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方法文章

实验用耐药细胞系的建立

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DOI：

10.3791/68957

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2025年8月12日

 ,  ,  , 
1Department of Urology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Urology, Kanazawa University, 3Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor, 4Single Cell Spatial Analysis Program, University of Michigan, Ann Arbor

本文内容

摘要

耐药细胞系有助于理解治疗耐药机制，并用于新化合物、药物再利用及联合疗法的非临床评估。本文介绍了一种通过将亲本细胞系暴露于逐步增加浓度的目标药物中，以建立耐药细胞系的实验方案。

摘要

耐药细胞系的建立对于理解药物耐药机制以及识别克服癌症治疗失败策略至关重要。耐药模型可用于对新型化合物、药物再利用及联合疗法进行临床前评估。为获得耐药细胞，需将亲本癌细胞系在数周内反复暴露于逐步增加浓度的目标药物中。每阶段中存活并增殖的细胞被筛选、扩增后继续接受更高浓度药物处理。通过定量并比较半数抑制浓度（IC50) 值，通过细胞活力检测和非线性回归分析比较亲本细胞与耐药细胞之间的差异。耐药细胞的 IC50 数值表明细胞已成功适应药物压力并产生耐药性。这些耐药细胞系可用于全面分析，例如微阵列和单细胞测序，以及多种 体外 或 体内 实验。这些模型为研究克服药物耐药性的潜在治疗策略提供了有价值的工具。

引言

化疗是治疗无法通过手术或放射治疗处理的局部癌症或转移性癌症最常用的治疗方案。分子靶向药物和化疗药物被广泛用作多种恶性肿瘤的一线治疗手段，其疗效已得到普遍认可。某些癌症在治疗初期即对特定药物表现出耐药性，导致治疗无效。然而更常见的情况是，原本有效的治疗因药物耐药性的产生而逐渐失效，进而导致癌症进展。

药物耐药性由癌细胞中的基因突变或表观遗传反应引起，这些变化会诱导产生能够逃避药物作用或促进细胞生长的基因产物1,2。此外，在许多情况下，这种耐药性会进一步发展为多药耐药性，即癌细胞对多种药物均产生耐药性3,4。因此，明确药物耐药的机制并制定克服耐药的策略，对于推动癌症治疗的发展具有重要意义。

耐药细胞系是研究治疗耐药机制的常用模型，在两者中均发挥重要作用 体外 和 体内 实验5这些模型是深入理解药物作用通路、鉴定影响治疗效果的生物标志物以及寻找抑制耐药性形成的治疗策略的重要工具。构建耐药细胞系的基本过程是通过将细胞系暴露于浓度逐渐增加的目标药物中以诱导耐药性的产生。3,6.

药物使用的浓度及暴露时间是该过程中的关键因素。在每个浓度水平下，存活的细胞亚群被扩增，然后以重复的方式暴露于下一个浓度的药物。最终获得的耐药细胞系相比亲本细胞系对药物的半数最大抑制浓度（IC50）显著提高。本报告详细描述了采用逐步递增且间歇性药物暴露的方法，从人前列腺癌细胞系DU145建立紫杉醇耐药细胞系（DU145-TxR）的操作流程。

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方案

1. 细胞培养与细胞活力检测

注意：紫杉醇是一种抗癌药物，具有细胞毒性。操作时应穿戴防护服、护目镜和手套，并在安全柜内进行操作，以防止吸入体内。DMSO 细胞毒性较低，但接触皮肤或黏膜时会增加溶解药物的渗透性，因此操作时也应穿戴防护服、护目镜和手套。

  1. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用完全培养基（RPMI-1640 + 1% 青霉素-链霉素 [pen-strep] + 10% 胎牛血清 [FBS]）在10 cm细胞培养皿中培养DU-145细胞，直至细胞融合度达到80%。
  2. 吸除培养基，用DPBS洗涤，加入0.05%胰蛋白酶，放入培养箱中孵育5分钟。
  3. 轻敲培养皿并经显微镜确认细胞已从皿底脱落并悬浮后，加入1 mL完全培养基以终止胰蛋白酶作用。
  4. 计数细胞，并以每孔1.0 × 104/99 µL的密度将细胞接种于96孔板的各孔中，每孔加入完全培养基。孵育2小时，使细胞贴附于孔底。每个实验组的细胞应设三复孔或四复孔。
  5. 调整各孔中紫杉醇和DMSO的添加量。确保每孔中加入的DMSO体积相同，且DMSO的终浓度不超过1%。
    1. 按照本方案操作，取10 mM紫杉醇DMSO溶液，取12.8 µL该药物加入87.2 µL DMSO中，混匀后得到100 µL浓度为1,280 µM的紫杉醇溶液。
    2. 取50 µL上述溶液转移至另一离心管中，加入50 µL DMSO稀释至一半浓度（640 µM）。
    3. 重复此步骤进行系列稀释，制备浓度分别为0（仅DMSO）、0.1、0.5、1、2、4、10、20、40、80、160、320、620和1,280 µM的紫杉醇溶液。
      注：用DMSO稀释的紫杉醇溶液应分装后冷冻保存，以便后续实验重复使用（为减少冻融次数，建议分装保存）。
  6. 另取一离心管，将之前配制的紫杉醇溶液1 µL用9 µL完全培养基稀释，于细胞接种后2小时向各孔加入1 µL该稀释液。各孔中紫杉醇的终浓度分别为0、0.1、0.5、1、2、4、10、20、40、80、160、320、620和1,280 nM，每孔培养基总体积为100 µL。
    注：在设定细胞活力检测中药物浓度时，应参考既往文献报道的IC50值，确保所选浓度处于有效范围内3。各孔中DMSO终浓度均为0.1%（建议低于1%）。
  7. 继续孵育48小时，向每孔（含100 µL培养基）加入10 µL细胞增殖试剂WST-1，再孵育0.5至4.0小时。
    注：最佳孵育时间取决于细胞系和细胞密度。本研究中孵育约1.5小时。若孵育时间过短或过长，下一步测得的各孔吸光度将过低或过高，导致无法准确反映细胞活力差异。因此，在初次实验时应测试多个孵育时间，以确定最适孵育时间。
  8. 使用酶标仪测定WST-1的吸光度。
    注：检测波长为450 nm（推荐范围为420–480 nm），参比波长为650 nm（推荐600 nm或更高）。

2. 细胞活力和半数抑制浓度（IC50）值的计算

  1. 根据吸光度计算细胞活力。吸光度为 (A450nm-A650nm)。
    细胞活力 (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
    As：样品吸光度（药物处理的细胞）
    Ab：空白吸光度（仅培养基，无细胞）
    Ac：对照吸光度（未用药物处理的细胞）
  2. 使用电子表格软件汇总上一步计算得到的细胞活力数据。
  3. 通过非线性回归分析，计算并记录亲本细胞的IC50值。
    注：四参数逻辑模型（4PL）通常是一种合适的计算方法。已有在线IC50计算工具可供使用7。然而，当化合物的效能超出浓度范围，且数据无法充分代表S型曲线的上下渐近线时，不应使用4PL模型。
    1. 为避免此类问题，应尽可能在更多的浓度点测量细胞活力。若无法获得S型曲线，可采用固定最小值和最大值的二参数或三参数模型7。
    2. 若不使用计算软件或统计软件（包括网络可用工具），可使用以下公式：
      IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      A：细胞活力≤50%时所测药物浓度中的最低值
      B：细胞活力>50%时所测药物浓度中的最高值
      C：B点对应的细胞活力
      D：A点对应的细胞活力
      注：该公式假设夹住IC50值的两点之间的曲线为直线。

3. 药物暴露

注意：本节所述操作流程的概述见图1。

  1. 在细胞培养板上接种亲代细胞（100 mm 培养皿每皿接种 2.0 × 106 个细胞）。
  2. 向培养基中加入紫杉醇，使其浓度达到抑制细胞活力约 10–20% 的水平（即 IC10-20，本实验中约为 0.5 nM），置于培养箱中培养 2 天。
  3. 更换为不含紫杉醇的培养基，继续培养数天。
  4. 待细胞生长至约 80% 汇合度时，传代至新的细胞培养板中。剩余细胞进行冻存。
  5. 向传代后的细胞中加入紫杉醇，浓度约为初始浓度的 1.5–2.0 倍（即 0.75–1 nM），在培养箱中继续培养 2 天。
  6. 更换为不含紫杉醇的培养基，继续培养数天。
  7. 若细胞生长状态良好，则重复步骤 3.4–3.6，逐步提高紫杉醇的处理浓度。
    注意：药物浓度的增幅（1.5–2.0 倍）可由实验人员自行设定，建议每次提高药物浓度时均对细胞进行冻存。若紫杉醇浓度持续升高导致细胞增殖无法恢复甚至死亡，可复苏在死亡前一浓度下成功增殖的细胞，将紫杉醇浓度增幅降低至 1.1–1.5 倍（推荐使用 1.2 倍），并重复培养过程。
  8. 逐步提高细胞系对药物的耐受性后，按照第 2 节所述方法，使用 WST-1 试剂和相应软件计算并记录 IC50 值。
    注意：若观察到 IC50 值至少升高 3–5 倍，即可判定该细胞系为耐药细胞株。

4. 药物抗性的维持

  1. 为维持耐药细胞系的耐药表型，需在IC10-20浓度的药物中进行培养。
    注意：建议定期通过细胞存活率实验测定IC50，因为药物耐受性可能会发生变化。

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结果

采用该方法，我们此前耗时9个月成功建立了紫杉醇耐药的DU145细胞（DU145-TxR）。细胞活力检测结果显示，紫杉醇对亲本DU145细胞系的IC50值为1.1 nM，而DU145-TxR细胞系的IC50值比亲本细胞系高出149.6倍（IC50：164.6 nM）（表1和图2）。该结果表明，DU145-TxR细胞已获得极高的药物耐药性。

在细胞接种和紫杉醇处理48 h后、进行细胞活力检测之前，立即使用数字倒置显微镜观察细胞形态。结果显示，随着紫杉醇浓度从1 nM增加至10 nM，亲本细胞系DU145表现出明显的细胞萎缩及提示细胞死亡的形态学改变；然而，在DU145-TxR细胞系中未观察到明显的形态学变化（图3）。

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讨论

建立耐药性癌细胞系是研究药物毒性和耐药机制的成熟方法，但研究人员面临的首要挑战是选择合适的耐药表达模型。体外构建耐药细胞系的常用方法是将细胞系暴露于目标药物中，但必须考虑如何设定暴露浓度（逐步递增还是一次性给予）以及是否设置无药周期（脉冲式还是连续式）。

脉冲法具有无药期，类似于癌症患者接受多个周期的化疗，即短时间接触药物后随之进入恢复期。因此，该方法接近临床模型，被广泛应用。相反，持续药物暴露法模拟的是血液中药物浓度保持稳定的模型，例如某些每天给药的化疗药物和分子靶向治疗。

细胞系所接触的药物最高浓度由患者用药时体内血液中的药物浓度决定。该药物浓度被视为患者体内癌细胞所受到的药物暴露水平。与一步法相比，逐步法虽然操作更复杂，但其优势在于可通过逐步提高药物浓度，建立一系列高耐药性的细胞系。

IC 增加 3 至 10 倍50 与亲本细胞相比，若观察到从癌症患者化疗前后建立的细胞系中出现上述现象，则表明存在药物耐受性8...

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披露

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院基金项目 P01 CA093900 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300-054
10 mL 一次性移液管Fisher scientific13-678-11E
100 mm 培养皿Corning353003
15 mL 锥形管Corning352097
2.0 mL 冻存管Corning431386
96 孔细胞培养板Corning353072
细胞计数板InvitrogenC10228
细胞增殖试剂 WST-1Sigma5015944001
Centrifuge 5702 Reppendorf
countless IIInvitrogen细胞计数仪
二甲基亚砜 SigmaD2650
DPBSGibcoD4W2J
DU145ATCCHTB-81前列腺癌细胞系
EVOS FLcThermo Fisher Scientific数字倒置显微镜
FBSGibcoA5670701
紫杉醇SelleckS1150
青霉素–链霉素Invitrogen15140-122
RPMI 1640Gibco11875-093
Synergy H1BioTek酶标仪
0.4% 台盼蓝溶液Invitrogen15250061

参考文献

  1. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Fron Pharmacol. 4, 28(2013).
  2. Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
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