我们介绍了利用表面组织粘合剂固定样品，对Drosophila幼虫嗅觉神经元进行钙成像的实验方案。该方法提高了实验稳定性，有助于开展可靠的活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）实验。通过定制的R语言脚本分析钙信号，为深入的神经生理学研究提供了高效平台。
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方法文章
体内与离体条件下对三龄Drosophila melanogaster幼虫嗅觉环路神经元的钙成像
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
钙成像对于研究神经动态和脑功能至关重要。然而，目前用于钙成像的方法在 果蝇 由于运动伪影和对专用设备的需求，幼虫的成像具有挑战性。本文介绍一种实用且低成本的方法，可用于同时进行 体内 和 离体 三龄幼虫中的钙成像 果蝇 幼虫，使用局部组织粘合剂固定样本。我们还提供了自定义的R脚本和数据分析框架，便于在不同实验条件下测量钙信号变化。利用该方法，我们成功记录了一对幼虫中枢神经系统神经元中的钙瞬变，运动伪影极小，并在多个样本间验证了结果的可重复性。该方法适用于标准的转盘共聚焦系统，也可适配于自制或商用的双光子显微成像系统，使资源不同的实验室均能开展相关研究。该技术有望提升幼虫钙成像研究的可及性，并可进一步拓展用于研究外部刺激（如气味）和内部刺激（如神经调质）对神经活动的影响。
引言
理解神经元中的钙离子动态对于揭示神经信号传导和大脑功能的复杂机制至关重要，因为钙离子在调节神经元活动以及驱动细胞对刺激的反应中发挥着关键作用。神经元钙离子动态可通过钙成像技术进行监测，该技术可实时提供跨多种生物体的钙介导信号传导信息，包括 果蝇 幼虫。该 果蝇 幼虫正成为研究行为背后神经环路功能的有力模型系统。它是目前已获得全脑突触分辨率连接组的三种生物之一。1幼虫适用于多种复杂工具，可在全脑和单神经元水平上实现神经元的成像与操控2,3.
测量钙离子动态变化的能力 果蝇 通过钙成像技术研究幼虫神经元对推动神经科学研究至关重要4近年来，钙成像技术的进步使得能够在幼虫的单个突触水平上测量钙动力学5 自由移动幼虫中的多神经元记录6钙成像可以进行 体内，其中在完整幼虫的自然生理环境下捕捉钙信号事件4,7,8,9，或 离体在模拟生理条件下保存的离体幼虫组织中记录钙信号事件10总体而言，研究人员已采用钙成像方法的多种改进版本 果蝇 幼虫以揭示神经回路、感觉、学习与记忆以及行为的基本机制8,11,12,13,14,15,16,17然而，由于需要专用设备以及因运动伪影导致的数据解释困难，幼虫钙成像研究受到限制。
在此，我们介绍一种经济高效且易于实施的方法，适用于两者 体内 和 离体 三龄幼虫中的钙成像 黑腹果蝇 幼虫。我们对 Keystone-LN（一种抑制性嗅觉环路神经元）中的钙动力学进行成像18,19在完整幼虫样本中展示 体内 钙成像，并在解剖的幼虫大脑中展示 离体 钙成像。在我们的成像条件下，完整的幼虫和解剖获得的脑组织可保持约10-15分钟的活性和反应能力，从而允许对每个样本进行多次刺激试验。为解决在维持组织活性并减少实验变异的同时固定完整幼虫或组织样本的难题，我们优化了GLUture的使用，这是一种生物相容性的氰基丙烯酸酯类外用组织粘合剂。
与传统的幼虫固定方法（如琼脂糖包埋或针固定）相比，这种基于黏附的方法在保持组织活性的同时减少了运动伪影20,21；相对于双光子成像系统，转盘式成像装置降低了仪器成本，提高了资源有限实验室的可及性。最后，我们介绍了简单的成像方法，并结合自主开发的R语言脚本进行数据分析。该方法可能提高幼虫钙成像研究的可及性，并可适用于研究外部刺激（如气味）和内部刺激（如神经调节物质）的影响。
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方案
1. 准备用于钙成像的三龄 Drosophila 幼虫
- 在25 °C、相对湿度50-60%（RH）、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，将果蝇饲养于标准果蝇培养基上（参见材料表）。
- 为了在目标神经元（“X”）中表达红色荧光蛋白（RFP）以识别神经元以及表达GCaMP6f（钙离子指示剂），将X-Gal4品系的处女雌蝇与携带UAS-GCaMP6f和UAS-tdTomato22的雄蝇进行杂交。
注意：本研究中使用Keystone-Gal4品系，在幼虫脑中的一对抑制性局部神经元（Keystone-LNs）中驱动tdTomato和GCaMP6f的表达18,19。 - 让雌雄果蝇交配并产卵48小时后，将成虫转移至新的培养瓶中。
- 通过将三龄幼虫（约在产卵后120小时）漂浮于15%蔗糖溶液中进行提取。使用P1000移液器将漂浮的幼虫转移至1,000 mL玻璃烧杯中。
- 每次用800 mL新鲜蒸馏水替换烧杯中的水，重复清洗幼虫3–4次。在继续后续实验步骤前，让幼虫静置10分钟。
2. 三龄 Drosophila 幼虫饥饿处理方案（如需测试饥饿与非饥饿条件）
- 通过在6 cm培养皿中放置一小块实验室擦拭纸，制备两个饲喂室。在非饥饿条件下，加入350 µL的0.2 M蔗糖溶液；在饥饿条件下，加入350 µL的蒸馏水。
- 将等量的洗涤后幼虫转移至每个饲喂室中。在室温下，让幼虫分别摄食蔗糖（非饥饿条件）或蒸馏水（饥饿条件）2小时。
3. 体内 钙成像
注意：所有涉及组织粘合剂的实验均应遵循标准的实验室安全规范进行。必须佩戴个人防护装备（PPE），包括丁腈手套、实验服以及护目镜或面罩；应避免使用棉质手套，因其可能与氰基丙烯酸酯发生放热反应。避免粘合剂接触皮肤、眼睛或黏膜。若发生皮肤粘连，应将受影响区域浸泡于温肥皂水中，然后轻柔分离；若眼睛接触，应使用微温水冲洗至少5分钟，并立即寻求医疗救助。粘合剂应远离明火和高温环境，因为固化后的粘合剂燃烧时可能释放刺激性烟雾。不使用时，应将粘合剂存放在密封容器中，置于不超过30 °C、避湿且避免阳光直射的环境中。
- 配制钙成像缓冲液，其成分为：NaCl 110 mM、KCl 5.4 mM、CaCl2 1.2 mM、MgCl2 0.8 mM、D-葡萄糖 10 mM 和 HEPES 10 mM。不使用时置于 4 °C 保存。
注意：含有 110 mM NaCl 的改良型生理盐水是幼虫中枢神经系统解剖和成像中广泛采用的配方，其浓度处于电生理学和成像研究常用的典型范围（≈108–128 mM NaCl）内23,24,25,26。 - 在 24 × 50 mm（厚度 1.5 mm）的显微镜盖玻片上，使用注射器挤出的凡士林围绕形成一个凹室。
- 在盖玻片中央滴加少量表面组织粘合剂（60% 2-辛基氰基丙烯酸酯和 40% 正丁基氰基丙烯酸酯）。用玻璃棒将粘合剂均匀涂抹成一层薄而均匀的膜。
- 用毛刷或细金属丝小心地将单个幼虫转移至粘合剂上。轻轻按压幼虫腹侧，使其与粘合剂充分接触。待粘合剂干燥，确保幼虫完全固定。
- 幼虫固定后，将盖玻片放置于倒置显微镜载物台上（图 1A）。
4. 离体 钙成像
- 配制幼虫解剖缓冲液，其成分为：NaCl 110 mM、KCl 5.4 mM、CaCl2 0.3 mM、MgCl2 0.8 mM、D-葡萄糖 10 mM 和 HEPES 10 mM。不使用时，于 4 °C 保存。
- 按照 Ishimoto 和 Sano10 所述方法进行脑组织解剖。简而言之，使用毛刷或细金属丝将一只幼虫转移至底部涂有硅胶弹性体的 3.5 cm 培养皿中。
- 在解剖显微镜下，将幼虫腹面朝上放置，并定位脑组织。使用解剖剪在幼虫前端约三分之一处做一切口，再在口钩处做另一切口。在去除身体组织和口钩的同时保留脑组织（改编自 Janelia Flylight 实验方案27）。
- 从腹神经索中识别出含有运动神经元的神经簇。使用镊子轻轻将脑组织从其余解剖后的幼虫组织中拉出，并修剪脑组织周围的多余组织。
注意：操作应轻柔，过度用力可能导致组织损伤，因脑组织较为脆弱。 - 按照步骤 3.2 至 3.3 所述方法，准备用于钙成像的显微镜盖玻片，并涂布组织粘附剂。
- 使用 P10 微量移液器，从培养皿中小心吸取 5 µL 解剖液及解剖好的脑组织。缓慢将脑组织排出至粘附剂表面。在粘附剂干燥前，将脑组织调整为背面向上的位置（两个脑叶朝下，背侧的腹神经索朝上）。
- 使用 P200 微量移液器，向盖玻片上的固定幼虫脑组织上加入 100 µL 钙成像缓冲液。
- 将带有脑组织的盖玻片置于倒置显微镜上，显微镜连接旋转盘共聚焦扫描模块和 CCD 相机，用于钙成像（图 1B）。
注意：对于离体（ex-vivo）样本，务必在胶水未干时正确调整脑组织方向。为获得最佳成像质量，应使感兴趣区域（ROI）尽可能靠近显微镜物镜，并避免在 ROI 附近使用过多胶水。
5. 成像方案
- 打开共聚焦显微镜的钙成像软件。使用10x/1.4 NA物镜进行成像，通过在GFP激光（激发波长488 nm，强度70%，发射波长525 nm/50 m，OD8）和RFP激光（激发波长561 nm，强度50%，发射波长610 nm/75 m，OD8）之间切换滤光片来采集图像。设置曝光时间在100 ms至1,000 ms之间，增益为对应曝光值的50%，并在图像采集过程中使用2的像素合并因子。
- 将显微镜调整至10倍放大倍数，并在明场照明下定位脑组织。
- 使用RFP激光（激发波长设为561 nm）搜索tdTomato信号以识别目标神经元。
注意：选择饱和度并降低伽马值，以设定正确的曝光值。 - 确定感兴趣区域（ROI）后，切换至GFP激光（激发波长设为488 nm）以采集GCaMP6f信号。在采集双通道图像堆栈前，确保tdTomato和GCaMP信号共定位。
注意：调整tdTomato和GCaMP6f图像堆栈记录的成像参数，以最大化荧光信号。 - 同时以0.5帧/秒的速度连续采集两组独立的时间序列图像（每组持续2分钟），分别记录tdTomato和GCaMP6f信号。
注意：在此缓冲条件下，解剖后的幼虫脑组织可维持活性约10分钟；超过此时间后，信号将逐渐退化。 - 当样本准备就绪后，同时以0.5帧/秒的速度连续采集两组独立的时间序列图像（每组持续2分钟），分别记录tdTomato和GCaMP6f信号。
注意：在此缓冲条件下，解剖后的幼虫脑组织可维持活性约10分钟；超过此时间后，信号将逐渐退化。
注意：在进行定量分析时，建议根据需要适当提高激光功率并调整探测器的曝光增益，同时保持信号强度的线性比例关系。
6. 数据处理与分析
- 在 ImageJ（NIH）中打开并导入 tdTomato 和 GCaMP6f 信号图像栈28。
- 为确定正确的感兴趣区域（ROI），合并 tdTomato 和 GCaMP6f 信号以确认共定位。验证后，将 tdTomato 和 GCaMP6f 通道分离。
- 在顶部菜单中，选择 Plugins | New，然后点击 Macros 以启动新宏。接着，将自定义 ROI 宏导入 ImageJ。选择 GCaMP6f 图像栈，点击运行以进行钙信号分析。
- 使用自定义 ImageJ 宏处理荧光信号（https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging）。该宏首先生成最大强度投影，使用 StackReg 插件（刚性配准模式）进行运动校正29，并应用漂白校正。
- 将弹出“需要操作”提示框，要求手动选择 ROI，用户可由此手动绘制一个较宽泛的 ROI。点击 确定 继续分析。为执行运动校正，请确保矩形框覆盖所有帧中的整个 ROI，以实现准确的运动校正，同时在各帧间保持局部空间位置和 ROI 形状不变。
注意：使用 ImageJ 中的 StackReg 对记录进行配准。当平面内运动较大（累积 XY 位移 > 1 µM）或轴向 Z 漂移导致失焦时，配准变得不可靠，甚至样本完全移出成像视野。因此，对于表现出极端漂移或钙信号下降（>30%）的样本，系统将自动标记并排除在后续分析之外，以确保神经元活动测量的准确性。这些阈值与钙成像研究中常用的质控标准一致30,31,32,33。排除这些样本还可确保仅使用具有稳定且可靠的刺激相关钙瞬变的记录进行分析。 - 在分析过程中，根据像素自相关性指导，从手动定义的圆形 ROI 中提取荧光轨迹；这些 ROI 将涵盖整个关键神经元区域。
- 使用 ImageJ（v1.54p）中的自定义宏提取两种荧光团的原始荧光强度数据：GCaMP6f/GFP 和 tdTomato/RFP（https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging，参见材料表）。
- 在视野范围内应用一个 20 × 20 像素的 ROI 滑动窗口，步长为 10 像素。对于每个 ROI，宏将计算：(1) 所有帧中的强度，(2) 基线波动差异（即前 10 帧中最大与最小强度值之间的差值），以及 (3) 最大帧间强度变化（ΔF）。剔除强度波动小于 10 个单位的 ROI，仅保留最显著的 ΔF 值用于进一步分析。
- 使用以下方法对荧光轨迹进行归一化处理：
- Fmax 与 Fmin 归一化：使用以下公式计算归一化的 Δ：
其中 F 为每个时间点的原始荧光强度，Fmin 为最小荧光强度（基线），Fmax 为记录期间的最大荧光强度。 - ΔF/F0 归一化：此外，进行 ΔF/Fo 归一化，其中 Fo（基线）由每次记录的前 10 帧确定，使用以下公式：
其中 Ft 为时间 t 时的荧光强度，F0 为从前 10 帧计算得到的基线值。
- Fmax 与 Fmin 归一化：使用以下公式计算归一化的 Δ：
- 提取 GCaMP6f 信号后，左键单击，选择 全选、剪切，然后 粘贴 至新的 Excel 工作表中。在顶部菜单栏中，选择 数据 | 分列。将弹出“文本分列向导”窗口。在第一步中选择 分隔符号，然后点击 下一步。在第二步中，在 分隔符 下选择 制表符 和 逗号，然后点击 下一步。在第三步中，点击完成。
可选：为绘制归一化的钙信号，选中 Fnorm_FminFmax，然后选择 散点图。 - 查找生成的 .csv 文件，其中包含：(1) 原始荧光值 F，(2) ΔF/Fo，以及 (3) Fnorm（归一化荧光强度）。将最终数据集整理为四列：(1) 时间（帧数），(2) 样本条件（饥饿或喂养），(3) 重复编号（单个样本），(4) 归一化强度（Fnorm 值按 0 到 1 缩放）。
- 最后，使用自定义 R 脚本在 R 中进行数据分析与可视化（https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging，参见材料表）。
- 将自定义 R 脚本导入新的 R 项目中。运行分析前，请确保已安装并更新所需的 R 包，包括 ggplot2、dplyr 和 readr。
- 从自定义 R 脚本的第 1 行开始，连续点击 运行 以执行钙信号分析。同时确保输出结果包含热图，展示时间序列记录中前 30 帧、60 帧及全部帧的归一化钙强度，以及显示归一化强度中位数的箱形图。
- 使用 Mann-Whitney U 检验评估归一化钙强度的显著性。
7. 废物处理与去污
- 实验结束后，在流动水下清除工具和表面的明显残渣，然后用70%乙醇或10%次氯酸钠消毒，再用无菌水冲洗。操作应在已消毒的台面上进行，脱去手套后需洗手；实验室内禁止饮食。
- 将幼虫组织及受污染的一次性物品放入生物危害袋中，经高压灭菌后方可丢弃。
- 完全固化的胶粘剂废弃物可投入普通垃圾；未固化的胶粘剂及受污染的一次性物品必须收集于密封并贴有标签的危险化学品废弃物容器中。
- 所有锐器（刀片、针头、破碎玻璃）应放入防刺穿的锐器盒中。
- 易燃溶剂（乙醇、丙酮）应收集于贴有标签的易燃废弃物容器中。
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结果
为了展示我们的幼虫钙成像方法，我们已成功将其应用于两者 体内 和 离体 制备的 果蝇 幼虫（图2 和 图3，视频 1，视频 2，视频 3， 和 视频 4）。我们测量了三龄幼虫中的钙动力学 果蝇 在幼虫大脑中的一对Keystone-LN神经元内表达GCaMP6f和Td-Tomato的幼虫18,19为了展示比较测量结果，我们比较了饥饿与非饥饿幼虫中的钙动力学。
在我们的in-vivo制备中，我们从完整幼虫的Keystone-LNs中测量了钙动力学（图2C和
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讨论
本文介绍了一种对三龄Drosophila melanogaster幼虫进行活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）钙成像的方法。我们对Drosophila幼虫中一种抑制性局部神经元——Keystone-LN的钙动力学进行了成像。通过完整幼虫样本（in vivo）以及分离的幼虫脑组织样本（ex vivo），我们测定了Keystone-LN的钙动力学（图1）。
我们此前对少量幼虫中的GCaMP5、GCaMP6s和GCaMP6f进行了定性比较。在Keystone-LN实验中，我们最终选用GCaMP6f，因为它在Keystone-LN中能够提供较强的信号、快速的动力学特性，并可靠地检测到与刺激相关的钙瞬变。然而，我们注意到，对于具有不同钙动力学特性的神经元或胶质细胞，其他GCaMP变体可能更为适用30,31
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Jeffrey Harper 博士，他将其实验室的转盘共聚焦显微镜提供给我们用于这些实验。我们感谢 Jung Hwan Kim 博士惠赠果蝇品系：w; UAS-GCaMP6f/CyO, weep; UAS-tdTomato。本研究由美国国家科学基金会资助，资助编号为 2341202 和 2129234。图 1 使用 Biorender 软件绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇品系 &与维护 | |||
| Nutrifly 果蝇食物 | Genesee Scientific | 66-112 | |
| UAS-GCaMP6f，tdTomato | JH Kim博士惠赠 | ||
| w;;Keystone-Gal4（GMR27F08-GAL4） | BDSC | 49232 | |
| 饥饿处理方案试剂 | |||
| 6 cm 培养皿 | Genesee Scientific | 32-106G | |
| 蔗糖 | Millipore Sigma | S0389-500G | |
| 成像与解剖缓冲液试剂 | |||
| 氯化钙 | J.T. Baker，Avantor Sciences | JT1311-1 | CAS：1311-01，500 g |
| D-(+)-葡萄糖 | 赛默飞世尔科技 | A16828.36 | CAS：50-99-7，500 g |
| HEPES-2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸 | J.T. Baker，Avantor Sciences | JT4018-1 | CAS：4018-01，100 g |
| 氯化镁 | VWR | 97064-150 | CAS：7786-30-3，100 g |
| 氯化钾 | 赛默飞世尔科技 | J64189.36 | CAS：7447-40-7，500 g |
| 氯化钠 | EMD Milipore Sigma | EMD-SX0420-1 | CAS：7647-14-5，500 g |
| 用于解剖的工具与试剂 | |||
| 解剖缓冲液 | 文中提供的组成 | ||
| Olympus 细胞培养皿，60 × 15 mm，带透气孔 | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Sylgard 184 弹性体基液 | 电子显微镜科学公司 | 24236-10A | |
| Sylgard 184 弹性体基础固化剂 | 电子显微镜科学公司 | 24236-10B | |
| 镊子式样 5，EMS | 电子显微镜科学公司 | 78320-5 | |
| Vannas弹簧剪 - 3毫米刃口 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 成像与封片设备/试剂 | |||
| 共聚焦扫描模块 | Yokogawa | CSU-W1 | 连接至显微镜 |
| 成像缓冲液 | 文中提供的组成 | ||
| 倒置显微镜 | Leica Microsystems | DMi8 | 连接至转盘共聚焦扫描模块和CCD相机 |
| 显微镜盖玻片，24 mm × 50 mm，#1.5 厚度 | Globe Scientific Inc. | 1415-15 | |
| MWI 动物用 GLUTURE 外用粘合剂 | Fisher Scientific | NC0632797 | |
| 纯凡士林 | Walgreens | 912556 | |
| 公开可用资源链接 | |||
| BioRender | https://www.biorender.com/ | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 912556 | https://imagej.net/ij/ |
| Janelia Flylight 实验方案视频 | https://www.janelia.org/ | https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o | |
| 马修实验室 Github | https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging |
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