利用200 kV透射电子显微镜双聚光透镜系统实现高质量断层扫描数据采集

Summary

电子断层扫描使得对冷冻生物样品中组织内的细胞器、细胞和大分子进行近原子级成像成为可能。实现如此高分辨率需要严格控制的成像条件。这里，我们以配备两级凝聚镜系统的200 kV透射电子显微镜为例，描述如何进行高质量的电子断层扫描数据收集。

Abstract

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）已成为阐明细胞器和大型蛋白质复合物在原生环境中结构的强大技术。与传统的室温电子显微镜不同，低温电子外置技术最大限度地减少了辐射诱导和准备引起的内部结构损伤。此外，与单颗粒分析（SPA）不同，低温ET减少了重复纯化的需求，从而保留了样品最真实的结构信息。为了实现高分辨率成像，冷冻环境外胚对透射电子显微镜的成像条件提出了严格要求。尽管冷冻外质外质数据采集效率不断提升，且众多软件平台涌现，但大多数解决方案仍为专有、厂商特定且紧密耦合某些电子显微镜模型，导致实施成本较高。本研究中，我们将开源软件SerialEM安装在配备双聚光透镜系统的200千伏电子显微镜（Glacios 2 cryo-TEM）上，并进行了全面校准，以实现高质量断层扫描数据采集。以阿朴铁素为模型标本，我们描述了整个工作流程——从冷冻样品准备到自动冷冻ET数据收集，随后进行断层重建和断层下分析。该方法为低温外质电子数据采集提供了一种经济且易于使用的解决方案，尤其适合使用Glacios显微镜且无法使用专有软件的实验室。

Introduction

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）已成为研究大分子复合物和细胞器原位结构的强大技术。冷冻电晶素相较于单颗粒分析（SPA）的一个主要优势是能够避免过度的纯化步骤，从而在生物环境中保持目标生物分子的本质状态。目前，可以通过冷冻电质检测包括纯化的细胞器^{1、2、3、4}、细胞膜片、大分子复合体⁵、病毒⁶、细胞片⁷以及组织切片^8、9、10等广泛标本。鉴于样品类型和实验目标的多样性，数据收集策略差异显著，必须根据样品和具体仪器配置进行精心调整。

数据收集是低温外传流程中的关键步骤，因为数据质量和采集效率直接影响后续处理和实验整体成功率。为满足不断变化的实验需求，开发了多个数据收集平台。其中最广泛使用的包括商业层析成像和开源软件SerialEM^11、12、13。断层扫描提供高度集成且用户友好的界面，学习曲线较低，但灵活性较低，且需要商业许可。相比之下，SerialEM是一个免费的开源软件包，支持基于图形用户界面（GUI）和脚本的工作流程，提供了更大的灵活性和扩展性。

从冷冻层块采集的断层扫描数据带来了独特的挑战。高质量的层状结构难以制备，其机械不稳定性和对电子照射的高敏感性进一步增加了数据收集的复杂性。为应对这些挑战，Fabian Eisenstein开发了PACEtomo工作流程¹⁴，这是SerialEM的改进，引入了光束-图像偏移，使每个倾斜系列获得多张断层扫描，从而降低对焦和跟踪调整频率。该策略最大化每个区段可用的数据量，同时最大限度地减少不必要的电子暴露。类似的功能也出现在商业版 Tomography5 软件中。

相比之下，从冷冻固定细胞器或膜片收集数据通常更为简单，因为这些样本通常在有孔碳网格上制备，提供了充足的聚焦和跟踪空间^15,16。在这种情况下，SerialEM内置的冷冻外胚采集工作流程——可通过其图形界面直接访问——提供了便捷且无脚本的选择，特别适合初学者或小型实验室。然而，从效率角度来看，我们仍建议尽可能采用基于束流图像偏移的策略。

鉴于低温电子显微镜的高昂成本，优化数据收集策略以最大化仪器利用率至关重要。配备两级聚凝透镜系统的200 kV透镜电子显微镜在厚样品中电子穿透率略低于300 kV仪器，但经过适当校准后仍完全适用于低温电晶体。然而，其相对狭窄的平行束流条件范围和放大倍数下的固定斑点尺寸，使其通常不太适合高分辨率的低温外晶体辐射，除非系统得到精确优化。

我们的电子显微镜设备配备了Falcon 4i直接电子探测相机，在单电子计数能力和高速连续成像方面具有显著优势。为了充分发挥该探测器的性能，TEM必须在高度优化的成像条件下运行。对于采用两级聚光系统的透射电子显微镜（TEM），对平行光的照明条件进行精确校准是提升成像质量的重要因素^17,18。在现代两级聚光系统中，第二级聚光镜的焦点必须与上物镜的前焦平面重合，以确保与样品平面相交的光路平行。准确建立的平行光条件对于确保在收集图像局部位置保持欠焦值和放大倍率一致至关重要。

本研究重点是建立高质量的冷冻外逸流程，使用阿朴铁蛋白作为模型样本。由于200 kV透射电子显微镜系统未获得商业断层扫描软件许可，我们改为安装并校准了开源的SerialEM平台。通过精心优化显微镜两级聚光透镜系统的平行光束参数，我们实现了通过SerialEM图形界面实现的自动断层扫描数据采集——无需使用Python脚本或复杂配置。该方法为200 kV仪器如Glacios的低温环境外胚数据采集提供了用户友好且经济高效的解决方案。

Protocol

1. 制备和装载低温样品

1. 准备Vitrobot时，启动并将温度设为10°C。 把湿度设为100%。更换滤纸纸。
2. 将一块300网的R1.2/1.3孔碳膜定量铝板放入发光排放系统中。将辉光放电条件设置为15毫安，持续60秒，真空压力为0.39毫巴，负电荷。进行发光放电以对电网表面进行亲水化。
3. 将Vitrobot参数设定为：印迹时间：3秒，等待时间：0秒，墨迹力：2，温度：8°C，湿度：90%。
4. 用液氮冷却，将液态乙烷放入包裹液氮的乙烷杯中。
5. 将3微升阿波铁蛋白样品喷洒到发光电栅上。立即将样品用液态乙烷玻璃化
6. 将样品从乙烷转移到预冷液氮储存箱中。冷冻样本准备现已完成。
   注意：处理液氮和乙烷时必须严格遵守以下安全规范：个人防护装备（如低温手套和安全护目镜）为防止作中的冻伤必须佩戴;乙烷凝结前，确保接收杯无液氮，以避免快速沸腾引起的飞溅;使用后，牢固关闭乙烷气体系统的主阀和压力调节阀以防止泄漏;样品制备后，残留的乙烷和液氮必须在制备室内指定的通风设备中处理。

2. 确定电子显微镜的平行光条件

1. 在进行平行光束对准前，首先调整望远镜的以下参数：级距均心高度，物镜对焦，nP光束倾斜ppX/ppY，无昏迷枢轴点X/Y，彗发和柱头。
2. 使用交叉光栅网格，确认样品在纳米探针模式下以SA 73,000×的放大倍率处于均心高度和正确焦点（无能量滤镜）。
3. 切换到绕射模式（相机长度：D750毫米），插入100微米物镜孔径（图1A，1B）。
4. 点击“调整”标签查看物镜口，使用多功能X和Y旋钮将物镜光圈移开中心，使光圈边缘与金绕射环重叠，部分遮挡中心点（图1C）。
5. 通过使用对焦旋钮调整绕射焦点，使物镜的后焦平面进入视野，直到物镜光圈边缘尽可能锐利（见图1D）。
6. 调整束流强度（C2强度），直到金衍射环的宽度最小。
7. 将物镜光圈置中。增加衍射相机长度，直到只可见中央斑点（见图1E）。
8. 点击污点面板中的“衍射”标签，使用多功能的X和Y旋钮在交叉点上下循环时调整中心点的形状，使束流呈圆形（见图1F）。
9. 调整光束强度直到中心光点最小化。这将建立平行照明条件。由于平行照明条件可能因不同光点大小而变化，请记录每个常用光点大小的对应C2设置，以便未来实验中快速配置。
   注意：数据采集时使用的具体点大小取决于放大倍率和C2光圈设置;我们需要确保成像以相机的最佳剂量率进行。

3. 高质量的掭铁蛋白样品电子断层扫描数据收集

注意：本节概述了一种高通量断层扫描数据采集的标准化程序，适合有经验的用户和新手研究者。

1. 要剪裁网格并将准备好的冷冻样品装入电子显微镜，将O型圈放入对准工具中，预备好的网格置于O型圈中心。用弹簧笔将C环夹在O形圈上，固定样品在它们之间。
2. 将Autogrid垂直插入磁带槽，通过工作站转移到纳米杯，然后加载到电子显微镜中。
3. 要用SerialEM完整截取整个网格的蒙太奇，启动SerialEM软件。启用低剂量模式。定义搜索模式，放大倍率为115×。
   注意：搜索放大通常用于获取大面积地图。这种放大率被设得尽可能低，以加快映射过程，同时确保图像拼接的准确性。
4. 打开导航器文件。去导航器 > montaging and grids >设置完整 montage。在对话框中，设置 “使用搜索模式”;将图片保存为 bin4 格式。点击 “开始 ”，在蒙太奇控制下。
5. 为了校准搜索和视图字段，在搜索模式下，定位一个高度可识别的地标（图2A）。在导航器中点击 添加标记 。点击 “前往标记” 以移动到标记位置。
6. 切换到视图（2600×）模式，找到相同的地标。点击 地标。进入导航器，点击 Shift到标记 键对齐字段（图2B）。根据对话框中的提示，两种放大倍率的光束偏移会被分配到搜索地图中的所有标记，并保存移位值（见图2C）。
   注意：视角放大率通常设置为选定区域（SA）的最低倍率，以确保视角和记录模式相同，从而简化切换放大时的置中过程。
7. 用于校准视图和记录场（见图3）。在视图模式中，找到一个极具辨识度的地标。切换到纪录（120k×）模式。用鼠标在记录模式下将地标置中。
   注意：记录放大倍率的设置取决于估计的目标分辨率（目标分辨率是像素大小的两倍）和样品大小。
8. 切回视图模式拍照。用鼠标右键将目标物体拖曳到视角中心的十字线上。
9. 在“Defocus”部分点击“Shift”旁边的 “设置 ”来对齐字段。
10. 要选择目标方块并捕捉中倍率地图，完整蒙太奇中的5.1，点击 添加多边 形以勾勒出要捕捉的区域。勾勒出区域轮廓后，点击 停止添加 以最终确定选择。
11. 对所有需要的区域重复步骤3.10。对于导航器中的每个多边形，请在物品选项中查看获取（A）和新建文件。
12. 在勾选物品新文件后弹出的对话框中，选择以下内容： 蒙太奇图片;将蒙太奇与多边形进行匹配;当下一个新文件要打开时关闭文件。点击 确定。
13. 在新对话框中，选择以下选项： 移动舞台而非图像移动;在低剂量模式下使用视图参数。将图片保存到指定位置。
14. 要捕捉中放大地图，请在导航菜单中点击“在物品处获取”。请查看以下选项：获取并保存图片或剪辑;制作导航员地图。
15. 在“主要动作”相关部分，请点击“使用视图模式捕捉图像”。在“小学前后任务”部分，请查看 “大致均心率”。点击GO开始捕捉中倍放大图。
16. 在中倍率地图上选择点。在导航界面打开中倍率地图。点击添加点，然后左键点击地图中的目标对象。
17. 重复此过程，针对所有需要的点。选中所有点后，点击 “停止添加 ”以最终确定选择。
18. 对于光圈对准，使用显微镜界面中的直接对准来调整nP光束倾斜ppX/ppY和无彗差的枢轴点X/Y，最大限度地减少光束点在视场中的摆动。
19. 使用SerialEM脚本库中的脚本执行调音范围（https://serialemscripts.nexperion.net/script/47）。
20. 要启动断层扫描数据收集，请在导航器界面中查找ROI并检查 倾斜系列。在对话框中，选择“ 图片框架”;选择数据存储位置。
21. 在设置对话框中，设置一个度范围，范围是-50°到50°。将基准增量设置为2.5°，起始角度为0°，并启用剂量对称方案。
    注意：每次倾斜剂量、倾斜角度范围和倾斜步数的设置通常遵循以下原则：总剂量保持在约100 e⁻/Ų。倾斜范围的选择旨在确保即使在最高倾斜角下，样品也能保持较大不受阻挡，并允许足够的电子透射和成像。如果倾斜范围较大（例如超过±60°），倾斜步长可以设置为3°。对于倾斜范围较小（例如约±50°），倾斜步长可以减少到2.5°或2°，以确保总剂量保持在约100 e⁻/Ų左右。这对200千伏显微镜尤为重要，因为辐射损伤比300千伏显微镜更为明显，因此必须避免过多的总剂量。
22. 在光束强度或曝光控制部分，勾选 “保持光束强度”。将散焦目标设置为-3微米，自动对焦频率设置为每次倾斜一次。
23. 如果自动对齐导致图像尺寸偏移超过60%，就选择 停止 ，设置“前后跟踪”。
24. 要开始数据收集，请在导航器中点击“ 在物品处获取”。在主动作中，检查自动 对焦中的“循环对焦目标”、漂移等待和“TS”。
25. 将焦距范围设置在-3.5到-4.5微米之间，分4步完成。在通用设置下，启用 末端关闭柱阀。在“主任务前后任务”部分，启用 “重对齐” 和 “主任务前的精细均心”。

4. 阿朴铁蛋白的亚断层图平均

1. 使用Warp¹⁹进行运动修正和CTF估计。使用AreTomo3²⁰进行断层扫描倾斜序列对准。
2. 使用Warp执行断层扫描重建和解卷积。使用PyTom²¹进行基于模板的粒子选择。
3. 使用RELION 5²²进行初步细化。使用M²³进行高分辨率细化。
4. 通过处理八个倾斜序列确定最终结构，随后选择5,939个粒子并进行迭代优化，最终分辨率为2.8 Å（见图4）。

Results

在精确平行束束对准后，我们利用SerialEM的图形接口功能对揪铁蛋白进行了断层扫描数据收集。随后使用Warp、AreTomo、PyTom、RELION及其他相关软件处理，最终结构分辨率为2.8 Å。这一分辨率充分展示了我们数据的高度，达到了目前通过相对较高分辨率的亚断层平均法可达的水平。如 图4所示，比对和重建的结果（图4A）清晰展示了掭铁蛋白的整体结构和空间分布。对从八个对齐并重建的倾斜序列中提取的粒子进行了亚断层图平均，得出分辨率为2.8 Å的结构（见图4B）。相应的傅里叶壳相关（FSC）曲线如 图4C所示。

图1：利用第二聚光镜系统确定平行照明条件。 （A） 无光圈的衍射模式。（B）插入100微米物镜孔径后的衍射图样。（C）光圈偏移于衍射中心，以便更好地可视化边缘锐利度。（D）通过调整物镜和C2透镜电流，聚焦光圈边缘和优化衍射环。（E）椭圆形中央衍射斑，需通过圣痕面板进行修正。（F） 圆形且最小化的中心衍射点，表示优化的平行照明。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：从搜索（115×）到视图（2600×）的高到低倍对齐过程。 （A）搜索模式图像，标记（红色箭头）位于洞口边缘。（B） 查看模式图像，标记（红箭头）位于与（A）相同的物体位置。在导航器中点击“Shift到标记”选项。（C） 弹出窗口中，双倍放大的光束偏移被分配给搜索地图中的所有标记，移位值被保存。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：从视图（2600×）到记录（120k×）的高到低倍对齐过程。 （A） 在记录模式下，目标物体位于视野中心（红色虚线圆圈突出显示目标物体）。（B） 在查看模式下拍摄的图像，目标对象未与红色十字准星对齐（红色虚线圆圈突出显示目标对象和红色十字准星）。（C） 通过右键点击并移动目标对象，将目标对象拖曳到红色十字准星中心，然后按下位于Shift键旁边的 Set 按钮（红色虚线框突出显示该按钮）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：掭铁蛋白的结构测定。 （A）结构成像。最终断层图平均的局部分辨率图。纹理看起来均匀，整个视野中紧密排列、重复的纳米尺度特征。（B）空间分辨定量映射。同一或相关纳米结构区域的假彩色圆形图谱。颜色范围从蓝/绿到黄/红，对应下面色彩刻度上的数值（约2.5到3.5的任意单位）。颜色分布异质表示样品中测量属性（例如高度、厚度、折射率或机械/光学响应）的空间变化。（C） 全局光谱或功能表征。用于分辨率估计的傅里叶壳相关（FSC）曲线。最终分辨率为2.8 Å，用虚线表示FSC = 0.143。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

冷冻样品制备和电子断层扫描数据采集的程序必须根据具体样品类型进行调整。这里描述的实验策略非常适合生物大分子、蛋白质复合物和小型细胞器。这些样品可以直接被玻璃化到电磁网格上，其相对较小的厚度确保了电子的高效透射和高对比度图像的获取。理想情况下，样品厚度不应超过200纳米。

对于沉入冷冻样品，通常倾向于侧向尺寸小于10微米，以减少结冰形成，避免结构完整性受损。对于较大样品，高压冷冻或缓冲液中加入低温保护剂（如甘油）可以延迟冰成核²³。然而，为了满足TEM的厚度要求，通常还需要进一步加薄。在现有稀释方法中，聚焦离子束（FIB）铣削²⁴最为广泛采用，因其精度和损伤最小，能产生适合高分辨率低温电晶体的层状晶体。

在采集层状数据时，最大化层状物的利用至关重要。实现束流-图像移移采集可以减少重复的对焦和跟踪步骤，从而提高数据收集的吞吐量。虽然这里没有详细描述，但该技术在PACEtomo方法论中有详细描述。

目前，流行的断层扫描数据采集软件选项包括层析成像（Thermo Fisher Scientific）和SerialEM。断层扫描是一种商业解决方案，定制灵活性有限，而SerialEM由科罗拉多大学博尔德分校的David Mastronarde开发，是一款开源软件，支持基于脚本的自动化。然而，充分利用SerialEM的能力需要较大的学习曲线。本研究展示了一个简化的工作流程，利用SerialEM的图形界面，消除了脚本或基于Python的配置需求，同时实现了无人值守的夜间数据采集。

在使用该方法进行断层扫描数据采集过程中，常见的挑战是追踪不准确，可能导致倾斜序列不完整且缺角，或使后续对准变得复杂。为缓解这些问题，跟踪参数必须根据样品的对比度和倾斜阶段稳定性进行优化。有效的策略包括调整跟踪位置的曝光时间以确保图像清晰度，物理上分离跟踪和聚焦位置以减少累积辐射损伤，以及在级段稳定性差时降低跟踪放大倍率以实现可靠的模式匹配。这些调整对于在不同实验条件下实现稳健的跟踪性能至关重要。在本研究中，我们以阿波铁蛋白作为模型标本。基于并行光的测试和校正，我们利用SerialEM内置功能收集高质量冷冻ET数据，并对铁蛋白样品进行亚断层扫描计算，最终获得2.8 Å的最终结构。

该方法旨在扩展200 kV电子显微镜在高分辨率低温外星效应中的应用。实现如此高分辨率根本依赖于获得高质量的成像数据，而这又需要精确的照明条件。为此，我们进行了精确的平行照明对准，作为关键的准备步骤。这里描述的对准程序专为配备双聚光透镜系统的透镜电子望远镜设计，如Thermo Fisher Scientific Talos Arctica和Glacios。与带有第三个聚光透镜（C3）的仪器不同，这些系统将平行照明条件限制在C2透镜的单一特定激发值内。这一固有限制要求电子束极其精确地对准，以将源图像定位在上物镜的前焦平面——这是最佳成像性能的前提。后续数据处理结果表明，经过此次比对后，这台200 kV显微镜对被测样品的数据采集质量几乎与通常300 kV仪器相当。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM niti grid	纳景丁心	M04240922A	用于低温样品制备
阿朴铁蛋白	生物体	BP17854-00A	用于低温样品制备
交叉光栅网格	阿加科学	AGS106	用于确定平行光条件
格拉西奥斯2	赛莫渔业	9959084	用于 Tomo 数据收集
2号滤纸，55毫米	什么人	10311807	吸墨纸
佩尔科易发光	特德·佩拉	91000-01020	用于辉光放电
量形铜网格	量子形	N1-C14nCu30-01	用于低温样品制备
Vitrobot Mark IV及nbsp;	赛莫渔业	230101164	用于低温样品制备