大挑战。虽然存在许多用于单细胞自动分割和跟踪的模型，但手动校正对于解决复杂的生物学问题仍然至关重要。Cell-ACDC 提供了一套专门设计用于简化校正过程的工具。它集成了智能算法，以最大限度地减少手动调整的次数。值得注意的是，校正会自动传播到所有相关的未来和过去帧，从而在整个分析过程中保持数据完整性。鉴于其模块化设计和不断增长的用户群，该软件的持续开发是当务之急，并继续努力集成新模型并满足社区不断变化的需求。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：Cell-ACDC 的设计对于没有编程背景的用户来说尽可能清晰直观。这主要是通过将分析工作流程分解为更小的、易于遵循的步骤并通过工具提示和信息按钮提供附加信息来实现的。由于 Cell-ACDC 涵盖了广泛的步骤，其执行顺序通常不是顺序的，因此决策图如 图 2 所示。以下指南将介绍一个具体示例。步骤 10 和 11 可用于导入其他数据，而不是使用步骤 3 中下载的提供数据。

1. 安装 Cell-ACDC

注意：Cell-ACDC 目前通过 Python 包索引 （PyPI） 作为 Python 包分发，可以使用命令 pip install “cellacdc[torch]” 进行安装。

  1. 设置 Miniforge
    1. 从 Miniforge 网站下载安装程序（有关详细信息，请参阅材料表）。
    2. 安装 Miniforge：对于 Windows，运行下载的安装程序并按照说明进行作。对于 Mac 或 Linux，打开终端并运行以下命令：
      curl -L -O “https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$（uname）-$（uname -m）.sh
    3. 安装完成后，请按照以下说明打开正确的终端：
      1. 对于 Windows，按 Win + S，键入 Miniforge Prompt， 然后按 Enter。
      2. 对于 Mac/Linux：打开终端应用程序。
  2. 管理虚拟环境。
    1. 在提示符中，键入以下命令以创建虚拟环境。然后按 Enter 执行命令。
      conda create -y -n acdc python=3.12
    2. 通过运行以下命令激活环境：
      CONDA 激活 ACDC
  3. 安装
    1. 在环境处于活动状态时，通过运行以下命令安装 Cell-ACDC：
      pip 安装“cellacdc[torch]”
    2. 安装后，运行 Cell-ACDC -y 让软件完成设置。

2. 运行 Cell-ACDC

  1. 打开正确的终端（参见步骤 1.1.3）。
  2. 通过运行命令激活环境：
    CONDA 激活 ACDC
  3. 通过运行以下命令启动 Cell-ACDC：
    细胞-ACDC

3. 下载示例数据

注意：示例数据将在 Windows 上下载到“C：\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8”，在 MacOS 和 Linux 上下载到“~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8”。如果未显示欢迎指南，请在主 Cell-ACDC 启动器窗口（图 1）的菜单栏中选择帮助>欢迎指南（图 3B）。

  1. 选择 下载并使用延时示例进行测试 （图 3B）。
  2. 等待下载完成。
  3. 单击 “否，感谢停止 将数据直接加载到GUI中”。

4. 数据准备模块

注意：可以在分割之前对数据进行对齐，并且可以选择 感兴趣区域 （ROI）。 这些步骤是可选的，但如果视场随时间移动或只有部分数据感兴趣，则这些步骤是有益的。

  1. 单击主窗口中的启动 数据准备模块...以打开数据准备模块（图 1A，数据预处理模块）。
  2. 选择包含数据的文件夹。
    1. 单击新窗口工具栏中的 文件夹图标 以加载显微镜数据（图4A）。
    2. 选择包含数据的文件夹，然后按选择 文件夹确认选择。
  3. 使用下拉菜单选择 phase_contr 通道，为对齐过程选择通道。然后，按 确定 确认选择（图 4B）。
  4. 按 确定 确认图像属性（图 4C）。
    注意：如果使用 z 堆栈数据，但只能使用一个切片进行分割，请使用 滑块选择适当的 z 切片。如果需要，使用工具栏中的按钮将选择应用到其他帧。
  5. 运行对齐过程。
    1. 单击 开始 按钮，该按钮也位于工具栏中（图 5A）。
    2. 单击 是 开始对齐过程。
      注意：单击 “否 ”可跳过对齐。
    3. 按 确定 以确认有关填充的信息已确认。
      注意：对齐可能需要一些时间，具体取决于数据大小。
    4. 该过程完成后按 确定 完成对齐。
  6. 设置投资回报率和背景投资回报率。
    1. 使用数据准备 GUI 底部的帧选择滑块转到分割视频的最后一帧。
    2. 通过在图像上拖动或使用菱形调整其大小来调整自动添加的背景 ROI。确保后台 ROI 没有单元格。保持 ROI 不变（图 5B）。
      注意：要定义其他 ROI，请单击 添加裁剪 ROI 按钮（位于工具栏中）并在查看器中选择它们。通常，投资回报率应尽可能小，同时仍包含相关帧中所有感兴趣的单元。但是，为确保该协议内的可重复性，建议不要修改它。
  7. 要将选定的 ROI 裁剪为新的图像文件，请单击最左侧的 裁剪 按钮。
    注意：此步骤是可选的。如果不需要裁剪图像，可以关闭窗口。所有 ROI 和背景 ROI 的坐标都会自动保存，并可以在以后用于分割。如果投资回报率没有更改，这些按钮将不执行任何作。裁剪选项包括 XY 方向、z 切片或特定时间范围。每个按钮都标有将要裁剪的尺寸。
  8. 保存对齐的数据
    1. 使用窗口关闭按钮关闭窗口（例如，Windows 上右上角的 X 或 macOS 或 Linux 上左上角的红点）。
    2. 按 是，保存对齐的数据 以保存对齐的数据。
    3. 单击 “是，再次保存对齐的数据” 进行确认。
  9. 如果未跳过步骤 4.7 且未修改 ROI，则保存裁剪后的数据。
    1. 选择 是，保存裁剪的数据 以保存裁剪的数据。
    2. 按 是，请裁剪 以确认保存裁剪。
    3. 单击 确定 以确认默认文件夹路径。
      注意：选择其他文件夹以保留未裁剪的数据。
    4. 选择 “是，覆盖” 以确认之前是否使用过默认路径。
    5. 按 确定 该过程完成后确认。

5. 寻找最佳的细分模型和参数

注意：Cell-ACDC 提供具有实时反馈的 GUI，以找到最佳分割参数（图 6）。通常，这些模型由第三方提供，每个模型都有自己的文档。用户有责任确定最佳分割模型及其最佳参数，用户应查看他们正在尝试的相应模型的文档以获取更多信息。

  1. 单击主窗口中的 Launch GUI...（图 1A，可视化和更正模块）。
  2. 加载示例数据。
    1. 单击新窗口工具栏中的 文件夹图标 以打开文件夹选择菜单。
    2. 选择包含数据的文件夹，然后按 选择文件夹 确认选择。
  3. 选择要可视化的通道。使用下拉菜单选择要分段的渠道 phase_contr ，然后选择 确定 进行确认。
  4. 完成数据加载。
    1. 按 确定 确认默认分割掩码名称。
    2. 单击加载 位置的 确定以确认图像属性。
    3. 选择 否 可防止加载额外的荧光数据。
  5. 在 模式选择器 （图 6，“模式选择器”）中，选择模式分割 和跟踪。
  6. 找到最佳预处理设置。
    1. 导航到 图像>预处理... 打开自定义预处理窗口（图 7A）。
    2. 在下拉菜单中选择 删除热像素（Remove Hot Pixels） 或其他所需的预处理步骤。
    3. 使用 齿轮图标 初始化和更改步骤的设置。使用 信息按钮 显示有关步骤和可用参数的信息。保持设置不变。
    4. 使用 加号图标 再添加一个步骤。
    5. 选择 重新缩放强度 并通过重复步骤 5.6.1 和 5.6.2 确认设置。
    6. 选中 预览复选框 以实时查看步骤的效果。
    7. 单击 “应用于所有帧 ”（图 7B）。
    8. 按 保存预处理的数据开始 保存过程。
    9. 按 确定 确认默认名称。
    10. 关闭“ 预处理配方 ”窗口。
  7. 找到最佳细分设置。
    1. 选择顶部功能区中的 Segment > Segment 显示框 ，然后选择 YeaZ_v2 （图 8A）。
    2. 如果出现提示，请按 确定 下载 YeaZ_v2 。
      注意：下载可能需要几分钟时间。进度显示在控制台窗口中。下载过程中不要关闭 GUI，即使没有响应。
    3. 保持默认参数不变。
      注意：大多数参数都有 提供 详细指导的信息按钮。
    4. 通过检查 后处理分割参数 来启用后处理（图 8B）。
    5. 单击确定 接受参数。
      注意：分割可能需要一些时间，具体取决于模型复杂性、图像大小和计算机规格。特别是，Cellpose 版本 4 可能非常慢。
    6. 如果询问是否要激活自动细分，请选择 否。
    7. 验证分段是否有效。
    8. 重复步骤 5.7.1 以重新打开分割参数。
    9. 如果分割结果符合预期，请按 将所有参数保存到配方文件。否则，更改分割参数并重复步骤 5.7.4 至 5.7.8。
    10. 使用 文本输入 为分段配方命名为 test。
    11. 单击 确定 接受名称。
    12. 按 确定 完成工作流的保存。
    13. 关闭 参数选择屏幕。
  8. 关闭 GUI 窗口
    1. 关闭 GUI 窗口。
    2. 在关闭之前按 否 不保存。

6. 细分和跟踪（批处理）

  1. 单击主窗口中的启动 分割模块... （图 1A，“分割和跟踪”模块）。
    1. 选择示例数据。使用 Cell-ACDC 的文件夹选择器选择包含数据的文件夹，然后按 选择文件夹 确认选择。
  2. 选择批处理的参数。
    1. 选择渠道 phase_contr_preprocessed 作为分段的渠道。按 确定 确认选择。
      注意： 某些型号使用附加通道作为输入。稍后在设置其他分割参数时可以选择此通道。
    2. 单击确定确认图像属性。
  3. 设置分割模型设置。
    1. 选择 YeaZ_v2 作为应用于分割的模型，然后单击 确定确认选择。
    2. 单击 加载保存的配方...按钮以加载之前保存的配方。
    3. 从列表中选择 segmentation_recipe_test.ini ，然后单击 确定确认选择。
    4. 按确定关闭加载成功消息。
    5. 通过 选择确定来确认参数。
  4. 确认其他分段设置。
    1. 按 确定 接受分段文件的默认名称。
    2. 选择 否 以确认应分割整个图像。
    3. 选择 “确定” ，将定影设置为延时摄影的最后一帧。
  5. 设置跟踪设置。选择 YeaZ 作为要使用的跟踪方法，然后按确定确认选择。
  6. 运行细分和跟踪例程。
    1. 单击 立即运行 以 运行分段和跟踪管道。
      注意：根据图像大小、模型复杂性和计算机规格，这可能需要几个小时。在测试运行中，在没有 GPU 的设备上，使用 YeaZ_v2 对测试数据进行分段大约需要 2 分钟。
    2. 单击 确定 完成分段。

7. 纠正细分和跟踪错误

注意：通常，与前一帧相比，当前帧中缺失的细胞由黄色轮廓和 ID 表示。新检测到的细胞显示为红色 ID 和粗轮廓。已接受丢失的细胞以绿色轮廓和 ID 显示。

  1. 在主窗口中单击 Launch GUI...（图 1A，“可视化和更正”模块）。
  2. 加载示例数据。
    1. 单击新窗口工具栏中的 文件夹 图标。
    2. 选择包含数据的文件夹，然后按 选择文件夹 确认选择。
  3. 选择要可视化的通道。使用下拉菜单选择频道 phase_contr_preprocessed，然后选择 确定进行 确认。
  4. 选择分段掩码名称。选择 加载所选内容 以 加载在上一步中创建的分段文件。
  5. 完成数据加载过程。
    1. 通过单击加载 位置的确定来确认图像属性。
    2. 选择 否 可防止加载额外的荧光数据。
  6. 使用 模式选择器 （图 6，“模式选择器”）选择 分割和跟踪 模式。
    注意：使用 GUI 底部的复选框更改显示的注释。左右图像可以显示不同的注释。
  7. 选择实时跟踪器。在菜单栏（图 6，“菜单栏”）中，导航到 跟踪>选择实时跟踪算法 ，然后选择所需的实时跟踪器。对出芽酵母使用 Cell-ACDC 或 Cell-ACDC 2步 ，或对其他生物体使用 Cell-ACDC对称分裂 。
  8. 纠正细分和跟踪。
    1. 使用 左右箭头键 在帧之间导航。
    2. 导航到第 10 帧。
    3. 按 S 键激活手动芽分离工具。
    4. 使用 右键单击 可自动拆分单元格 1 的分割掩码。
    5. 导航到第 14 帧。
    6. 按 B 键激活画笔。
    7. 使用 鼠标左键绘制芽缺少的分割蒙版。
    8. 在纠正分割和跟踪错误的同时遍历后续帧。使用可用的工具（图 6，“编辑工具栏”）。至少在第 42 帧之前进行校正。
      注意：大多数工具都有一个工具提示来解释其功能。将鼠标悬停在工具上以显示工具提示。

8. 细胞周期注释

注意：只有在完成所有感兴趣帧的分割和跟踪校正后才进入此步骤。根据细胞分裂类型（对称，例如哺乳动物细胞，或不对称，例如出芽酵母），使用正确的注释模式。有关示例数据，请参阅“不对称分裂细胞”，步骤 8.1。步骤 8.2 描述了对称分裂细胞的一般工作流程。

  1. 不对称分裂的细胞
    注意：对于出芽酵母等生物体，芽可以分配给母亲。两个对象需要存在于同一帧中。默认情况下，显示基于出芽酵母注释的预期细胞周期阶段。芽的细胞周期阶段显示为红色，而所有其他物体的细胞周期阶段显示为白色。母亲用黄色虚线与花蕾相连。
    1. 使用模式选择器激活细胞周期分析（图 6，“模式选择器”）。
    2. 选择是，在出现提示时转到 第 1 帧 。
    3. 使用 左右箭头键 在帧之间导航。
    4. 导航到第 41 帧。单击 确定 以在出现提示时接受细胞周期注释表的初始化。
    5. 右键单击 单元格 1 或其芽以分离连接并注释细胞分裂事件。
    6. 继续，直到查看完所有相关帧。使用可用工具纠正自动母芽分配中的错误（图 6，“编辑工具栏”）。
    7. 可用工具
      注意： 除“ 断开/重新绑定母芽关联 ”工具外，这些工具可以使用可自定义的快捷方式或按工具栏中的相关按钮来激活。
      1. 将芽分配给母 （A）：激活 “将芽分配给母” 工具。按住耳机上的 鼠标右键 。拖动到相应的母单元格并松开鼠标按钮。
        注意： 当将芽自动分配给母亲不正确时，请使用此工具。
      2. 注释未知历史记录 （U）：激活注释 未知历史记录工具 。使用 鼠标右键 单击应注释为具有未知历史记录的单元格。
        注意：使用此工具手动注释具有未知历史的细胞，有助于纠正自动推理不足的谱系歧义。
      3. 重新初始化细胞周期注释
        注意：使用此选项从当前帧开始重新运行细胞周期注释算法。这确保了与最近对分段/跟踪数据所做的更正或更新的一致性。
      4. 断开/重新绑定母芽关联：确保没有选择其他工具。右键单击现有的母芽对以断开关联，或再次右键单击以重新建立连接。
  2. 对称分裂细胞
    注意：此功能正在进行 Beta 测试，即将正式发布。可以将两个或多个子细胞分配给单个母细胞。潜在的母细胞是那些存在于前一帧中但当前帧中不存在的细胞，而潜在的子细胞是当前帧中新出现的细胞。
    1. 使用模式选择器激活 Normal division： Lineage tree （图 6，“模式选择器”）。
    2. 选择是，在出现提示时转到 第 1 帧 。
    3. 使用 左右箭头键 在帧之间导航。
    4. 使用可用工具纠正自动母子分配中的错误（图 6，“编辑工具栏”）。
    5. 在出现提示时通过单击“ 传播”来传播更改。
    6. 可用工具
      注意：可以使用快捷方式或工具栏中的相应按钮激活这些工具。
      1. 查找新细胞 ID 的母亲 （F）：激活“ 查找新细胞 ID 的母亲 ”工具。右键单击新细胞以循环浏览候选母细胞。 Shift + 右键单击 可向后循环浏览候选对象。
        注意：使用此工具分配或修改子细胞的母细胞。
      2. 设置未知母 （U）：激活“ 设置未知母” 工具。 右键单击 其母单元未知的单元格。
        注意：使用此工具手动将细胞的母体指定为未知。

9. 保存数据

  1. 导航到顶部功能区中的文件>保存。
  2. 单击 设置测量值...以选择所需的测量值。
  3. 选中 mCitrine 指标或任何其他所需测量值旁边的复选框。
  4. 单击 确定 进行确认。
  5. 单击 是 保存测量值。
  6. 单击 确定 以确认应保存测量值的帧。
  7. 当出现有关数据串联的提示时，单击 “否 ”。

10. 创建数据结构

注意：本节讨论准备用于分割和跟踪的显微镜数据。使用演示数据时，可以跳过此设置，该演示数据在“下载示例数据”中下载。将生成的数据结构如 图 9 所示。

  1. 将显微镜文件放入空文件夹中。
    注意：支持显微镜格式，例如 .czi （蔡司）、.lif （徕卡） 和 .nd2 （尼康），以及单个.tif和.png文件。
  2. 单击模块 0。创建数据结构... （图 1A，“创建数据结构”模块）。
  3. 选择 BioIO 或 Fiji Macro。
    1. 如果使用 Windows ，请单击“ 使用 BioIO”，而对于 MacOS 和 Linux 用户，请选择“ 使用斐济宏”。
      注意：在下文中，假设使用 Windows。
    2. 如果提示安装 BioIO，请按 确定进行 安装。
    3. 选择显微镜文件排列。使用下拉菜单选择与显微镜文件排列相匹配的选项，然后按 确定进行 确认。
  4. 选择源文件夹和目标文件夹以及数据加载策略
    1. 按 完成确认 文件位于空文件夹中。
    2. 使用 Cell-ACDC 的文件夹选择器选择包含文件的文件夹。
    3. 按 选择文件夹 选择文件夹。
    4. 再次按 选择文件夹 以选择与目标文件夹相同的文件夹。
      注意：原始显微镜文件不会被删除。
    5. 选择 是，一次加载整个位置。
  5. 如果提示安装 BioIO 子包，请按 确定 进行安装。
  6. 设置输入文件的元数据。
    1. 更正元数据。
      注意：通过单击通道名称字段旁边的小眼睛图标仔细检查“尺寸顺序”。无法从原始文件加载的其他元数据将突出显示。
    2. 按 确定 确认元数据。
    3. 按 是 确认尺寸顺序。
  7. 等待该过程完成。
  8. 该过程完成后按 是 关闭窗口。
    注意：创建数据结构可能需要数小时，具体取决于数据大小。

11. 数据预处理实用程序

注意：主窗口中有几个用于在继续分析之前处理图像的选项。要访问这些工具，请转到主窗口菜单栏中的实用 程序 下拉菜单（图 1B，“实用程序”），将鼠标悬停在 图像预处理上，然后选择应使用的选项。两个例子是：

  1. 合并通道：使用此选项可合并两个或多个图像通道。
    注意：例如，可以对两个荧光通道进行平均。
  2. 调整图像大小：使用此选项可减小非常大的图像数据集的大小。
    注意：这可以显着加快处理时间，并且在许多情况下，对分割质量影响很小或没有影响。

12. 故障排除

  1. 如果 Cell-ACDC 崩溃，请导航到 Issues（问题）选项卡并单击绿色的 New issue 按钮，在 Cell-ACDC GitHub 页面上创建 bug 报告。按照提供的模板包含诊断和解决问题所需的所有相关详细信息。或者，请随时使用 #cell-acdc 标签在 image.sc 论坛中寻求帮助或联系通讯作者之一。在许多情况下，尤其是在安装软件包后，只需重新启动软件即可解决问题。
  2. 如果 Cell-ACDC 冻结或无响应，请检查控制台以获取进度更新。长时间的分割时间，尤其是在使用计算密集型模型（例如 Cellpose 版本 4）或处理大型数据集时，是正常的。如果 Cell-ACDC 仍然无响应，请参阅步骤 12.1 以获取进一步说明。
  3. 如果自动分割错误地包含背景，请检查预处理步骤是否过度平滑背景。许多分割模型都是在原始（未预处理）图像上训练的，当背景缺乏足够的纹理时，性能可能会很差。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D 肿瘤球体的核体积量化

自动 3D 显微镜 （z-stacks） 使科学家能够可视化复杂的多细胞系统，例如类器官。为了在单细胞水平上量化形态学和荧光信号特性，通常需要进行 3D 细胞分割。以下示例演示了 Cell-ACDC 如何分割包含来自核染色通道的数千个细胞的类器官中的细胞核并量化其体积（数据来自参考文献 9）。使用在参考文献 9 中训练和发布的自定义 Cellpose 模型进行分割。通过在选择 Cellpose v2 的模型参数时在 GUI 中提供权重文件路径，可以直接在 Cell-ACDC 中使用训练好的 Cellpose 模型。使用Cell-ACDC的第二个模块进行分割，以批量处理所有图像（图1A，“分割和跟踪”模块）。接下来，在第三个模块 GUI 中可视化结果（图 1A，“可视化和更正”模块）。该模块经过优化，可可视化具有多个注释选项（例如，轮廓、叠加分割掩码或文本 ID）的数千个单个对象。计算 3D 掩模的测量值后，所有可用的测量值都直接记录在 GUI 中。可以通过转到顶部菜单栏（图 6，“菜单栏”），选择 “测量” 菜单，然后选择“ 设置测量...”来访问它们。弹出对话框允许用户从信息按钮获取特定于测量的信息，并选择要保存的测量值。对于 图 10 中的代表性结果，使用了“cell_vol_fl_3D”，即通过将对象中的总体素乘以像素大小的平方和体素深度计算得出的每个对象的体积。这些属性要么从显微镜原始文件中自动提取，要么由用户提供。从此 GUI 计算测量值需要加载原始图像。因此，为了简化流程并启用批处理，还可以从“ 实用程序” 菜单（图 1B，“实用程序”）中计算测量值，方法是转到子菜单 “测量值 ”，然后转到 “计算一个或多个实验的测量值”。最后，将核体积分布绘制为代表性结果（图10）。该分析揭示了很大一部分小核，这可能是由于分割伪影造成的。通过从分割掩模中过滤掉小物体，可以轻松去除它们。同时，非常大的原子核可能是由于分割过程中合并的原子核造成的。始终建议绘制物体（例如单个细胞）的体积分布，以识别伪影并提取有关细胞大小的其他生物学信息。

延时显微镜数据的量化

使用延时显微镜，可以在单细胞水平上直接观察细胞动力学。除了细胞分割之外，提取时间动力学还需要额外的分析，包括细胞跟踪和细胞谱系注释。由于这些分析阶段的相互依赖性，管道早期引入的错误可能会传播到后续步骤。因此，需要对分割、跟踪和注释错误进行持续的可视化和纠正。下面表明 Cell-ACDC 适用于处理这些任务。选择了两种不同模式生物的两个数据集：1）出芽酵母（来自参考文献35的菌株DCY001-1，其中两种组蛋白H2B蛋白Htb1和Htb2用mCitrine标记），以及2）小鼠胚胎干细胞（mESC，数据来自参考文献22）。

这两个数据集突出显示了 Cell-ACDC 中可用的两种注释模式：不对称和对称（即对称胞质分裂或“正常”）细胞分裂。由于分裂模式不同，这两种生物体需要不同的跟踪和注释框架。

在不对称分裂中，母细胞形成一个芽，该芽生长并最终分离成为子细胞。分裂后，母细胞保留其原始细胞ID，其代数增加1，而子细胞被分配一个新的细胞ID，其代号设置为1。出芽期对应于细胞周期的 S/G2/M 期，并在 Cell-ACDC 中被注释。这些注释选择有助于解决与出芽酵母细胞周期相关的典型生物学问题。

在“对称”分裂（例如哺乳动物细胞）的情况下，母细胞分裂成两个子细胞。母细胞，即其 ID，在分裂时消失，两个子细胞获得新的 ID。此外，子细胞的代数相对于母细胞增加了一个。Cell-ACDC 还跟踪父 ID、根 ID（谱系开头的原始祖先细胞）和姐妹 ID。

对于这两种注释模式，都开发了一个创新框架来纠正注释错误，其中纠正会自动传播到所有过去和未来的相关时间点。可视化、注释和校正在第三个模块 GUI 中执行（图 1A，“可视化和更正”模块和 图 6）。为了分割和跟踪数据集 1 中的细胞，将模型 YeaZ_v226 应用于相差通道，而对于核（组蛋白）通道，则使用 StarDist25 模型。然后，使用实用程序 跟踪和谱系>跟踪和/或计数亚细胞对象 （图1B， 实用程序菜单 栏），Cell-ACDC为每个细胞核分配其相应细胞的细胞ID，确保从细胞和细胞核掩码生成的表之间的一致性。

对于数据集 2，使用 了 DeepSea22 分割模型。这三种模型都已在 Cell-ACDC 中可用，展示了将多个分割模型集成到软件中的优势。

纠正分割和跟踪错误后，对细胞谱系进行注释，计算数值特征，并进行下游分析。对于数据集1，列TaYFP_amount_autoBkgr和分割的细胞核数量（图11A）随时间绘制。“TaYFP”是核通道的名称。“amount_autoBkgr”是从落射荧光图像36中提取的总细胞蛋白质量的代理。它的计算方法是每个细胞掩模中的平均荧光强度与背景中位数之间的差值乘以细胞面积（以像素为单位）。在这里，背景中位数是根据所有未分割为单元格的像素计算的。正如预期的那样，H2B量在芽出苗时开始增加（图11A-ii），并在核分裂前达到恒定值（图11A-iii）。这是组蛋白稳态的重要质量控制，因为组蛋白的量预计取决于细胞周期。此外，绘制随时间变化的细胞核数量证实，组蛋白量大约在核分裂前后达到最大值。

对于数据集 2，绘制了正在进行细胞分裂的选定细胞随时间变化的细胞面积。正如预期的那样，细胞面积增加，直到达到最大值（图11B-i）。然后，随着细胞收缩，它减少直到细胞分裂（图11B-ii）。最后，两个子细胞的循环重新开始。这是另一项推荐的分析，因为检查细胞周期中的细胞大小变化对于确认细胞是否按预期生长和分裂（或在特定突变体的情况下不正常）至关重要。

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图 1：Cell-ACDC 模块。 （A） 可从主Cell-ACDC发射器发射的4个主要模块概述。在对显微镜数据进行分割、跟踪和注释后，可以从第三个模块（“可视化和校正”）或 （B） 顶部菜单栏上的 实用程序 菜单计算数值特征。“实用程序”是无需用户输入即可在多个数据集上自动运行的例程。除了计算测量值外，其他实用程序还包括将多个输出表串联到一个表中、跟踪亚蜂窝对象和图像预处理。Cell-ACDC 支持 2D、3D（z 堆栈或延时）和 4D 数据（随时间变化的 z 堆栈），以及任意数量的附加通道。然后，带有数值特征的输出表可用于下游分析和生物发现（图 10 和 图 11）。为此，Cell-ACDC GitHub 页面上的 Jupyter 笔记本可用，其中包括可以从输出表中获取的绘图示例。 请点击此处查看此图的大图。

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图 2：Cell-ACDC 决策流程图。 一个流程图，概述了要使用的模块，具体取决于数据集类型和分析要求。 请点击此处查看此图的大图。

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图 3：下载示例数据。 （a） 开放欢迎指南。（B） 下载复制协议所需的示例数据。 请点击此处查看此图的大图。

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图 4：加载数据以进行数据准备。 （A） 将数据加载到数据准备 GUI 中。（B） 选择要加载的频道。（C） 编辑并确认图像元数据。 请点击此处查看此图的大图。

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图 5：运行数据准备过程。 （A） 开始流程。（B） 位置投资回报率（用于裁剪）和背景投资回报率。请点击此处查看此图的大图。

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图 6：用于可视化和校正结果的第三个模块 GUI。 第三个模块 GUI（ 图 1A 中的“可视化和校正”）的屏幕截图，其中突出显示了项目。请注意，工具栏上的大多数按钮都有一个工具提示（通过将鼠标光标悬停在按钮上来访问），说明如何使用该特定功能。模式选择器可用于在 5 种模式之间切换：“查看器”、“分割和跟踪”、“细胞周期分析”（用于不对称分裂的细胞）、“正常分裂：谱系树”（用于对称分裂的细胞，例如哺乳动物细胞）和“自定义注释”。请注意，工具栏或菜单栏通常存在于其他 GUI 中（例如，“数据预处理”模块， 图 1）。 编辑工具栏 包含可用于编辑和纠正分割和跟踪错误的所有功能（例如，画笔、橡皮擦、编辑 ID 等）。加载的图像显示在两面板视图中，这在需要不同的注释选项时很有帮助（例如，左侧图像上的细胞周期信息和右侧图像上的 ID）。也可以关闭右侧图像（右键单击图像并取消选择 显示镜像图像）。每个图像面板的侧面都有一个 LUT 滑块，用于快速调整强度级别。通过右键单击 LUT 控件，用户可以为强度图像选择不同的颜色贴图。此外，在右侧，还有一个LUT选择器，用于将分割标签的颜色叠加在强度图像上（注释选项称为 Segm.masks）。在左侧图像注释选项的左侧，有额外的切换来控制一些设置，例如自动保存、字体大小等。 请点击此处查看此图的大图。

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图 7：在主 GUI 中可视化预处理。 （A） 打开预处理对话框。（B） 与协议中使用的参数的预处理对话已初始化。 请点击此处查看此图的大图。

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图 8：在主 GUI 中可视化分割输出。 （A） 选择分割模型。（B）设置分割参数。 请点击此处查看此图的大图。

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图 9：Cell-ACDC 所需的文件夹结构。 要使用 Cell-ACDC，数据必须排列在特定的文件夹结构中。虽然 Cell-ACDC 提供了一个模块来自动生成此结构，但了解该结构应该是什么样子很重要。首先，所有文件必须位于名为 Images 的文件夹中。接下来，它们都需要以相同的名称开头，即所谓的“basename_”。所需的最小文件集是单通道 TIFF 文件（2D、3D z 堆栈或 3D+时间）和以“_metadata.csv”结尾的 CSV 文件。此文件必须是具有两列的表，第一列称为 Description ，第二列称为 values，并且它应至少包含 SizeT 的条目，以及 SizeZ 的帧数和 z 切片数。如果图像文件没有 z 切片，则 必须将 SizeZ 设置为 1。对于没有延时图像也是如此，其中 SizeT 必须为 1。作为 CSV 文件，条目是单行 Description，value，用逗号分隔，例如 SizeZ，1。对于多个通道，每个通道必须生成一个 TIFF 文件。然后，必须将 文件夹 Images 放在一个名为“Position_1”的文件夹中。允许多个职位，并且需要用连续的数字命名。将数据加载到任何 Cell-ACDC 模块中时，用户可以选择特定的 Position 文件夹或整个实验文件夹。 请点击此处查看此图的大图。

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图10：肿瘤类器官的3D定量。 加载到 Cell-ACDC 的第三个模块 GUI 中的代表性肿瘤类器官（来自 9 的数据）的屏幕截图（左），带有红色轮廓突出显示分割掩码的 z 切片示例（中），以及从 3D 分割掩码计算的细胞体积分布直方图（右）。 请点击此处查看此图的大图。

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图 11：延时显微镜数据的量化。 （A）加载到Cell-ACDC第三个模块GUI中的出芽酵母细胞的延时显微镜数据的屏幕截图（左），以及代表性细胞周期中组蛋白H2B蛋白量随时间的定量（右）。缩放后的图像显示了细胞周期开始时（i），芽出（ii）和核分裂（iii）时的示例细胞及其芽（白色箭头）。数据取自Chatzitheodoridou等人35（B）加载到Cell-ACDC的第三个模块GUI（左）中的小鼠胚胎干细胞的延时显微镜数据的屏幕截图和细胞面积（μm2）绘制为经历细胞分裂的代表性细胞的时间函数。缩放的图像显示了示例细胞及其子细胞在分裂前的最大细胞面积（i），分裂成两个子细胞（ii）以及分裂后最后分析的帧（iii）。数据取自 Zargari 等人 22,33。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

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多维显微镜数据的分析通常需要使用尖端的人工智能驱动模型。然而，这些工具开发迅速，并且具有很大的采用门槛。此外，生物学家经常需要可视化结果以进行有效的纠错。在这里，展示了科学家如何使用 Cell-ACDC 来应对这些挑战。

所提出协议的一个关键步骤是选择最佳分割模型。Cell-ACDC 包括一个支持视觉选择的 GUI（图 1A，“可视化和校正”模块）。还提供了用于准备数据和批处理多个数据集的工具（图 1A，创建数据结构、数据预处理、分割和跟踪模块以及实用程序）。鼓励用户在 image.sc 论坛上报告问题并提供反馈（使用标签 #cell-acdc）或在 Cell-ACDC GitHub 页面上打开问题。

虽然 Cell-ACDC 已经用于相对较大的数据，例如具有数千个细胞核9 的图像中的球体，或每帧具有数百个细胞的出芽酵母的延时数据，但程序必须将整个单通道数据加载到 RAM 中才能正常运行。建议将可用内存中的图像文件大小大约为三倍，以确保稳定的性能。目前，超出可用系统内存的数据集无法处理，但计划通过集成 OME-Zarr37 来支持核心外（延迟）加载。

目前，Cell-ACDC 的主要局限性之一是对 3D+时间数据集的部分支持，因为大多数工具都是为 3D z 堆栈或 2D+时间数据开发的。因此，Cell-ACDC 的未来版本将扩展其功能，完全支持 3D+时间数据。此外，我们正在努力扩展“对称”分裂细胞（例如哺乳动物细胞）的细胞谱系注释框架，这些细胞是母细胞分裂成两个子细胞的细胞（与出芽酵母相反，其中母细胞每个细胞周期一次，通过出芽产生单个子细胞）。最后，截至目前，Cell-ACDC 仅限于单通道数据完全适合 RAM 的数据。因此，我们计划如上所述实现延迟加载。

自发布以来，Cell-ACDC 不断改进，例如，通过添加新的分割和跟踪模型、新的注释框架（例如，用于哺乳动物细胞，目前正在进行 Beta 测试）以及各种性能改进。由于这些发展，科学家们可以利用 Cell-ACDC 来加速研究并实现科学发现 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ，49.与现有方法相比，该软件框架的独特之处在于它能够利用和补充现有模型，从而受益于社区的发展。Cell-ACDC 的持续发展正在积极维护，以将其建立为分析多维显微镜数据的参考框架。

Disclosures

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提交人声明他们没有利益冲突。

Acknowledgements

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我们感谢Mario Vitacolonna和Rudolf Rüdiger分享图10中的球体数据，以及功能表观遗传学研究所的同事Pascal Falter-Braun和Carsten Marr的宝贵讨论。特别感谢几位用户提供了宝贵的反馈、测试了新功能并耐心报告了问题。这项工作由德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）通过项目416098229、亥姆霍兹协会和慕尼黑数据科学联合研究学校资助。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
婴儿朱利安·皮奇10.7554/eLife.79812可选配置的分割和跟踪软件可自动安装在Cell-ACDC中
贝叶斯追踪器克里斯蒂娜·乌利克纳10.3389/fcomp.2021.734559跟踪软件可选安装，可随Cell-ACDC自动安装
细胞-控制控制弗朗切斯科·帕多瓦尼10.1186/s12915-022-01372-6软件
细胞胚系细胞核克里斯蒂娜·皮蒂尔德;埃罗·洛库特;pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana “Equationavka10.17912/MICROPUB。生物学.001062可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
细胞态版本2卡森·斯特林格10.1038/s41592-020-01018-x可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
细胞态3版本卡森·斯特林格10.1038/s41592-025-02595-5可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
细胞态版本4（细胞态-SAM）Marius 帕奇塔留10.1101/2025.04.28.651001可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
计算机--请参见下方推荐规格
计算机 - CPU任何-推荐至少4个核心，2.5GHz 
计算机 - GPUNvidia（首选） -（可选）推荐最低8GB显存
计算机 - 硬盘空间任何-4GB + 3 x 显微镜文件大小
计算机 -作系统Microsoft、Apple等-支持Windows、MacOS和Linux系统
计算机 - 内存任何-3 x 单位置文件大小，最小 16GB
深海Abolfazl 扎尔加里10.1016/j.crmeth.2023.100500可选配置的分割和跟踪软件可自动安装在Cell-ACDC中
DeLTA 让-巴蒂斯特·吕加涅 / 欧文·M·奥康纳10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797可选配置的分割和跟踪软件可自动安装在Cell-ACDC中
InstanSeg蒂博·戈尔兹伯勒10.48550/arXiv.2408.15954可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
迷你锻炉康达锻造厂-从Miniforge官网下载安装包的链接：https://conda-forge.org/download/
全能凯文·卡特勒10.1038/s41592-022-01639-4可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
pomBseen大平诚10.1371/journal.pone.0291391可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
SAM（分段任意模型）亚历山大·基里洛夫10.48550/arXiv.2304.02643可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
星际广播乌韦·施密特 / 马丁·魏格特10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
貘卡尔·多尔施10.48550/arXiv.2306.08637跟踪软件可选安装，可随Cell-ACDC自动安装
Trackastra（赛车赛）本杰明·加卢瑟https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570跟踪软件可选安装，可随Cell-ACDC自动安装
Trackpy丹尼尔·艾伦10.5281/zenodo.1213240跟踪软件可选安装，可随Cell-ACDC自动安装
酵母伴侣大卫·邦克10.1093/生物信息学/btac107可选的分段软件可随Cell-ACDC自动安装
耶亚兹尼古拉·迪特勒10.1038/s41467-020-19557-4可选配置的分割和跟踪软件可自动安装在Cell-ACDC中

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