一种在表达荧光蛋白的细胞中灵活进行端粒FISH与免疫荧光的实验方法

摘要

本方案描述了一种将端粒FISH（天然或变性）与免疫荧光和/或荧光蛋白的可视化相结合的方法。

摘要

利用荧光原位杂交技术（TelFISH）对端粒进行可视化观察，长期以来一直是端粒生物学实验中的重要工具。将TelFISH与免疫荧光（IF）相结合的方法（IF-TelFISH）也已得到广泛应用，例如用于鉴定由端粒功能障碍诱导形成的焦点结构，即端粒与53BP1共定位的现象。近年来，天然端粒FISH技术（nTelFISH）已成为检测端粒替代延长机制（Alternative Lengthening of Telomeres, ALT）的重要手段，该机制是一些肿瘤细胞中维持端粒长度的途径。表达荧光蛋白也是细胞生物学研究中的关键技术，可实现对其他方法难以检测的蛋白质和细胞结构的可视化观察。由于FISH缓冲液会使蛋白质变性，因此在表达荧光蛋白（FP）的细胞中进行该检测会导致FP信号丢失。本文介绍了一种可在保留FP信号的前提下，将IF与端粒FISH整合于表达荧光蛋白细胞中的方法。本方案还针对多种IF和FP实验场景，提供了适用于变性及天然端粒FISH的可选操作步骤。综上所述，该实验流程为在正常细胞和肿瘤细胞中开展端粒生物学研究提供了一个灵活且实用的框架。

引言

具有线性染色体的生物必须应对两个问题。首先，由于末端复制问题，每次DNA复制时染色体末端都会轻微地发生降解。其次，细胞必须能够区分天然的DNA末端与DNA断裂。端粒的进化正是为了解决这些问题。通过核糖核蛋白端粒酶的作用，染色体末端被添加短的串联重复序列（在人类中为TTAGGG）而得以延长。这些重复序列由shelterin复合物结合，从而将染色体末端隐藏于细胞的DNA损伤修复机制之外¹。端粒过短或功能异常会导致细胞衰老及衰老相关表型²，而逃逸端粒危机则是肿瘤发生过程中的一个重要里程碑³。正因如此，端粒生物学在理解人类健康与疾病方面具有特殊的研究价值。

端粒荧光原位杂交（FISH）长期以来一直是可视化间期细胞或中期染色体铺片中端粒的重要方法⁴。数十年来，端粒FISH常与53BP1免疫荧光染色（IF）联合使用，以鉴定由端粒功能障碍引起的焦点结构（TIFs），即功能异常或去帽端粒的标志物^5,6。类似地，采用端粒替代延长机制（ALT）维持端粒的肿瘤细胞的一个典型特征是端粒与核内PML小体相关联，形成ALT相关PML小体（APBs）⁷。APBs可通过端粒FISH与PML免疫荧光染色相结合的方法进行检测。因此，免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH）是端粒生物学中一种成熟且广泛应用的技术工具。

本文从两个方面扩展了IF-FISH技术的应用。首先，在表达荧光蛋白（FP）的细胞上进行IF-FISH实验。荧光标记蛋白的表达已成为细胞生物学中普遍使用的技术工具。对于缺乏优质抗体的蛋白质，表达带标签的蛋白可能是实现其可视化的唯一选择。例如，表达的GFP标记核肌动蛋白染色体结合体（nAC-GFP）可揭示核内肌动蛋白的动力学特征⁸。该试剂为研究核内F-肌动蛋白开辟了新的研究途径，而这一领域曾一度存在争议。尽管GFP和mCherry等荧光蛋白在固定后通常仍能保持荧光活性，但FISH杂交缓冲液中的甲酰胺会使其荧光淬灭⁹。为解决这一问题，本实验方案在免疫荧光（IF）染色的二抗步骤中创新性地引入了荧光团标记的抗荧光蛋白"增强剂"。该荧光团的亮度不受甲酰胺影响，从而实现了IF-FP-FISH联合检测。

其次，免疫荧光（IF）可与天然端粒荧光原位杂交（nTelFISH）联合使用，后者是检测ALT状态的重要诊断方法。在变性FISH中，必须采用某种方法使DNA双链解链¹⁰（例如加热或碱处理），从而使探针能够结合通常为双链结构的DNA。相比之下，天然FISH不包含变性步骤，因此探针只能结合已处于单链状态的DNA。天然端粒FISH特异性检测单链C链端粒重复序列，这是肿瘤细胞中ALT途径的另一显著特征^11,12。将该检测方法与IF-FP染色相结合，有助于我们深入探究ALT机制，而ALT目前被认为是靶向肿瘤治疗的一个极具潜力的方向。

此处描述的方案可用于 "选择你自己的冒险" 可用于对免疫荧光（IF）、荧光蛋白（FP）以及天然或变性端粒FISH中的任意组合进行染色。由于该方案具有高度可配置性，所需时间可能差异较大。通常情况下，需要在四天内进行实际操作，但这些操作日不一定连续。完成典型的变性FISH工作流程所需时间的估算如下 图1原位杂交无需过夜杂交，因此 one 可能消除一个 如果实验人员可在实验台工作较长时间，可将过夜步骤（合并第2天和第3天）合并进行。

典型的共聚焦显微镜可支持四色通道成像：大致为蓝色、绿色、红色和远红。本文展示了四种可能的四色组合示例，但实际可选的组合方式无穷无尽。使用两种免疫荧光抗体或两种表达的荧光蛋白均可获得同样理想的效果。该实验方案简单且可靠。任何单独使用时能产生良好免疫荧光结果的抗体均适用于本方法。尽管此处仅包含用于FISH的端粒探针，但使用着丝粒探针进行变性FISH同样可获得良好结果。因此，本方案在解答核生物学中的重要问题方面具有高度的灵活性。

方案

开始之前，请考虑所用显微镜、表达荧光蛋白的细胞系以及可用的探针和抗体。通常使用蓝色标记DNA染料（如DAPI），因为蓝色荧光基团通常亮度较低。如有必要，也可使用蓝色的二抗。如果细胞表达GFP，可选用红色荧光标记的FISH探针，并配合AF-647标记的免疫荧光一抗二抗。或者，对于表达mCherry的细胞，可选择AF-488标记的免疫荧光二抗和AF-647标记的FISH探针。四种可能的免疫荧光-荧光蛋白-FISH组合示例见图2，旨在为实验设计提供灵活性参考。必须选择使用原位变性或变性FISH方法之一，因为这两种方法不可结合。本文还提供了一种可靠的盖玻片酸洗方法，以促进细胞贴附。该步骤可在使用前任何时间完成，无菌盖玻片可长期保存。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 盖玻片的酸洗

注意：必须对玻璃盖玻片进行清洁和酸洗，以使培养的细胞能够贴附。对于12孔板中的细胞培养，18 mm的圆形盖玻片最为理想。请咨询显微镜核心设施，以确定应使用#1还是#1.5规格的盖玻片。盖玻片清洗时间并非关键，但酸洗步骤不可省略或缩短。

1. 使用盖玻片镊子（图3A）将盖玻片放入支架中，确保其表面不相互接触。如有需要，可将额外的盖玻片对角放置以增加容量（图3B）。将多个支架舒适地放入染色皿中（图3C）。
2. 向染色皿中加入水和少量洗涤剂。轻轻将装有盖玻片的支架放入皿中。
3. 使用摇床或旋转仪在肥皂水中振荡盖玻片30分钟。
4. 将装有盖玻片的支架从染色皿中取出。弃去肥皂水。
5. 冲洗染色皿，并加入去离子水。将装有盖玻片的支架放回清洁的水中，并置于摇床上轻柔振荡5分钟。
6. 再用两份新鲜去离子水重复冲洗，共完成三次冲洗。
7. 将装有盖玻片的支架从染色皿中取出。向染色皿中加入1 N HCl。
   注意：HCl具有腐蚀性。应在通风橱中操作，并使用个人防护装备。小心地将装有盖玻片的支架浸入酸溶液中。确保1 N HCl完全覆盖盖玻片。盖上染色皿的盖子。
8. 将装有盖玻片和酸溶液的染色皿放入水浴超声仪的槽中。在55 °C下超声处理15分钟。
9. 让盖玻片在酸浴中过夜。
10. 次日小心地将盖玻片支架从染色皿中取出。根据机构安全规程处理废弃的1 N HCl。
11. 冲洗染色皿，并加入去离子水。将装有盖玻片的支架放回清洁的水中，并置于摇床上轻柔振荡5分钟。
12. 再用两份新鲜去离子水重复冲洗，共完成三次冲洗。
13. 将装有盖玻片的支架从染色皿中取出。倒空染色皿并加入70%乙醇。将支架放回皿中，轻柔振荡5分钟。
14. 将装有盖玻片的支架从染色皿中取出。倒空染色皿并加入100%乙醇。将支架放回皿中，轻柔振荡5分钟。
15. 将装有100%乙醇和盖玻片的染色皿移至组织培养超净台。在超净台内，将盖玻片支架从皿中取出，使其自然风干。
16. 倒空染色皿，并将盖玻片支架放回其中。盖上盖子以保持无菌状态。染色皿并非完全密封；若盖玻片长期置于乙醇中，乙醇最终会蒸发。但盖玻片仍可继续使用。

2. 在盖玻片上接种细胞

注意：操作盖玻片需要 练习。建议先从6孔板开始，待熟练后再操作。当使用6孔板时，洗涤液的体积应为12孔板所用体积的两倍。

1. 培养表达GFP或mCherry标记的目标蛋白的健康、生长良好的细胞（多种红色或绿色荧光蛋白均适用；详见材料表中的说明）。示例中使用了通过替代性端粒延长机制（ALT）维持端粒的U2OS骨肉瘤细胞。
   1. 可使用瞬时转染的细胞或稳定表达荧光蛋白的细胞系。若实验需要药物处理或转染，应根据固定时所需的汇合度（通常为70%-80%）、处理时间及细胞生长速率，计算每张盖玻片应接种的合适细胞数量。
2. 在组织培养超净台中准备盖玻片以保持无菌状态。向12孔板的每个孔中加入1 mL无菌PBS。用盖玻片镊将一张洁净且经酸洗的盖玻片放入每个孔中，手动轻轻振荡数秒。
3. 吸除PBS，每孔加入1 mL新鲜无菌PBS。将培养板暂置一旁。
4. （可选）用纤连蛋白包被盖玻片以增强细胞黏附。许多贴壁细胞系在接种后至少培养18小时再进行固定时，能够良好地黏附于酸洗过的盖玻片上。如果细胞黏附不佳或需在接种后短时间内即行固定，则建议对盖玻片进行包被处理以促进黏附。
   1. 用无菌PBS配制5 µg/mL的纤连蛋白溶液。
   2. 吸除盖玻片上的PBS，轻轻向每张盖玻片加入约300 µL纤连蛋白溶液，使其形成由表面张力维持的液滴。
   3. 在37 °C孵育数小时或在4 °C过夜。
   4. 用PBS多次漂洗，并将盖玻片保留在最后一次更换的PBS中。在准备细胞的同时将培养板暂置一旁。
   5. 若纤连蛋白不适用，可考虑使用多聚-L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶作为替代方案。
5. 用胰酶消化细胞，并根据实验设计及固定时所需的细胞密度，将适量细胞稀释于12 mL培养基中。
6. 吸除盖玻片上的PBS，每孔加入1 mL细胞悬液。
7. 将细胞放入培养箱中孵育。
8. 根据实验设计，对细胞进行必要的药物、siRNA或其他试剂处理，培养至所需汇合度。

3. 免疫荧光-荧光蛋白染色

注意：在整个实验过程中，切勿让盖玻片干燥。建议用一只手移液，另一只手吸液，以尽量减少盖玻片暴露在溶液外的时间。移液时应将溶液轻柔地加至孔壁，避免直接滴加在盖玻片上。使用镊子夹取盖玻片时应稳固但轻柔，用力过大会容易导致盖玻片破裂。在操作初期，建议准备重复的盖玻片，以防破裂。随着操作熟练，盖玻片破裂的情况将变得罕见。切勿尝试从干燥的孔中拾取盖玻片；盖玻片必须浸没在缓冲液中才能拾取。

1. 移除培养基，并使用选择的固定剂固定细胞。固定前无需洗涤细胞。在12孔板中每孔使用1 mL，在6孔板中每孔使用2 mL。
   1. 选项1：使用PBS中的4%甲醛。
      警告：甲醛有毒。操作时需戴手套，并妥善处理。使用16%无甲醇甲醛和10× PBS储备液新鲜配制。室温固定15分钟。
   2. 选项2：使用含蔗糖的细胞骨架缓冲液（CBS）中的4%甲醛。
      注意：此缓冲液更适用于保存细胞骨架结构¹³。CBS的终浓度为10 mM MES（pH 6.1）、138 mM KCl、3 mM MgCl₂、2 mM EGTA和0.32 M蔗糖。配制固定剂时，先配制2× CBS储备液（含20 mM MES pH 6.1、276 mM KCl、6 mM MgCl₂、4 mM EGTA），另配1.28 M蔗糖储备液。两种储备液均储存于4 °C。使用前新鲜配制工作液：取1体积16%无甲醇甲醛、1体积蔗糖储备液和2体积2× CBS储备液混合。室温固定15分钟。
   3. 选项3：使用 -20 °C甲醇固定。推荐用于核酸抗体靶标（如单链DNA、G-四链体、RNA-DNA杂交体）。在-20 °C固定5分钟。
2. 吸除固定剂，并根据机构规定妥善处理。
3. 用PBS多次洗涤盖玻片。
   1. 暂停点：固定后的盖玻片可在4 °C的PBS中保存数天，信号损失最小。如需长期保存，应将其脱水至100%乙醇（70%乙醇中2分钟，90%乙醇中2分钟，储存于100%乙醇中），用封口膜密封培养板，置于-20 °C保存。盖玻片可保存数周至数月。染色前，重新水化盖玻片（90%乙醇中2分钟，70%乙醇中2分钟，PBS中15分钟），然后进行下一步操作。
4. 在4 °C下，使用含0.5% Triton X-100的PBS对盖玻片进行5分钟的透化处理。此步骤在培养板中进行。
5. 用PBS多次洗涤盖玻片。
6. 准备湿化室（图3D）。在湿化室底部放置湿润的纸巾。为便于染色，取一个12孔板的盖子，在其顶部标记，使其与各盖玻片对应。
   1. 用封口膜覆盖盖子，确保标签可见。确保湿化室密闭避光，必要时加盖铝箔（图3E）。
7. 将75 µL含100 µg/mL RNase A的PBS滴加至标记好的支持面上。轻轻取出每片盖玻片，用实验用纸巾轻蘸边缘以去除多余缓冲液。将盖玻片倒置（细胞面朝下）置于RNase A液滴上。将支持面放入湿化室，盖上盖子，在37 °C孵育45分钟。
8. 向12孔板中加入新鲜PBS。将盖玻片放回板中，细胞面朝上。用PBS多次洗涤。
9. 在室温下封闭30分钟或更长时间。擦去覆膜支持面上的RNase溶液。将75 µL含20%驴血清的PBS滴加至膜上。将盖玻片倒置（细胞面朝下）置于封闭缓冲液液滴上。
10. 配制一抗。
    1. 每片盖玻片使用75 µL。额外准备10%以补偿移液误差。
    2. 用5%驴血清稀释抗体。抗体稀释比例需通过实验确定。1:100稀释是一个合理的起始点。
    3. 封闭期间，准备第二个用于一抗孵育的标记支持面。用封口膜覆盖盖子，并在指定位置滴加75 µL稀释后的一抗。
11. 封闭步骤结束后，将盖玻片转移至一抗液滴（细胞面朝下）。将支持面放入湿化室，盖上盖子，在室温下孵育至少2小时，或在4 °C过夜。
12. 向12孔板中加入新鲜PBS。将盖玻片放回板中，细胞面朝上。在室温下轻轻振荡，用PBS洗涤三次，每次5分钟。
13. 在最后一次洗涤期间，配制二抗。
    1. 每片盖玻片使用75 µL。额外准备10%以补偿移液误差。
    2. 推荐荧光二抗和GFP/RFP增强抗体稀释比例为1:400。可根据对靶标的实验经验适当调整。
    3. 用5%驴血清稀释二抗。将75 µL稀释后的二抗滴加至标记支持面上的相应位置。
14. 洗涤后，将盖玻片转移至二抗液滴（细胞面朝下）。在密封的湿化室中，室温孵育至少30分钟。
15. 向12孔板中加入新鲜PBS。将盖玻片放回板中，细胞面朝上。在室温下轻轻振荡，用PBS洗涤三次，每次5分钟。

4. 重新固定与脱水

1. 在室温下配制4%多聚甲醛PBS溶液用于重新固定。即使初始固定使用甲醇，此步骤也必须使用多聚甲醛。移除最后一次PBS洗涤液，将细胞重新固定15分钟，期间轻轻摇动。
2. 吸除固定液，并根据机构规定妥善处理废弃液体。
3. 用PBS多次冲洗盖玻片。
4. 对盖玻片进行脱水并空气干燥，以准备杂交：
   1. 在70%乙醇中孵育2分钟。
   2. 在90%乙醇中孵育2分钟。
   3. 在100%乙醇中孵育2分钟。
   4. 经100%乙醇处理后，将盖玻片有细胞的一面朝上放置于标记好的滤纸上，以保持方向一致。在配制FISH探针的同时，使其完全空气干燥。

5. 荧光原位杂交（可选方案1）：变性荧光原位杂交

1. 准备两个铝箔支撑架（见图3F）。
   1. 将一片铝箔对折两次，形成四层。确保哑光面朝外。
   2. 将折叠好的铝箔修剪至可放入12孔板盖内。用实验室擦拭纸将铝箔在孔板盖内侧摩擦，使盖子上的凸起在铝箔上压出纹路。这样形成的凹槽可在后续步骤中防止盖玻片相互滑动。
   3. 制备两个这样的支撑架。它们可在后续实验中擦拭后重复使用。
2. 用杂交缓冲液（70%去离子甲酰胺，10 mM Tris，pH 7.4，0.5% 10× Roche封闭溶液）将10 µM探针按1:50稀释。每张盖玻片使用75 µL稀释后的探针，并额外准备10%以补偿移液过程中的损耗。最终探针浓度应为200 nM。
3. 将加热金属块预热至90 °C，将PCR仪预热至85 °C。
4. 变性盖玻片：将风干的盖玻片细胞面向上放置在其中一个已准备好的铝箔支撑架上。轻轻将铝箔置于PCR仪加热块上并关闭盖子。孵育5分钟以进行变性。
5. 同时，将稀释后的探针置于加热金属块中，在90 °C下加热5分钟。
6. 将75 µL变性后的探针液滴滴加到第二个已准备好的铝箔支撑架上。确保铝箔的哑光面朝上，以利于形成完整液滴。若光面朝上，探针会扩散并失去表面张力。
7. 将已变性的盖玻片翻转，细胞面向下覆盖在探针液滴上。
8. 用刮铲辅助，将带有探针和盖玻片的铝箔支撑架转移至设定为85 °C的PCR仪加热块上，孵育5分钟。转移时需小心，避免碰撞或移动盖玻片。
9. 将带有盖玻片和探针的铝箔转移至湿盒中，盖上盖子，在室温下过夜孵育。

6. 荧光原位杂交（选择方案2）：原位FISH

1. 将10 µM探针用杂交缓冲液（70%去离子甲酰胺，10 mM Tris，pH 7.4，0.5% 10× Roche封闭溶液）按1:200稀释。最终探针浓度为50 nM。每张盖玻片使用75 µL，额外多准备10%以补偿移液误差。
2. 将75 µL稀释后的探针液滴加至覆有薄膜的支撑板上指定位置。
3. 将已变性的盖玻片反转并置于75 µL探针液滴上，使细胞面朝下。
4. 将支撑板放入湿盒中并盖上盖子。在室温下孵育至少45分钟；如需要，可延长至过夜。

7. 清洗与封片

注意：最佳封片剂取决于显微镜物镜的数值孔径。请咨询 当地显微成像核心设施以获取建议。一种合适的选择可能是 ProLong Glass 加 NucBlue，其折射率为 1.52。然而，根据所使用的显微镜，另一种封片剂可能更为合适。

1. 将盖玻片放回12孔板中用于洗涤，翻转使其细胞面朝上。
2. 洗涤 3 次× 70% 甲酰胺/10 mM Tris（pH 7.5）中孵育 10 分钟
   警告：甲酰胺具有毒性，应根据机构规定进行处理。
3. 洗涤 3 次× 5 分钟，TNT 缓冲液（0.05 M Tris/0.15 M NaCl/0.05% Tween-20，pH 7.5）
4. 用 PBS 多次漂洗。如果封片剂中未包含 DNA 染料，可考虑在最后一次洗涤时加入 DAPI。进行 DAPI 染色时，将 300 nM DAPI 加入 PBS 中，滴加至盖玻片，孵育 5 分钟。根据机构规定处理 DAPI 溶液。
5. 使用一滴封片剂将盖玻片封固在载玻片上。将盖玻片倒置置于液滴上，细胞面朝下。
6. 让封片剂过夜固化后再进行成像。

结果

本方案的典型结果如图4所示。若操作得当，细胞形态将保持良好，荧光信号明亮。变性端粒FISH应显示出每个细胞核中数十个点状信号，代表各个端粒（见图4，示例1和2）。端粒信号应几乎 exclusively 位于细胞核内，尽管有时也会出现细胞质中的端粒染色，尤其是在ALT细胞系中。所获得的端粒信号通常非常明亮，因此必须注意防止端粒信号溢出至其他检测通道。在ALT细胞系中，端粒常聚集于PML小体¹⁴，导致观察到的信号点数量少于正常预期。这种聚集现象可在图4的示例2中观察到。

在使用替代性延长端粒（ALT）机制维持端粒的细胞系中，天然端粒FISH可检测到端粒单链DNA（ssDNA），这是ALT的标志性特征^11,12。并非每个细胞核都会出现端粒ssDNA，且单个细胞核中通常仅有少量信号点（见图4，示例3和4）。天然端粒FISH的信号强度不及变性端粒FISH。骨肉瘤细胞系U2OS是进行天然FISH实验的良好阳性对照。在通过端粒酶维持端粒的细胞系中，不应观察到端粒ssDNA。

无论是变性FISH还是天然FISH，强烈的核仁荧光均为人为假象。若观察到过强的核仁信号，可尝试使用新鲜配制的RNase A溶液，或延长RNase A处理时间¹⁵（实验步骤3.8）。对于使用ALT状态未知细胞进行的天然端粒FISH实验，应使用已知ALT阳性细胞系（如U2OS）来校准检测参数。

在IF-FP-FISH实验中对荧光蛋白（FP）的观察结果可与活细胞成像实验进行直接比较，以验证其准确性。若发现存在差异，可尝试调整固定条件。使用CSB缓冲液进行固定（方案步骤3.1.2）可能有助于更好地保存细胞结构，从而更准确地显示荧光蛋白的定位¹³。

免疫荧光染色因目标蛋白的不同而存在较大差异。应将免疫荧光结果与未进行FISH处理的样本进行比较，以评估FISH实验流程对目标蛋白定位和信号强度的影响。通常情况下，IF-FP-FISH实验适用于信号焦点的计数，但信号强度可能不具备定量性⁶。

图1：示例工作流程及预估耗时。若一抗孵育过夜，则可能需要额外一天时间。对于原位杂交（FISH）实验，第2天和第3天有时可合并进行，但会导致更长的实验操作时间。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：四色成像中成功实验组合的示例。 示例1和2展示了变性端粒FISH，而示例3和4使用了天然FISH。请注意，无论是在免疫染色中检测两种靶蛋白（示例1）、结合一种荧光蛋白（FP）和一种免疫荧光（IF）染色（示例2和4），还是两种荧光蛋白（FPs）的组合（示例3），本方案均适用。这些实验的代表性结果见图4。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：本实验方案所用的设备。（A）盖玻片镊子。虽然直头镊子可用于夹取盖玻片，但弯头盖玻片镊子操作更为方便。（B）用于清洗的盖玻片架。注意，除了横向排列外，盖玻片还在相邻凹槽之间呈倾斜放置，以增加装载容量。（C）置于染色缸中的四排盖玻片架。玻璃染色缸可容纳数十个盖玻片架，且耐盐酸清洗。（D）准备好的加湿孵育盒。外部包裹铝箔以创造避光环境，保护荧光染料；底部放置湿润的纸巾以维持湿度。（E）密封的加湿孵育盒。严密贴合的盖子对于防止干燥至关重要。（F）铝箔支撑架的制作。在修剪好的铝箔上压出凸起的脊线，有助于在变性步骤中防止盖玻片相互滑动。请点击此处查看该图的放大版本。

图4四通道成像实验的代表性结果，包括免疫荧光、荧光原位杂交以及表达的荧光蛋白。 图示为所描述实验的实际结果 图2DAPI 染色 DNA，nAC-GFP 标记核内 F-肌动蛋白，TelFISH 和 TRF2-mCherry 标记端粒，PML 免疫染色标记核内 PML 小体，nTelFISH 显示端粒单链 DNA。所有细胞均为 U2OS 骨肉瘤细胞。图像均在具备超分辨率功能的共聚焦显微镜上采集。示例 1 的图像采用激光扫描共聚焦显微镜获取，其余图像均采用结构照明显微镜获取。所有比例尺均为 5 µM。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

使用IF-FISH的实验长期以来一直是端粒研究领域的常用方法，用于检测端粒应激或ALT现象^5,6,16。本文进一步扩展了该方案，以包含荧光蛋白的检测。此外，还提供了天然状态端粒FISH作为另一种独立的ALT检测方法¹¹。本实验方案操作简便，可稳定地获得满意的结果。

本方案通过在盖玻片上使用抗体或肽核酸（PNA）探针的液滴进行操作，设计上力求节约。采用液滴法可节省宝贵的试剂。相比之下，腔室载玻片等替代方法成本较高，且灵活性较差。尽管操作盖玻片需要一定练习才能熟练掌握，但其节省的成本使得投入的时间十分值得。需要注意的是，不建议使用体积超过75 µL的试剂液滴。过大的液滴只会导致盖玻片滑动，且不会改善实验结果。

nAC-GFP的表达是可视化细胞核内F-肌动蛋白不可或缺的工具，如图4所示⁸。目前已有许多其他标记试剂可用于解答重要的生物学问题。例如，FUCCI质粒系统可用于可视化细胞周期，结合本实验方案还可与端粒FISH技术联用¹⁷。另一种检测细胞周期的方法可利用PCNA染色体抗体（chromobody）获取细胞周期信息¹⁸。根据具体研究问题的不同，市面上已有多种荧光蛋白（FP）标记试剂可供选择。

此处以端粒FISH为例演示该方案，但使用相同浓度的PNA探针进行着丝粒FISH也已获得成功。例如，可将FAM标记的着丝粒探针与Cy3标记的端粒探针进行多重检测。需要强调的是，该方案不太适用于单一位点的DNA FISH。对于单一位点的检测，必须对样本进行蛋白酶消化，而这种消化显然与免疫荧光（IF）或荧光蛋白（FP）检测不兼容¹⁹。然而，采用类似方法实现IF与mRNA FISH的联合检测已取得成功；在此情况下，显然必须省略RNase处理步骤。

最后，显然原位端粒FISH正迅速成为检测ALT状态的一项必要检测方法^20,21。与基于群体的C环检测不同²²，原位端粒FISH可在细胞水平上提供ALT的读数，从而灵敏地检测ALT动态变化。将原位端粒FISH与免疫荧光（IF）及荧光蛋白（FP）表达相结合，可揭示ALT机制的重要见解。我们希望，随着时间推移，这些见解将为依赖ALT维持端粒的肿瘤带来靶向治疗手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% Tween-20	Bio-Rad	1610781	若溶液浑浊，请弃用。
10x PBS	Gibco	70011044	用于制备固定剂及其他缓冲液（固定后使用）
12孔细胞培养板	Nunc	150628
16% 无甲醇甲醛	Thermo Scientific	28908
5 M 氯化钠	Millipore Sigma	S6546
贴壁细胞，例如 U2OS 骨肉瘤细胞	ATCC	HTB-96
密闭盒（用于湿化室）	Mepal	106415032500	任何合适的密闭盒均可使用，但需注意避免底部不平整的盒子。
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
铝箔	Fisher Scientific	01-213-100
合适的细胞培养基，例如 McCoy's 5A	Gibco	16600082	对于 U2OS 细胞，添加 15% FBS
着丝粒探针（FAM）	PNA Bio	F3001	多种荧光染料可选
ChromoTek Nuclear Actin-Chromobody 质粒（TagGFP）	Proteintech	acg-n
盖玻片压平器	Fine Science Tools	11251-33
盖玻片架	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	D21490	可选，仅在封片剂不含DNA染料时使用
驴血清	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EGTA	Bio-World	40520008	0.5 M 溶液，pH 8.0
乙醇	Warner-Graham	200 Proof
胎牛血清	Gibco	A5670801
纤连蛋白	Millipore Sigma	F0635	用于盖玻片的可选包被
甲酰胺	Millipore Sigma	47671-250ML-F
德国玻璃盖玻片	Warner Instruments	64-0714	CS-18R15（#1.5 厚度，请确认适用于您的显微镜）
GFP Booster	Proteintech	gb2AF488	识别 GFP/mClover/YFP/Venus 等。  完整列表请参见产品信息
带盖玻璃染色皿	Millipore Sigma	900203
带数字计时器的加热超声清洗仪	Branson	CPX-952-218R	该型号浴式超声仪具备加热功能，但无法调节功率或强度。
盐酸	Millipore Sigma	258148	浓 HCl 浓度为 12 N。  取 20 mL 浓 HCl 加入 220 mL 去离子水中，配制成 1 N HCl
氯化镁溶液	Millipore Sigma	63069	1 M 溶液
MES	Millipore Sigma	475893
甲醇	Millipore Sigma	179337
Parafilm 封口膜	USA Scientific	3023-4526
氯化钾	Millipore Sigma	P9541
一抗  小鼠抗-PML	Santa Cruz	sc-377390
一抗  兔抗-53BP1	Novus	NB100-904
一抗  兔抗-PML	ABclonal	A1184
Prolong Glass 含 NucBlue	Invitrogen	P36981
RFP Booster	Proteintech	rb2AF568	识别 mRFP/mCherry/mKate2/mPlum。  完整列表请参见产品信息
RNase A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Roche 封闭液	Millipore Sigma	11096176001
二抗 例如 AF488 标记抗小鼠抗体	Invitrogen	A-11001	或类似产品
二抗 例如 AF594 标记抗兔抗体	Invitrogen	A-11012	或类似产品
二抗 例如 AF647 标记抗小鼠抗体	Invitrogen	A-21235	或类似产品
刮勺	Fisher Scientific	10257402
无菌 PBS	Gibco	14190144	用于制备盖玻片
蔗糖	Millipore Sigma	S0389
TelC 探针（Cy3）	PNA Bio	F1002	多种荧光染料可选
TelG 探针（AF647）	PNA Bio	F1014	多种荧光染料可选
Tris 碱	Millipore Sigma	648311	用水配制成 1 M 溶液，用 HCl 调节 pH
吐温 X-100	Millipore Sigma	X100
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200072
Zeiss Elyra 显微镜	Zeiss		或类似设备