方法文章

大规模平行剪接测定，用于检查疾病相关内含子变异引起的剪接错误

DOI：

10.3791/68984

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2025年9月9日

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1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了一种用于执行大规模平行剪接测定 （MaPSy） 的详细方案，该方案采用微型基因构建体来系统地批量评估内含子变体。这种方法能够通过扩增子测序对细胞中变体诱导的剪接变化进行高通量分析，从而对其对前 mRNA 剪接的影响进行功能评估。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

剪接错误占导致罕见遗传性疾病的致病突变的 10-30%。RNA 剪接通过选择性地连接外显子和去除内含子来确保正确的基因表达，关键调控序列位于内含子内。5'剪接位点和分支位点与小核RNA相互作用形成剪接体的识别复合物，而聚嘧啶束和剪接增强子/沉默子等元件则招募蛋白质来调节剪接体组装。由于这些相互作用的复杂性，预测内含子变体的剪接中断具有挑战性。

内含子变异占人类天然基因变异的 90%，可能会破坏经典剪接并引起疾病。为了研究这种可能性，我们开发了一种大规模平行剪接测定 （MaPSy） 来评估患者鉴定的内含子变异。将合成的具有参考或变异序列的寡核苷酸连接到含有启动子和聚腺苷酸化信号的剪接小基因中。每个构建体包括两个恒定的外显子，位于中间外显子两侧，该外显子包含感兴趣的可变内含子-外显子连接序列。将变体序列的细胞剪接效率与参考对应物进行了比较，使我们能够将重大破坏识别为剪接变体。

MaPSy 的结果可以通过其他方法进行验证，例如小基因测定或 CRISPR 介导的 体内基因组编辑。此外，对断裂连接的聚集分析可以更深入地了解剪接机制和与剪接错误相关的疾病的分子基础。

引言

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RNA剪接是一个关键过程，它连接外显子进行翻译并去除内含子，促进RNA输出和维持核酸稳态。这种严格调节的机制以时间和空间方式运作，有助于转录组的多样性和复杂性1。剪接由关键信号引导，包括 5' 剪接位点 （5'ss）、分支位点和 3' 剪接位点 （3'ss），以及其他调节元件，例如分支位点下游的聚嘧啶束和 AG 二核苷酸排除区，有助于识别 3's2。从机制上讲，U1 小核 RNA （snRNA） 与 5'ss 配对，而分支位点与 U2 snRNA3 相互作用。分支位点、聚嘧啶束和3'ss的协调活性促进了U2小核蛋白（snRNPs）和U2辅助因子的结合，稳定了剪接体，定位了对5'ss的亲核攻击的分支点，从而启动了剪接。

随着测序技术的快速进步，全基因组测序的成本不断下降，导致人类遗传变异的目录不断扩大。据估计，罕见遗传性疾病中 10-30% 的疾病相关突变会影响 RNA 剪接 4,5,6，通常产生可作为治疗靶点的异常基因产物。然而，由于剪接信号的复杂性，评估内含子变体的功能影响仍然具有挑战性，剪接信号通常是冗余和简并的。虽然 5' 和 3' 剪接位点的....

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方案

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1. MaPSy寡核苷酸（寡核苷酸）文库的合成

  1. 基本寡核苷酸结构：设计 155-nuncleotide （nt） 库中的每个寡核苷酸，以包括一个 35-nt 外显子序列和一个 80-nt 内含子序列，形成一个 115-nt 基因特异性区域，两侧是 20-nt 的共同引发序列在每一端（图 2A）。
  2. 变体收集：为了保持基序完整性并关注影响剪接的调节区域，收集具有以下特征的内含子变体：
    从 3 的 -78 到 +10 nt
    从 5 到 30 到 +5 nt
    注意：临床变异可来自 ClinVar19、dbSNP20 中的低频条目、相关出版物和其他临床数据库。基因组坐标可用于将变异与所需的基因组区域相交（例如，使用 BEDTools21）。应仅选择 15 nt 以下的单核苷酸多态性 （SNP） 和小插入/缺失 （插入缺失），以尽量减少寡核苷酸池内的大小变异性以进行批量合成。
  3. 基本小基因结构：为了保留剪接连接结构，每个小基因主链包含三个外显子：两个编码 EGFP 片段的恒定外外显子（来自 pGint，Addgene Plasmid #24217）和一个源自人 CAMTA2 外显子 15 的中间外显子（

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结果

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在MaPSy构建体的细胞剪接之后，剪接和未剪接的产物都以混合物的形式存在。由于文库的大小多样性和非经典剪接的潜力，两种类型的产物在凝胶上可能显得有些弥散。在靶向3'端的构建体中，包含部分腺病毒序列的第二个内含子倾向于非常稳健地剪接（图4A）。

在MaPSy实验中，大约10-30%的疾病相关变异表现出剪接改变，大多数重要病例显示典型剪接效率降低（图4B）。尽管非经典剪接可能会适度改变剪接变体池，但在分析中包括这些事件对于识别在剪接位点竞争框架内促进非典型剪接位点的变体至关重要（图4C）。先前的一项研究表明，选择 3 的 ss 对邻近区域突变的竞争特别敏感17。

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讨论

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MaPSy 构建体中的固有 EGFP 信号能够对外显子跳跃进行基于荧光的检测。如果中间外显子或内含子中的序列促进外显子跳跃，则第一个和第三个外显子的连接会产生FACS可检测到的EGFP信号，使其成为识别影响外显子跳跃的变体和促进剪接变体的基于显微镜可视化的宝贵方法13。然而，本文描述的扩增子测序方法不能捕获外显子跳跃产物，因为它们缺乏文库信息，因此不会对它们进行测序。因此，我们的方法不能直接识别诱导外显子跳跃的变体。然而，根据之前的分析，减少经典剪接的变体通常会触发多个非经典剪接事件，包括非经典剪接位点的使用和外显子跳跃17,27。因此，即使不检测外显子跳跃事件，我们的扩增子测序方法也能可靠地识别剪接变体。

与基于FACS的检测相比，扩增子测序在识别非经典剪接位点使用方面更加稳健。基于FACS的测定依赖于中间外显子包涵来破坏EGFP阅读框，使它们对剪接.......

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

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本研究的经费由中央研究院大挑战种子基金（AS-CDA-108-M03、AS-PH-109-01-3 和 AS-GCS-113-L03）、台湾国立卫生研究院职业发展奖（NHRI-EX112-10908BC）和国家科学技术委员会优秀青年学者研究资助和吴大佑纪念奖提供资助。 台湾（MOST 112-2628-B-001-009-MY3 和 108-2118-M-001-013-MY5）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Direct-zol RNA MiniPrep Plus 试剂盒Zymo研究R2072
杜尔贝科's 改装鹰's 培养基 （DMEM）赛默飞世尔科技11965084
胎牛血清 （FBS）赛默飞世尔科技26140079
L-谷氨酰胺赛默飞世尔科技A2916801 
脂外毒素 3000 赛默飞世尔科技L3000015
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技15140122
pGint质粒阿德基因24217
Phusion 高保真 DNA 聚合酶赛默飞世尔科技F530L
QIAquick 凝胶提取试剂盒洽根28706
QIAquick PCR纯化试剂盒 洽根28106
QIAxcel DNA 筛选试剂盒 （2400）洽根929004
SuperScript IV 逆转录酶赛默飞世尔科技18090010

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant br....

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Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

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