三龄果蝇黑腹果蝇幼虫嗅觉回路神经元的体内和离体钙成像

了解神经元中的钙动力学对于揭示神经信号传导和大脑功能背后的复杂机制至关重要，因为钙离子在调节神经元活动和驱动细胞对刺激的反应方面发挥着关键作用。神经元钙动力学可以通过钙成像进行监测，这可以实时了解包括果蝇幼虫在内的多种生物体中钙介导的信号传导。果蝇幼虫正在成为研究潜在行为的回路功能强大的模型系统。它是仅有的三种已产生完整突触分辨率脑连接组的生物体之一¹.幼虫可以使用一系列复杂的工具，这些工具能够在全脑和单神经^元水平上对神经元进行成像和作^2,3。

通过钙成像测量果蝇幼虫神经元中钙动力学的能力对于推进神经科学研究至关重要⁴。钙成像的最新进展允许在幼虫⁵ 的单个突触水平上测量钙动力学，以自由移动幼虫⁶ 的多神经元记录。钙成像可以在体内进行，其中钙事件在整个幼虫^的自然生理背景下捕获4,7,8,9，^或离体，其中钙事件记录在模拟生理条件下保存的解剖幼虫组织中¹⁰。总体而言，研究人员在果蝇幼虫中使用了钙成像方法的各种迭代，以揭示神经回路、感觉、学习和记忆以及行为的基本机制 8,11,12,13,14,15,16,17 .然而，由于需要专用设备以及运动伪影导致的数据解释问题，幼虫钙成像研究受到限制。

在这里，我们介绍了一种经济高效且易于实施的方法，用于三龄黑腹果蝇幼虫的体内和离体钙成像。我们在整个幼虫制剂中对 Keystone-LN（一种抑制性嗅觉回路神经元^18,19）中的钙动力学进行成像，以展示体内钙成像，并在解剖的幼虫大脑中展示离体钙成像。在我们的成像条件下，整个幼虫和解剖的大脑在大约 10-15 分钟内保持活力和反应，允许为每个样本获取多次刺激试验。为了应对固定整个幼虫或组织样本的挑战，同时保持组织活力并减少实验变异性，我们优化了 GLUture（一种生物相容性氰基丙烯酸酯局部组织粘合剂）的使用。

与传统的幼虫固定方法（如琼脂糖包埋或固定）相比，这种基于粘合剂的方法减少了运动伪影，同时保持了组织活力^20,21;相对于双光子成像系统，转盘设置降低了仪器成本，并提高了资源有限实验室的可及性。最后，我们描述了简单的成像方法，以及用于数据分析的定制开发的 R 脚本。我们的方法可能会增加幼虫钙成像研究的可及性，并且可以适用于检查外部刺激（例如气味）和内部刺激（例如神经调节剂）的影响。

1. 准备用于钙成像的三龄 果蝇 幼虫

1. 将标准苍蝇食物（见 材料表）上的苍蝇保持在 25 °C，相对湿度 （RH） 为 50-60%，光/暗循环为 12 小时。
2. 为了表达用于神经元鉴定的红色荧光蛋白（RFP）和在感兴趣的神经元（“X”）中表达GCaMP6f（钙指示剂），将X-Gal4系的处女雌性与携带UAS-GCaMP6f和UAS-tdTomato²²的雄性杂交。
   注意：对于这项研究，Keystone-Gal4 系用于驱动幼虫大脑中一对抑制性局部神经元 （Keystone-LN） 中 tdTomato 和 GCaMP6f 的表达^18,19。
3. 让雄性和雌性苍蝇交配并产卵 48 小时后，将成虫转移到新鲜的小瓶中。
4. 将三龄幼虫漂浮在15%蔗糖溶液上，提取三龄幼虫（产卵后约120小时）。使用 P1000 微量移液器将漂浮的幼虫转移到 1,000 mL 玻璃烧杯中。
5. 每次用 800 mL 新鲜蒸馏水代替烧杯中的水，将幼虫洗涤 3-4 次。让幼虫休息 10 分钟，然后再继续协议的其余部分。

2. 三龄 果蝇 幼虫的饥饿方案（如果测试饥饿与非饥饿条件）

1. 将一小块实验室湿巾放入 6 厘米培养皿中，准备两个进料室。对于非饥饿条件，加入 350 μL 0.2 M 蔗糖溶液;对于饥饿条件，加入 350 μL 蒸馏水。
2. 将相同数量的洗涤幼虫转移到每个饲喂室。让幼虫在室温下以蔗糖（未饥饿）或蒸馏水（饥饿）为食2小时。

3. 体内 钙成像

注意：所有涉及组织粘合剂的实验都应使用标准实验室安全实践进行。需要个人防护装备 （PPE），包括丁腈手套、实验室外套、护目镜或面罩;由于与氰基丙烯酸酯发生放热反应，应避免戴棉手套。避免粘合剂与皮肤、眼睛或粘膜接触。如果皮肤粘连，请将该区域浸泡在温肥皂水中并轻轻分离;如果眼睛暴露，请用温水冲洗 ≥5 分钟，并立即就医。粘合剂应远离明火和高温，因为固化的粘合剂如果燃烧可能会释放刺激性烟雾。不使用时，将粘合剂存放在 ≤30 °C 下，避免潮湿和阳光直射，并存放在密封的容器中。

1. 制备具有以下成分的钙成像缓冲液：NaCl 110 mM、KCl 5.4 mM、CaCl₂ 1.2 mM、MgCl₂ 0.8 mM、D-葡萄糖 10 mM 和 HEPES 10 mM。不使用时储存在 4 °C 下。
   注意：含有110mM NaCl的改性盐水是用于幼虫中枢神经系统解剖和成像的广泛接受的制剂，属于电生理学和成像研究中使用的典型范围（≈108-128mM NaCl）23,24,25,26。
2. 在 24 x 50 毫米（1.5 毫米厚）的显微镜盖玻璃上，使用从注射器中分配的凡士林创建一个孔。
3. 在盖玻璃的中心滴一小滴局部组织粘合剂（60% 2-辛基和 40% 氰基丙烯酸正丁酯）。使用玻璃棒将粘合剂均匀地涂抹成薄而均匀的层。
4. 使用刷子或细线小心地将单个幼虫转移到粘合剂上。轻轻地将幼虫的腹侧压在粘合剂上。让粘合剂干燥，确保幼虫完全固定。
5. 一旦幼虫固定，将盖玻片放在倒置显微镜载物台上（图1A）。

4. 离体 钙成像

1. 制备具有以下成分的幼虫解剖缓冲液：NaCl 110 mM、KCl 5.4 mM、CaCl₂ 0.3 mM、MgCl₂ 0.8 mM、D-葡萄糖 10 mM 和 HEPES 10 mM。不使用时储存在 4 °C 下。
2. 解剖 Ishimoto 和 Sano¹⁰ 所描述的脑解剖。简而言之，使用刷子或细线，将单个幼虫转移到底部分层有机硅弹性体的 3.5 厘米培养皿中。
3. 在解剖显微镜下，将幼虫腹侧朝上放置并定位大脑。使用解剖剪刀，在幼虫前端的三分之一处切开一个大约三分之一的切口。在嘴钩处再切一个口。在移除身体和嘴钩的同时保留大脑（改编自 Janelia Flylight 协议²⁷）。
4. 从腹侧索中识别含有运动神经元的神经簇。使用镊子，轻轻地将大脑从解剖的幼虫的其余部分拉开。从大脑中修剪任何多余的组织。
   注意： 轻轻处理 - 由于大脑很脆弱，用力过大会导致组织损伤。
5. 如步骤3.2至3.3所述，准备带有组织粘合剂的显微镜盖玻璃，用于钙成像。
6. 使用P10微量移液器，用培养皿中的5μL解剖溶液小心地吸出解剖的大脑。慢慢地将大脑排出到粘合剂上。在粘合剂干燥之前，将大脑定向为背侧朝上的位置（两个脑叶朝下，背侧腹索朝上）。
7. 使用 P200 微量移液器，将 100 μL 钙成像缓冲液转移到盖玻璃上固定的幼虫大脑上。
8. 将带有大脑的盖玻片放在倒置显微镜上，连接到旋转盘共聚焦扫描仪模块和用于钙成像的CCD相机（图1B）。
   注意：对于 离体 制剂，请务必在胶水仍然湿润时正确定位大脑。为了获得最佳图像质量，请放置大脑，使 ROI 最接近显微镜物镜，并避免在 ROI 附近涂抹过多的胶水。

5. 成像方案

1. 使用共聚焦显微镜打开钙成像软件。使用 10x/1.4 NA 物镜捕获图像，并在 GFP 激光器 （激发 488 nm，强度 70%，发射 525 nm/50 m，OD8）和 RFP 激光器 （激发 561 nm，强度 50%，发射 610 nm/75 m，OD8）之间切换滤光片。在图像捕获期间将 曝光 设置为 100 毫秒 到 1,000 毫秒之间， 增益 为 相应曝光值的 50%，合并 系数 为 2 。
2. 将显微镜调整到 10 倍放大倍率，并在明场照明下定位大脑。
3. 通过使用 RFP 激光搜索 tdTomato 信号（激发设置为 561 nm）来识别感兴趣的神经元。
   注意： 选择饱和度并减少伽玛以设置正确的曝光值。
4. 一旦确定了感兴趣区域 （ROI），切换到 GFP 激光器（激发设置为 488 nm）以捕获 GCaMP6f 信号。在捕获两个通道的堆栈图像之前，确保 tdTomato 和 GCaMP 信号共定位。
   注意：调整 tdTomato 和 GCaMP6f 堆栈记录的图像设置以最大限度地提高荧光。
5. 以 0.5 帧/秒的速率（总共 2 分钟）同时捕获 tdTomato 和 GCaMP6f 信号的两个单独时间序列记录。
   注意：在这些缓冲条件下，解剖的幼虫大脑保持存活约10分钟;在此时间之后，信号将降级。
6. 样品准备好成像后，以 0.5 帧/秒（总共 2 分钟）的速率同时捕获 tdTomato 和 GCaMP6f 信号的两个单独时间序列记录。
   注意：在这些缓冲条件下，解剖的幼虫大脑保持存活约10分钟;在此时间之后，信号将降级。
   注意：在进行定量分析时，我们建议增加激光功率并根据需要调整探测器曝光增益，同时保持线性强度缩放。

6. 数据处理和分析

1. 打开tdTomato和GCaMP6f信号堆栈并将其导入ImageJ（NIH）²⁸。
2. 要识别正确的感兴趣区域 （ROI），请合并 tdTomato 和 GCaMP6f 信号以确认共定位。验证后，拆分 tdTomato 和 GCaMP6f 通道。
3. 在顶部菜单中，选择 插件 |New，然后单击 Macros 以启动新宏。接下来，将基于 ROI 的自定义宏导入 ImageJ。选择 GCaMP6f 堆栈并点击运行进行钙分析。
4. 使用自定义 ImageJ 宏 （https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging） 处理荧光信号。该宏首先生成最大强度投影，使用StackReg插件（刚性配准 模式）²⁹执行运动校正，并应用漂白校正。
5. 将出现一个“需要作”弹出窗口，请求手动选择 ROI，这允许用户手动绘制广泛的 ROI。单击 “确定 ”继续分析。要进行运动校正，请确保矩形框覆盖所有帧中的整个 ROI，以实现准确的运动校正，同时保留帧之间的局部空间和 ROI 形状。
   注意：使用 StackReg 在 ImageJ 中注册了记录。当面内运动较大（累积XY位移>1 μM）或轴向Z漂移导致焦点丢失时，配准变得不可靠，或者样品完全从成像窗口中丢失。因此，显示极端漂移或钙信号下降的样品 （>30%） 被自动标记并从下游分析中排除，以确保准确测量神经元活动。这些阈值与钙成像研究中常用的质量控制实践一致 30,31,32,33。排除还确保仅使用具有可靠刺激相关钙瞬变的稳定记录进行分析。
6. 对于分析，在像素自相关的指导下，从手动定义的循环 ROI 中提取荧光迹线;这些投资回报率将涵盖整个关键神经元场。
   1. 使用 ImageJ （v1.54p） 中的自定义宏提取两种荧光团的原始荧光强度数据：GCaMP6f/GFP 和 tdTomato/RFP（https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging，参见 材料表）。
   2. 应用具有 20 x 20 像素 ROI 和整个视野步长为 10 像素的滑动窗口。对于每个 ROI，宏将计算：（1） 所有帧的强度，（2） 基线波动差异（即前 10 帧内最大和最小强度值之间的差异），以及 （3） 最大帧间强度变化 （ΔF）。显示强度波动小于 10 个单位的 ROI 将被消除，并且仅选择最尖锐的 ΔF 值进行进一步分析。
   3. 使用以下方法归一化荧光迹线：
      1. Fmax 和 Fmin 归一化：使用以下公式计算归一化 Δ：
         
         其中 F 是每个时间点的原始荧光，Fmin 是最小荧光（基线），Fmax 是记录期间的最大荧光。
      2. ΔF/F ₀ 归一化：此外，执行 ΔF/F_{o 归} 一化，其中 F_o（基线）由每个记录的前 10 帧确定，使用以下公式：
         
         其中 F_t 是时间 t 处的荧光，F₀ 是从前 10 帧计算的基线值。
7. 提取 GCaMP6f 信号后， 左键单击 并全 选、剪切和 粘贴 以将所有值传输到新的 Excel 电子表格。在顶部菜单栏中，选择 数据 |文本到列。将出现 “文本到列”向导 弹出窗口。在步骤 1 中，选择 分隔符，然后点击 下一步。在步骤 2 中，在 分隔符下，选择 制表符 和 逗号，然后单击 下一步。在步骤 3 中，选择“完成”。
   可选：要绘制归一化钙信号，请突出显示 Fnorm_FminFmax，然后选择 散点图。
8. 查找生成的.csv文件，其中包含：（1） 原始荧光值 F、（2） ΔF/F_o 和 （3） Fnorm（归一化荧光强度）。将最终数据集组织为四列：（1） 时间（帧），（2） 样本条件（饥饿或喂食），（3） 重复 ID（单个样本）和 （4） 归一化强度（Fnorm 值从 0 缩放到 1）。
9. 最后，使用自定义 R 脚本在 R 中执行数据分析和可视化（https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging，请参阅材料表）。
   1. 将自定义 R 脚本导入到新的 R 项目中。确保在运行分析之前安装并更新所需的 R 包，包括 ggplot2、 dplyr 和 readr。
   2. 从自定义 R 脚本的第 1 行开始，点击 “连续运行” 以进行钙分析。还要确保输出包括说明时间序列记录的前 30 帧、60 帧和所有帧的归一化钙强度的热图，以及显示归一化强度中位数的箱线图。
   3. 使用 Mann-Whitney U 检验评估归一化钙强度的显着性。

7. 废物处理和去污

1. 实验后，在流水下清除工具和表面的粗碎碎屑，然后用 70% 乙醇或 10% 漂白剂消毒，然后用无菌水消毒。在消毒过的表面上工作，脱下手套后洗手;不要在实验室内进食或饮水。
2. 在处置前将幼虫组织和受污染的一次性用品放入生物危害袋和高压灭菌器中。
3. 将完全固化的胶粘剂废弃物丢弃在一般垃圾中;未固化的粘合剂和受污染的一次性用品必须收集在密封的、贴有标签的危险化学废物容器中。
4. 将所有锐器（刀片、针头、碎玻璃）放入防刺穿锐器容器中。
5. 将易燃溶剂（乙醇、丙酮）收集在贴有标签的易燃废物容器中。

为了展示我们的幼虫钙成像方法，我们成功地将其应用于果蝇幼虫的体内和离体制剂（图2和图3，视频1，视频2，视频3和 视频4）。我们测量了在幼虫大脑中表达GCaMP6f和Td-Tomato的三龄果蝇幼虫的钙动力学18,19。为了展示比较测量结果，我们比较了饥饿和未饥饿幼虫的钙动态。

对于我们的体内制剂，我们测量了整个完整幼虫中Keystone-LN的钙动力学（图2C和图3A，视频1和视频2）。对于我们的离体制剂，我们在从未饥饿或饥饿的幼虫中解剖并保存在成像缓冲液中的幼虫大脑中测量了Keystone-LN的钙动力学（图2C和图3B，视频3和视频4）。在这两种制备中，我们观察到与未饥饿样品相比，饥饿样品中的Keystone-LN活性更高。在显示 60 秒内响应时间表示的热图（图 3;左上和左下图）和描绘平均信号强度值的箱线图（图 3;右上和右下图，Mann-Whitney U 检验;**p < 0.001).分析的集体数据是从每种条件下进行的至少五项试验中获得的。这些结果与最近的研究一致，这些研究表明饥饿动物的嗅觉神经元活动更高34,35。

图 1： 体内 和 离体 钙成像设置的示意图。 将整个幼虫样本（A）或幼虫脑样本（B）固定在显微镜盖玻璃上的凡士林（棕色）孔内铺的一层薄薄的组织粘合剂（纯蓝色）上。将样品浸入钙成像缓冲液（浅蓝色）中，并在倒置转盘共聚焦显微镜上进行成像。捕获样品的时间序列钙荧光图像。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：GCaMP6f 荧光成像。（A） 在488 nm通道（GCaMP6f，绿色）和525 nm通道（tdTomato，红色）中显示荧光的分割图像。合并后的图像显示在右侧面板中。 （B） Keystone-LN中GCaMP6f（绿色）和tdTomato（红色）随时间变化的原始荧光迹线示例。GCaMP6f 荧光的波动表明钙活性，而稳定的 tdTomato 信号用作鉴定 Keystone-LN 的对照。 （C） 用于 体内 （顶部面板）和 离体 （底部面板）制备的代表性GCaMP6f信号图像。左侧显示了未饥饿的样本，右侧显示了饥饿的样本。比例尺 = 20 μm （A）。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：GCaMP6f 荧光测量。（A） 左上角的面板显示了来自 体内制剂 （整个幼虫）中非饥饿幼虫（n = 5）和饥饿幼虫（n = 5）的Keystone-LN的钙信号的平均时间动态。右上角面板中的箱线图比较了 体内 制备中未饥饿（灰色）和饥饿（白色）样品之间的归一化 Ca 信号强度（Mann-Whitney U 检验;**p < 0.001）。 （B） 左下角的面板显示了来自离 体 制剂（解剖大脑）中来自非饥饿（n = 5）和饥饿幼虫（n = 5）的Keystone-LN的钙信号的平均时间动态。右下角面板中的箱线图比较了 离体 制备中非饥饿（灰色）和饥饿（白色）样品之间的归一化 Ca 信号强度（Mann-Whitney U 检验;**p < 0.001）。 请点击此处查看此图的大图。

视频 1：在体内、非饥饿条件下对 Keystone 局部神经元中钙反应的 GCaMP6f 荧光记录。请按此下载此短片。

视频 2：在体内饥饿条件下 Keystone 局部神经元中钙反应的 GCaMP6f 荧光记录。请按此下载此短片。

视频 3：GCaMP6f 荧光记录 Keystone 局部神经元中钙反应，适用于离体、非饥饿条件。请按此下载此短片。

视频 4：GCaMP6f 荧光记录 Keystone 局部神经元中钙反应的离体饥饿条件。请按此下载此短片。

作者没有需要披露的利益冲突。