一种用于膝骨关节炎的可视化敏化穴位操作方法：行为学、热成像及分子水平评估

摘要

本研究详细介绍了一种适用于针灸摄影和红外热成像的大鼠固定方法。此外，研究还表明，在敏化穴位进行电针刺激可抑制局部炎症性疼痛。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是全球范围内导致肌肉骨骼疼痛和功能障碍的主要原因，由于现有药物和手术干预在实现持续镇痛方面的疗效有限，其治疗仍具挑战性。尽管针灸在缓解KOA相关疼痛方面已显示出临床潜力，但其潜在机制仍需进一步阐明。对敏化穴位实施针灸可显著增强治疗效果。本方案通过向关节内注射单碘乙酸钠（MIA）建立大鼠KOA模型，并系统描述了针对敏化穴位的针灸操作流程，包括固定方法、穴位定位及针灸参数。通过疼痛行为学评估、膝关节红外热成像分析、血清炎症细胞因子检测以及软骨组织的组织病理学检查，对治疗效果进行了全面评价。结果表明，在MIA诱导的大鼠模型中，对敏化穴位进行针灸可通过抑制促炎介质释放、阻断伤害性信号传导、改善局部微循环、调节关节局部温度以及延缓关节退变，显著缓解疼痛表型。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征为慢性炎症和累及整个关节的病理改变，包括软骨侵蚀、软骨下骨重塑、骨赘形成以及滑膜炎症^1,2。临床上，患者通常表现为疼痛、肌肉无力、关节不稳、短暂的晨僵以及进行性功能受限。KOA 造成巨大的全球疾病负担，目前约有 3.65 亿人因该病导致功能障碍，流行病学模型预测，到 2050 年中叶，病例数量将比 2020 年基准水平上升 74.9%³。值得注意的是，尽管疼痛是主要的治疗驱动因素⁴，但它同时会加重功能障碍，通过影响活动能力和降低日常活动水平，严重损害多个生活质量维度。因此，治疗策略旨在缓解疼痛、恢复功能并延缓疾病进展⁵。目前的一线药物治疗包括镇痛药、非甾体抗炎药、硫酸软骨素和硫酸氨基葡萄糖，以及关节腔内注射糖皮质激素，以减轻疼痛和炎症⁶。然而，长期使用这些药物受到显著医源性风险的限制，特别是胃肠道并发症和心血管不良事件⁷，这凸显了对更安全、更可持续治疗替代方案的迫切需求。

针灸和电针已被广泛应用于骨关节炎的治疗，显示出缓解膝痛和改善关节功能的疗效^8,9，世界卫生组织（WHO）已将关节炎列为针灸治疗的重点适应证。穴位既是针灸刺激的作用靶点，也是效应输出的关键环节，在疾病状态下其形态特征、空间范围及功能反应性会发生动态变化，这一现象被称为“穴位敏化”^10,11。尤为重要的是，这种敏化过程会调节穴位的感受野范围和治疗反应性，从而决定治疗效果。既往的临床前研究^12,13表明，在膝骨关节炎（KOA）动物模型中，阳陵泉（GB34，位于腓骨头前下方凹陷处，靠近后肢外侧）和足三里（ST36，位于小腿前侧，髌韧带外侧缘向下至踝关节前中点的1/5处，距踝关节上方约3/16处）均出现敏化现象。激光散斑成像显示这些穴位局部血流灌注升高，而光声成像却未发现微循环结构发生显著改变，提示KOA中穴位敏化过程中的微循环变化主要为功能性而非结构性改变。对潜在机制的深入研究需依赖大鼠模型，但动物配合度差导致实验耗时较长。为克服上述限制，本研究设计了一种大鼠固定装置，专门用于方便下肢穴位的操作，提高电针治疗的实施效率。

红外热成像作为一种功能性成像技术，利用非接触式红外传感器检测预设感兴趣区域的热辐射，通过计算机处理数据生成伪彩色热图，用于定量分析^14,15。该技术通过测量与皮肤、血管及肌肉组织中血流波动相关的温度变化，实现对皮肤血流动力学变化的无创监测¹⁶，从而有助于可视化评估穴位处功能性微循环的改变。本研究首先使用电子痛觉计验证GB34和ST36穴位的疼痛敏感化，随后结合藏红O-快绿染色、IL-1β和TNF-α分析、红外热成像以及疼痛相关行为学评估，探讨电针刺激GB34和ST36穴位对碘乙酸钠诱导的（MIA）膝骨关节炎大鼠的镇痛作用。

方案

所有实验方案均经北京中医药大学动物伦理委员会批准并严格监督（编号：bucm-2024091102-3197），所有操作均严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》。本研究共使用30只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重范围：210–250 g）。所用试剂与仪器详见材料表。

1. 实验动物与分组

1. 将动物饲养在专用的动物实验设施中。
2. 保持环境温度为 22 °C ± 2 °C，相对湿度为 50%–60%，并维持 12 小时光照/12 小时黑暗循环。提供 随意摄取 在整个研究期间可自由获取食物和水。
3. 经过7天的适应期后，将大鼠随机分为五组（每组6只）：正常对照（Con）组、假手术（Sham）组、模型（MIA）组、非固定（NF）组和电针（EA）组。

2. 建立单碘乙酸诱导的膝骨关节炎模型

1. 将大鼠放入诱导室中，使用4%异氟烷与氧气混合进行诱导麻醉，随后以1.5%-2.0%异氟烷维持麻醉状态 通过 符合机构批准方案的口罩
2. 将大鼠置于左侧卧位固定。使用温和的脱毛膏去除右侧膝关节及其周围区域的毛发。
3. 用聚维酮碘从内向外对右膝关节进行三次消毒，随后使用75%乙醇重复相同步骤。
4. 保持右膝屈曲90°。确定髌骨下缘和胫骨结节。将一根22 G针头（0.7 mm × 30 mm）刺入关节腔3–5 mm 通过 髌韧带外侧或内侧边缘，以30°–45°的皮肤入针角度进针。确认关节腔内位置后，缓慢注入50 µL MIA溶液（1 mg/50 µL）。假手术对照组注射等体积的无菌生理盐水。
5. 进行五次被动关节活动范围操作，以确保关节内药物均匀分布。将动物放回其饲养笼中，进行术后恢复。

3. 大鼠固定的实验步骤

1. 将大鼠固定于黑色束缚套管中。在右下象限处开一个直径为1.5 cm的圆形开口，使右后肢由此伸出，如图1A所示。
2. 将两根尼龙扎带（5 mm × 300 mm）以6.8 cm的间距固定于塑料网架上。将上方的束缚带置于腋部区域，下方的束缚带固定于骨盆带处，如图1B、C、E所示。
   注意：NF组不进行3.2步骤中描述的操作。

4. 电针治疗

1. 在连续三天固定处理后的第四天开始电针干预。
2. 对足少阳胆经（GB34）和足阳明胃经（ST36）穴位区域进行无菌准备。有关这些穴位的标准体表解剖定位，请参见图1D。
3. 将一次性无菌针灸针（直径：0.25 mm；长度：13 mm）插入穴位。根据电刺激方案，将GB34连接至阳极，ST36连接至阴极（图1G）。
4. 完成20分钟电针治疗后，关闭设备。断开电极与针柄的连接，并小心拔出针灸针，以结束治疗操作。每日进行干预，连续两周。
   注：除NF组外，其余三组不接受任何治疗，但每日以与EA组相同的方式固定20分钟。

5. 机械缩足阈值（MWT）测试

1. 在室温为 24 °C ±  °C 的安静环境中，将大鼠放置于底部为不锈钢网、笼体为有机塑料的足部测试平台上。
2. 使用电子 Von Frey 电子痛觉测量仪直径为 0. mm 的探头，垂直刺激右侧后足中心区域或指定的针刺穴位。逐渐且均匀地增加刺激强度，直至观察到足部回缩逃避反应。记录此时仪器显示的数值，作为机械回缩阈值。
   注意：每只大鼠每次测量间隔 10 分钟，连续进行三次测量，取其平均值作为最终结果。

6. 爪回缩潜伏期（PWL）测试

1. 在正式评估前，将大鼠在热板上适应5分钟。
2. 测试期间，保持热板表面温度为55.0 °C ± 0.0 °C。当大鼠右后爪接触加热表面时开始计时，观察到首次阳性反应（舔爪、跳跃或快速回缩）时停止计时。将记录的持续时间定义为PWL。
   注意：每只大鼠进行三次重复测量，每次间隔5分钟。以平均值作为代表性的PWL值。

7. 红外热成像

注意：在进行热成像前一日去除后肢的毛发，以消除毛发对温度测量的影响。

1. 在环境温度为 2 °C、相对湿度为 60%、隔音且光照柔和的条件下进行实验操作。
2. 将大鼠置于黑色固定套管中，使其右后肢穿过圆形孔并伸直，放置于操作台上静置 10 分钟。
   注意：若大鼠在 10 分钟后仍未安静，需延长等待时间，直至其安静后再进行下一步操作。
3. 使用热成像仪在 5 cm 距离处采集膝关节的侧位和腹侧热图像，设备参数设置为发射率 0.97、帧率 9 Hz、红外分辨率 160 × 120 像素。
4. 使用专用分析软件处理所获取的红外热成像数据，通过基于计算机的光谱分析实现热学参数的精确定量。

8. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 通过腹腔注射20%乌拉坦溶液（1.2 g/kg）麻醉大鼠。打开腹腔，将采血针插入腹主动脉，针头末端插入不含抗凝剂的真空采血管中。
2. 让血液样本静置凝固30分钟。在 °C条件下，以1006. x g离心15分钟。采用BCA法测定血清蛋白水平。
3. 根据制造商说明书，使用商用ELISA试剂盒检测IL-1β和TNF-α浓度。

9. 番红-固绿快速染色

注意：在腹主动脉采血后，使用手术剪切除右侧膝关节，保留近端股骨和远端胫骨各1 mm的骨关节段。仔细清除关节周围软组织。

1. 将膝关节浸入4%多聚甲醛（PFA）中固定72小时。在温和振荡条件下用磷酸盐缓冲液（PBS）充分冲洗，以确保完全去除PFA。
2. 将样本置于乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液中，在 °C下脱钙4周。每2天更换一次EDTA溶液。用针头轻刺组织，若无阻力表明脱钙完成。用PBS冲洗脱钙后的样本4–6小时，以去除残留的EDTA。
3. 使用自动脱水机对样本进行脱水。将样本包埋于石蜡中，并凝固成坚硬的蜡块。用切片机对石蜡包埋块进行切片，获得厚度为4 µm的切片。将切片转移至水浴中，待其充分展开后捞出，置于载玻片上。在温控烘箱中干燥12小时。
4. 将载玻片先后放入二甲苯（I）和二甲苯（II）中各10分钟。随后依次浸入无水乙醇（I）、无水乙醇（II）、90%乙醇和75%乙醇中，每种溶液各5分钟。最后用超纯水冲洗。
5. 用快绿染液对载玻片染色2分钟。用自来水冲洗，直至软骨在显微镜下呈现透明、类似玻璃样的外观，并可清晰观察到软骨陷窝。在1%醋酸溶液中分化10秒，持续观察直至残留的蓝色完全去除。立即用超纯水冲洗。
6. 用番红O染液对载玻片染色15分钟，直至软骨基质呈现均匀且浓烈的宝石红色，而骨组织呈淡粉色。
7. 将载玻片依次浸入无水乙醇（I）、（II）、（III）和（IV）中，每种溶液各10秒。随后分别浸入新配制的二甲苯（I）和二甲苯（II）中，各10分钟。
8. 取出载玻片，在其表面滴加中性树胶，注意避免接触组织。将盖玻片边缘接触载玻片后缓慢放下，防止气泡产生。擦去多余的二甲苯和树胶。室温下避光过夜自然干燥。将干燥后的切片置于光学显微镜下进行成像观察。

10. 统计分析

1. 使用 SPSS 软件进行统计分析。数据以均值 ± 标准差表示。
2. 采用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA）分析 MWT 和 PWL 数据。其余数据组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。
3. 结果以均值 ± 标准差（SD）表示。统计学显著性定义为 p < 0.05。

结果

在整个实验过程中，没有动物死亡。NF组和EA组每只大鼠的手术操作时间及针头脱落次数结果显示，采用尼龙扎带进行固定后，EA组的操作时间缩短，针头脱落次数减少（P < 0.001；图1H、I）。穴位痛阈分析显示，在造模前，GB34、ST36及非穴位区域的机械性疼痛敏感性之间无统计学显著差异（P > 0.05）。MIA注射后14天，三个位点的疼痛敏感性均升高，其中GB34和ST36的敏感性显著高于非穴位区域（P < 0.05 或 P < 0.01；图1J）。机械缩足阈值（MWT）和缩足反应潜伏期（PWL）评估结果表明，各组基线阈值具有一致性。注射生理盐水或MIA两周后，Sham组与Con组之间未观察到显著差异（P > 0.05）。经过两周治疗后，EA组的痛阈显著优于MIA组（P < 0.001；图2

讨论

MIA 是一种代谢抑制剂，可选择性破坏细胞的有氧糖酵解，从而诱导软骨细胞凋亡^17,18,19。关节内注射 MIA 会导致软骨细胞减少以及继发性关节软骨退变，其形态学不规则性和组织病理学改变与人类骨关节炎（OA）病理高度相似²⁰。因此，该模型被广泛应用于 OA 疼痛机制的研究²¹。碘乙酸（IAA）注射也常被使用；然而，IAA 在水中溶解度较低，所得溶液通常呈酸性，这种酸性可能对关节组织产生额外的刺激作用。目前，通常使用 IAA 的钠盐形式，即 MIA²²。因此，本研究采用 MIA 诱导的膝关节炎模型，以直观探究特定穴位针刺敏化的机制。番红O-快绿染色法已被广泛用于展示关节疾病的病理变化，故本研究采用该染色方法验证膝骨关节炎（KOA）模型是否成功建立^23,<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0-10 µl 可调体积移液器	Servicebio	IC012395160823
0-200 µl 可调体积移液器	Servicebio	IC021029160323
1.5 ml 离心管	Servicebio	EP-150-M
10 µl 微量移液器吸头	Servicebio	TP-10
1 ml 注射器	上海智禹医疗器械有限公司	ZSQ-1
200 µl 微量移液器吸头	Servicebio	TP-200
22 号针头	Kruuse	112416c
2 ml 离心管	Servicebio	EP-150-M
5 ml 红色采血管	上海新乐生物科技有限公司	CXG-5R
75% 酒精	山东安捷高科消毒科技有限公司	75-500ml
防脱载玻片	CITOTEST	188105
自动板式洗板机	Rayto	RT-3100C
采血针	江西瑞邦实业集团有限公司	CXZ-07
骨组织番红固绿染色液	上海源叶生物科技有限公司	R32730
盖玻片	江苏赛特新材股份有限公司	10212432C
脱水机	DIAPATH	Donatello
电子天平	Mettler-Toledo	ME203E/02
电热鼓风干燥箱	Labotery	GEL-70
包埋机	武汉俊杰电子有限公司	JB-P5
环保型脱蜡透明液	Servicebio	G1128-1L
酶标仪	BioTeK	Epoch
乙醇	SCRC	100092683
乙二胺四乙酸	Macklin	60-00-4
无脂棉球	曹县华鲁卫生材料有限公司	TZMQ-500
高速冷冻离心机	Dragon	D3024R
高速组织研磨仪	Servicebio	KZ-III-F
热板痛觉分析仪	Kew basis	KW-CT-1
成像系统	Nikon	NIKON DS-U3
红外热成像仪	Testo AG	Testo 865
碘伏	山东安捷高科消毒科技有限公司	DF-500
IR Soft	Testo AG
异氟烷	RWD 生命科学	R510-22-10
乳胶手套	北京瑞京乳胶制品有限公司	RJJC-S
机械足爪刺激测试装置	Kew basis	KW-RB
MIA	Sigma	206-165-7
中性树胶	SCRC	10004160
正丁醇	SCRC	100052190
生理盐水溶液	石门	SLYS-500ml
石蜡液	Macklin	8012-95-1
中性多聚甲醛固定液	Servicebio	G1101
病理切片机	上海徕卡仪器有限公司	RM2016
大鼠 IL-1β  ELISA 试剂盒 GER0002-96t	Servicebio	AC30253754
大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 GER0004-96t	Servicebio	AC40253711
SD 大鼠	北京斯贝福生物科技有限公司	SCXK (京) 2024-0001
小动物麻醉机	YuYAN	ABM
外科口罩	winner	WJKZ-1
组织展片机	浙江科华仪器有限公司	KD-P
超纯水抛光系统	Aiken water El	AK-RO-C2
正置光学显微镜	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
氨基甲酸乙酯	Macklin	2621-79-6
涡旋混合器	Servicebio	MV-100
二甲苯	SCRC	10023418