本文介绍了一种用于执行大规模并行剪接检测（MaPSy）的详细方案，该方法利用微型基因构建体对大量内含子变异进行系统性评估。该方法通过扩增子测序在细胞中实现对变异所致剪接变化的高通量分析，从而对这些变异对前体mRNA剪接的影响进行功能评价。
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本文介绍了一种用于执行大规模并行剪接检测（MaPSy）的详细方案，该方法利用微型基因构建体对大量内含子变异进行系统性评估。该方法通过扩增子测序在细胞中实现对变异所致剪接变化的高通量分析，从而对这些变异对前体mRNA剪接的影响进行功能评价。
剪接错误占导致罕见遗传病的致病性突变的10%至30%。RNA剪接通过选择性连接外显子并去除内含子来确保正常的基因表达，其中关键的调控序列位于内含子内部。5'剪接位点和分支位点与小核RNA相互作用，形成剪接体的识别复合物，而多嘧啶 tract 及剪接增强子/沉默子等元件则招募蛋白质以调控剪接体的组装。由于这些相互作用的复杂性，从内含子变异预测剪接破坏具有挑战性。
内含子变异占人类自然基因变异的90%，可能破坏经典的剪接过程并导致疾病。为了研究这种可能性，我们开发了一种大规模并行剪接检测方法（MaPSy），用于评估在患者中发现的内含子变异。含有参考序列或变异序列的合成寡核苷酸被连接到包含启动子和多聚腺苷酸化信号的剪接迷你基因中。每个构建体包含两个恒定外显子，中间夹着一个外显子，该外显子包含感兴趣的可变内含子-外显子连接序列。通过将变异序列的细胞剪接效率与相应的参考序列进行比较，我们能够识别出对剪接产生显著影响的剪接变异体。
MaPSy 的结果可通过其他方法进行验证，例如微基因检测或 CRISPR 介导的基因组编辑 体内此外，对断裂连接位点的汇总分析可为剪接机制及与剪接错误相关的疾病分子基础提供更深入的见解。
RNA剪接是一个关键过程，通过连接外显子以供翻译，并移除内含子，从而促进RNA的核输出并维持核酸稳态。这一高度调控的机制以时空特异性方式运作，有助于转录组的多样性和复杂性1。剪接过程由多个关键信号引导，包括5'剪接位点（5'ss）、分支位点和3'剪接位点（3'ss），以及诸如分支位点下游的多嘧啶 tract 和AG二核苷酸排除区等辅助调控元件，这些元件有助于3'ss的识别2。在机制上，U1小核RNA（snRNA）与5'ss配对，而分支位点则与U2 snRNA相互作用3。分支位点、多嘧啶 tract 和3'ss的协同作用促进了U2小核核糖核蛋白（snRNPs）及U2辅助因子的结合，稳定剪接体结构，并将分支点定位，使其对5'ss发起亲核攻击，从而启动剪接反应。
随着测序技术的快速发展，全基因组测序的成本持续下降，导致人类遗传变异的目录不断扩大。据估计，在罕见遗传病中，有10%-30%的致病突变会影响RNA剪接4,5,6，常常产生异常的基因产物，这些产物可能成为治疗靶点。然而，由于剪接信号复杂，且通常具有冗余性和简并性，评估内含子变异的功能影响仍然具有挑战....
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1. MaPSy 寡核苷酸（oligo）文库的合成
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细胞剪接MaPSy构建体后，剪接产物和未剪接产物以混合物形式同时存在。由于文库存在大小多样性以及可能发生非经典剪接，这两类产物在凝胶电泳中均可能呈现一定程度的弥散。在靶向3'端的构建体中，含有部分腺病毒序列的第二个内含子通常能够非常高效地发生剪接（图4A）。
在MaPSy实验中，大约10-30%的疾病相关变异体会表现出剪接改变，其中大多数显著情况显示出经典剪接效率降低（图4B）。尽管非经典剪接可能轻微改变剪接变异体的分布，但在分析中纳入这些事件对于识别在剪接位点竞争框架下促进非经典剪接位点的变异体至关重要（图4C）。先前一项研究指出，3'剪接位点的选择特别容易受到邻近区域突变竞争的影响17。
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MaPSy 构建体中的内源性 EGFP 信号可实现基于荧光的外显子跳跃检测。如果中间外显子或内含子序列促进外显子跳跃，则第一和第三外显子的连接将产生可通过 FACS 检测到的 EGFP 信号，这使其成为识别影响外显子跳跃变异体的有价值方法，并有助于基于显微镜观察剪接变异体13。然而，本文所述的扩增子测序方法无法捕获外显子跳跃产物，因为这些产物缺乏文库信息，因此不会被测序。因此，我们的方法不能直接鉴定诱导外显子跳跃的变异体。尽管如此，根据先前的研究分析，削弱经典剪接的变异体通常会引发多种非经典剪接事件，包括非经典剪接位点的使用和外显子跳跃17,27。因此，即使不检测外显子跳跃事件，我们的扩增子测序方法仍能可靠地鉴定剪接变异体。
与基于FACS的检测方法相比，扩增子测序在识别非经典剪接位点使用方面更具稳健性。基于FACS的检测依赖于中间外显子的插入来破坏EGFP的阅读框，因此对剪接信号的细微变化敏感性较低。此外，基于FAC.......
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作者声明无利益冲突。
本研究的经费支持来自中央研究院的职业发展奖、多学科健康云研究计划、重大挑战种子基金（AS-CDA-108-M03、AS-PH-109-01-3 和 AS-GCS-113-L03）、中国台湾国家卫生研究院职业发展奖（NHRI-EX112-10908BC），以及中国台湾国家科学及技术委员会的优秀青年学者研究计划和吴大猷纪念奖（MOST 112-2628-B-001-009-MY3 和 108-2118-M-001-013-MY5）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus 试剂盒 | Zymo Research | R2072 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| pGint 质粒 | Addgene | 24217 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530L | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 | |
| QIAxcel DNA 筛查试剂盒（2400） | Qiagen | 929004 | |
| SuperScript IV 逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18090010 |
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