实验用耐药细胞系的建立

摘要

耐药细胞系有助于理解治疗耐药机制，并用于新化合物、药物再利用及联合疗法的非临床评估。本文介绍了一种通过将亲本细胞系暴露于逐步增加浓度的目标药物中，以建立耐药细胞系的实验方案。

摘要

耐药细胞系的建立对于理解药物耐药机制以及识别克服癌症治疗失败策略至关重要。耐药模型可用于对新型化合物、药物再利用及联合疗法进行临床前评估。为获得耐药细胞，需将亲本癌细胞系在数周内反复暴露于逐步增加浓度的目标药物中。每阶段中存活并增殖的细胞被筛选、扩增后继续接受更高浓度药物处理。通过定量并比较半数抑制浓度（IC₅₀) 值，通过细胞活力检测和非线性回归分析比较亲本细胞与耐药细胞之间的差异。耐药细胞的 IC₅₀ 数值表明细胞已成功适应药物压力并产生耐药性。这些耐药细胞系可用于全面分析，例如微阵列和单细胞测序，以及多种 体外 或 体内 实验。这些模型为研究克服药物耐药性的潜在治疗策略提供了有价值的工具。

引言

化疗是治疗无法通过手术或放射治疗处理的局部癌症或转移性癌症最常用的治疗方案。分子靶向药物和化疗药物被广泛用作多种恶性肿瘤的一线治疗手段，其疗效已得到普遍认可。某些癌症在治疗初期即对特定药物表现出耐药性，导致治疗无效。然而更常见的情况是，原本有效的治疗因药物耐药性的产生而逐渐失效，进而导致癌症进展。

药物耐药性由癌细胞中的基因突变或表观遗传反应引起，这些变化会诱导产生能够逃避药物作用或促进细胞生长的基因产物^1,2。此外，在许多情况下，这种耐药性会进一步发展为多药耐药性，即癌细胞对多种药物均产生耐药性^3,4。因此，明确药物耐药的机制并制定克服耐药的策略，对于推动癌症治疗的发展具有重要意义。

耐药细胞系是研究治疗耐药机制的常用模型，在两者中均发挥重要作用 体外 和 体内 实验⁵这些模型是深入理解药物作用通路、鉴定影响治疗效果的生物标志物以及寻找抑制耐药性形成的治疗策略的重要工具。构建耐药细胞系的基本过程是通过将细胞系暴露于浓度逐渐增加的目标药物中以诱导耐药性的产生。³

方案

1. 细胞培养与细胞活力检测

注意：紫杉醇是一种抗癌药物，具有细胞毒性。操作时应穿戴防护服、护目镜和手套，并在安全柜内进行操作，以防止吸入体内。DMSO 细胞毒性较低，但接触皮肤或黏膜时会增加溶解药物的渗透性，因此操作时也应穿戴防护服、护目镜和手套。

1. 在37 °C、5% CO₂培养箱中，使用完全培养基（RPMI-1640 + 1% 青霉素-链霉素 [pen-strep] + 10% 胎牛血清 [FBS]）在10 cm细胞培养皿中培养DU-145细胞，直至细胞融合度达到80%。
2. 吸除培养基，用DPBS洗涤，加入0.05%胰蛋白酶，放入培养箱中孵育5分钟。
3. 轻敲培养皿并经显微镜确认细胞已从皿底脱落并悬浮后，加入1 mL完全培养基以终止胰蛋白酶作用。
4. 计数细胞，并以每孔1.0 × 10⁴/99 µL的密度将细胞接种于96孔板的各孔中，每孔加入完全培养基。孵育2小时，使细胞贴附于孔底。每个实验组的细胞应设三复孔或四复孔。
5. 调整各孔中紫杉醇和DMSO的添加量。确保每孔中加入的DMSO体积相同，且DMSO的终浓度不超过1%。
   1. 按照本方案操作，取10 mM紫杉醇DMSO溶液，取12.8 µL该药物加入87.2 µL DMSO中，混匀后得到100 µL浓度为1,280 µM的紫杉....

结果

采用该方法，我们此前耗时9个月成功建立了紫杉醇耐药的DU145细胞（DU145-TxR）。细胞活力检测结果显示，紫杉醇对亲本DU145细胞系的IC₅₀值为1.1 nM，而DU145-TxR细胞系的IC₅₀值比亲本细胞系高出149.6倍（IC₅₀：164.6 nM）（表1和图2）。该结果表明，DU145-TxR细胞已获得极高的药物耐药性。

在细胞接种和紫杉醇处理48 h后、进行细胞活力检测之前，立即使用数字倒置显微镜观察细胞形态。结果显示，随着紫杉醇浓度从1 nM增加至10 nM，亲本细胞系DU145表现出明显的细胞萎缩及提示细胞死亡的形态学改变；然而，在DU145-TxR细胞系中未观察到明显的形态学变化（图3）。

讨论

建立耐药性癌细胞系是研究药物毒性和耐药机制的成熟方法，但研究人员面临的首要挑战是选择合适的耐药表达模型。体外构建耐药细胞系的常用方法是将细胞系暴露于目标药物中，但必须考虑如何设定暴露浓度（逐步递增还是一次性给予）以及是否设置无药周期（脉冲式还是连续式）。

脉冲法具有无药期，类似于癌症患者接受多个周期的化疗，即短时间接触药物后随之进入恢复期。因此，该方法接近临床模型，被广泛应用。相反，持续药物暴露法模拟的是血液中药物浓度保持稳定的模型，例如某些每天给药的化疗药物和分子靶向治疗。

细胞系所接触的药物最高浓度由患者用药时体内血液中的药物浓度决定。该药物浓度被视为患者体内癌细胞所受到的药物暴露水平。与一步法相比，逐步法虽然操作更复杂，但其优势在于可通过逐步提高药物浓度，建立一系列高耐药性的细胞系。

IC 增加 3 至 10 倍₅₀ 与亲本细胞相比，若观察到从癌症患者化疗前后建立的细胞系中出现上述现象，则表明存在药物耐受性^8.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
10 mL 一次性移液管	Fisher scientific	13-678-11E
100 mm 培养皿	Corning	353003
15 mL 锥形管	Corning	352097
2.0 mL 冻存管	Corning	431386
96 孔细胞培养板	Corning	353072
细胞计数板	Invitrogen	C10228
细胞增殖试剂 WST-1	Sigma	5015944001
Centrifuge 5702 R	eppendorf
countless II	Invitrogen		细胞计数仪
二甲基亚砜	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	D4W2J
DU145	ATCC	HTB-81	前列腺癌细胞系
EVOS FLc	Thermo Fisher Scientific		数字倒置显微镜
FBS	Gibco	A5670701
紫杉醇	Selleck	S1150
青霉素–链霉素	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Synergy H1	BioTek		酶标仪
0.4% 台盼蓝溶液	Invitrogen	15250061