大规模平行剪接测定，用于检查疾病相关内含子变异引起的剪接错误

摘要

在这里，我们提出了一种用于执行大规模平行剪接测定 （MaPSy） 的详细方案，该方案采用微型基因构建体来系统地批量评估内含子变体。这种方法能够通过扩增子测序对细胞中变体诱导的剪接变化进行高通量分析，从而对其对前 mRNA 剪接的影响进行功能评估。

摘要

剪接错误占导致罕见遗传性疾病的致病突变的 10-30%。RNA 剪接通过选择性地连接外显子和去除内含子来确保正确的基因表达，关键调控序列位于内含子内。5'剪接位点和分支位点与小核RNA相互作用形成剪接体的识别复合物，而聚嘧啶束和剪接增强子/沉默子等元件则招募蛋白质来调节剪接体组装。由于这些相互作用的复杂性，预测内含子变体的剪接中断具有挑战性。

内含子变异占人类天然基因变异的 90%，可能会破坏经典剪接并引起疾病。为了研究这种可能性，我们开发了一种大规模平行剪接测定 （MaPSy） 来评估患者鉴定的内含子变异。将合成的具有参考或变异序列的寡核苷酸连接到含有启动子和聚腺苷酸化信号的剪接小基因中。每个构建体包括两个恒定的外显子，位于中间外显子两侧，该外显子包含感兴趣的可变内含子-外显子连接序列。将变体序列的细胞剪接效率与参考对应物进行了比较，使我们能够将重大破坏识别为剪接变体。

MaPSy 的结果可以通过其他方法进行验证，例如小基因测定或 CRISPR 介导的 体内基因组编辑。此外，对断裂连接的聚集分析可以更深入地了解剪接机制和与剪接错误相关的疾病的分子基础。

引言

RNA剪接是一个关键过程，它连接外显子进行翻译并去除内含子，促进RNA输出和维持核酸稳态。这种严格调节的机制以时间和空间方式运作，有助于转录组的多样性和复杂性¹。剪接由关键信号引导，包括 5' 剪接位点 （5'ss）、分支位点和 3' 剪接位点 （3'ss），以及其他调节元件，例如分支位点下游的聚嘧啶束和 AG 二核苷酸排除区，有助于识别 3's2^。从机制上讲，U1 小核 RNA （snRNA） 与 5'ss 配对，而分支位点与 U2 snRNA³ 相互作用。分支位点、聚嘧啶束和3'ss的协调活性促进了U2小核蛋白（snRNPs）和U2辅助因子的结合，稳定了剪接体，定位了对5'ss的亲核攻击的分支点，从而启动了剪接。

随着测序技术的快速进步，全基因组测序的成本不断下降，导致人类遗传变异的目录不断扩大。据估计，罕见遗传性疾病中 10-30% 的疾病相关突变会影响 RNA 剪接 ^4,5,6，^通常产生可作为治疗靶点的异常基因产物。然而，由于剪接信号的复杂性，评估内含子变体的功能影响仍然具有挑战性，剪接信号通常是冗余和简并的。虽然 5' 和 3' 剪接位点的特征相对较好，但分支位点、聚嘧啶束和其他剪接调节元件在高等真核生物中表现出相当大的序列和位置变异性。大规模映射研究进一步证明，单个内含子 ^7,8,9,10 内可以存在多个分支位点，这使得内含子-外显子边界变化的解释变得复杂。

深度学习已被用于评估一级序列如何促进剪接位点识别 ^4,11,12，揭示剪接变体聚集在规范剪接位点，同时稀疏地延伸到外显子和内含子的 3' 区域。这种模式符合既定的理解，即 5' 剪接位点选择主要由共有序列决定，而 3' 剪接位点识别取决于其他内含子元件，例如分支位点和聚嘧啶束。然而，现有模型经过训练，可以区分组成型剪接位点与替代或人工剪接位点，而不是专门关注内含子变体。因此，这些计算工具仅显示出中等的预测准确性，主要识别剪接位点和外显子剪接变体 13,14,15,16。除了预测模型之外，能够批量验证剪接变异的实验系统将显着增强剪接缺陷的识别和表征。

将疾病相关内含子变体与剪接表型联系起来的综合 RNA 测序数据仍然稀缺，因为它们的频率低且难以从现有数据集中预测剪接结果。为了解决这一差距，已经开发了高通量剪接测定和计算模型来系统地分析剪接变体。大规模平行剪接报告基因测定 （MaPSy） 旨在评估可变序列对剪接位点选择的影响。通过在 5' 和 3' 剪接位点附近或跨越固定小基因主链内的整个内含子-外显子区域合并序列变异，MaPSy 能够对剪接改变进行功能评估。然而，由于大量寡核苷酸合成的局限性，这种方法无法捕获深度内含子变体和假外显子激活。

MaPSy 的鲁棒性已使用 70 个独立的剪接小基因进行了验证，得出 0.89¹⁷ 的 Pearson 相关性。值得注意的是，大约 90% 的剪接供体变体（+1 和 +2）表现出剪接缺陷，凸显了该测定的准确性。此外，具有随机分支位点序列的MaPSy揭示了分支位点识别的退化性质及其对U2核心蛋白的依赖¹⁸。此外，分裂 GFP MaPSy 设计与荧光激活细胞分选 （FACS） 相结合，已被用于研究由遗传变异引起的外显子跳跃事件。这种方法表明，54% 的剪接破坏变体存在于内含子区域，包括经典剪接位点¹³，强调了内含子元件在剪接调节中的重要作用。总的来说，这些发现强化了内含子序列在剪接控制中的重要性，并证明了MaPSy在识别疾病相关剪接缺陷方面的效用（图1）。

图1：近外显子内含子突变的大规模平行剪接测定（MaPSy）的实验设计。 收集人类疾病数据库中记录的变异并合成为 5,307 对寡核苷酸。每个寡核苷酸对都包含一个参考和一个跨越 78 核苷酸 （nt） 内含子和 35-nt 外显子区域的变异等位基因。寡核苷酸的两侧是用于扩增和连接成 3 外显子剪接小基因的共同引发位点。因此，合成区域包括小基因的第二个外显子的3'ss。小基因组装后，将混合的小基因剪接到人胚胎肾 （HEK293T） 细胞中。收获所得剪接的亚型并通过扩增子测序进行分离。该图已经 Chiang 等人许可改编 ¹⁷。 请点击此处查看此图的大图。

方案

1. MaPSy寡核苷酸（寡核苷酸）文库的合成

1. 基本寡核苷酸结构：设计 155-nuncleotide （nt） 库中的每个寡核苷酸，以包括一个 35-nt 外显子序列和一个 80-nt 内含子序列，形成一个 115-nt 基因特异性区域，两侧是 20-nt 的共同引发序列在每一端（图 2A）。
2. 变体收集：为了保持基序完整性并关注影响剪接的调节区域，收集具有以下特征的内含子变体：
   从 3 的 -78 到 +10 nt
   从 5 到 30 到 +5 nt
   注意：临床变异可来自 ClinVar¹⁹、dbSNP²⁰ 中的低频条目、相关出版物和其他临床数据库。基因组坐标可用于将变异与所需的基因组区域相交（例如，使用 BEDTools²¹）。应仅选择 15 nt 以下的单核苷酸多态性 （SNP） 和小插入/缺失 （插入缺失），以尽量减少寡核苷酸池内的大小变异性以进行批量合成。
3. 基本小基因结构：为了保留剪接连接结构，每个小基因主链包含三个外显子：两个编码 EGFP 片段的恒定外外显子（来自 pGint，Addgene Plasmid #24217）和一个源自人 CAMTA2 外显子 15 的中间外显子（图 2B）。用BamHI和SalI限制性内切酶消化CAMTA2片段和pGint，并将CAMTA2片段连接到EGFP外显子之间的pGint中，创建pGint-CAMTA2三外显子小基因（补充文件1）。
   注意：中间外显子，即 CAMTA2 外显子 15，在靶细胞中表达时应表现出中等剪接效率。这一特性至关重要，因为它提供了平衡的基线，可以检测由于变异效应而导致的剪接效率的增加和降低。
4. 引发位点设计：将插入位点序列附加到文库的两端，使每个寡核苷酸包含~20-nt侧翼序列，这些序列与中间外显子/内含子内的预期插入位点重叠（图2A）。
   注意：如果寡核苷酸池是为多个小基因构建体设计的，则可以掺入多个引发位点。
5. 条形码设计：对于内含子变体，外显子条形码对于区分基因型和剪接产物至关重要，因为内含子序列在剪接后会丢失。为避免由于条形码序列（即条形码效应）而导致的任何剪接改变，请将条形码放置在外显子内的远端，远离剪接位点（即紧邻外显子引发位点）。
   注意：建议尽可能在每个变体中使用多个条形码。所需的条形码长度取决于库的复杂性。例如：
   如果参考等位基因仅与一个变体配对，则 1-nt 条形码就足够了。
   如果参考等位基因与六种不同的变体配对，则 2-nt 条形码更可取。
   具有与单个参考等位基因密切相关的多个变体（例如，仅相差一个核苷酸）的文库可能会增加分析的复杂性。
6. 对寡核苷酸进行排序：以 FASTA 文件格式对寡核苷酸进行排序，每个变体连接与其参考等位基因配对。
   注意：对于具有多个变体的连接，每个连接只需要一个参考等位基因。GeneScript （https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html）、Twist Bioscience （https://www.twistbioscience.com/products/oligopools）、IDT （https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools） 和 Agilent （https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis） 等公司提供合并序列合成服务。合成长度、文库容量和成本可能因提供商和地区而异。

图 2：MaPSy 的寡核苷酸和剪接小基因设计。（A） 内含子 3' 或 5' 端的混合寡核苷酸合成设计。这些图说明了 155-nt 寡核苷酸的基本结构。寡核苷酸合成的实际产能取决于选择生产的公司。 （B） MaPSy小基因的设计。从pGint质粒（i）修饰三外显子小基因（ii），剪接位点被混合寡核苷酸取代，引入剪接信号变异（iii）。 请点击此处查看此图的大图。

2. MaPSy文库DNA模板的构建

1. 接收寡核苷酸池后的初始扩增
   1. 收到寡核苷酸池后，使用高保真DNA聚合酶通过100μL聚合酶链反应（PCR）扩增10-50ng具有设计侧翼引发位点的寡核苷酸文库，将寡核苷酸转化为双链（ 表1中的LibF和LibR引物， 表2中的热循环仪设置）。
   2. 使用纯化柱净化PCR产物。详细地，将PCR产物结合到柱膜上，然后用含有70%乙醇的缓冲液洗涤，以去除残留的引物，盐和聚合酶。最后，使用低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱纯化的PCR产物。
   3. 通过凝胶电泳验证扩增的寡核苷酸大小。将 5 μL 纯化的 PCR 产物上样到在 1× TAE 缓冲液（40 mM Tris 碱、20 mM 乙酸、1 mM EDTA、pH 8.0）中制备的 1.5% 琼脂糖凝胶上。
      注意：将 PCR 扩增周期限制为 15 次，以防止过度扩增和 PCR 偏差。次级模糊条带通常大于目标产物，可能表明寡核苷酸池内的过度扩增和不完全退火。保存一部分 PCR 产物并对寡核苷酸池进行测序，以评估质量和错误率，然后再继续（停止点）。
2. MaPSy剪接小基因的构建 - 初始PCR。
   1. 骨架片段：使用 0.5 ng 的 pGint-CAMTA2 质粒骨架作为两个主要 PCR 片段的来源
      1. PCR产物1：扩增CMV启动子，第一个外显子（N端EGFP）和第一个内含子的一部分（表1 和 表2）。
      2. PCR产物3：扩增部分中间外显子（CAMTA2外显子15），第二内含子，第三外显子（C端EGFP）和SV40聚腺苷酸化信号（图3，表1和 表2）。
   2. 文库扩增子：PCR产物2：对于3的文库，扩增两端具有重叠序列的文库扩增子，以匹配PCR产物1和PCR产物3的内端，从而在CAMTA2外显子15的3处进行有效整合（图3，表1和表2）。
      注意：对于 5'ss 文库，用文库序列替换中间外显子连接的 5' 端。
3. PCR后，使用纯化柱（如步骤2.1.2）净化所有产物。为防止模板载体污染，请通过琼脂糖凝胶提取从 PCR1 和 PCR3 中纯化所需产物。具体地，电泳后，切除~100mg含有目标PCR产物的琼脂糖凝胶，并将其溶解在结合缓冲液中。将溶解的凝胶溶液结合到柱膜上，然后继续执行标准 PCR 纯化方案。
4. MaPSy剪接小基因的构建- 重叠延伸PCR：进行一轮或连续一轮重叠PCR，将三个主要片段（PCR产物1，文库扩增子和PCR产物3;各使用~20ng作为模板）连接成全长剪接小基因（ 使用表1中最外侧的引物CAMGFPF和CMVGFPR，以及 表2中的热循环仪设置）。
   注意：最终产物包含 CMV 启动子和三个外显子，前 3 个外显子源自寡核苷酸文库，并且可用于基于细胞的实验。
5. 组装后，使用 PCR 纯化柱净化全长 DNA 模板。如果在凝胶中观察到非特异性条带，则执行凝胶提取以精确分离所需的全长产物，如步骤2.3。
   注意：文库中高度相似的序列可能会导致组装不完整。如果在单个 PCR 反应中完全组装很困难，可以尝试顺序重叠的 PCR（从两个片段开始，然后添加第三个片段）。为了提高 PCR 特异性，请考虑调整退火温度或实施触点 PCR 以增强复杂模板的结合特异性。准备足够的MaPSy构建体以进行至少四个独立的实验。保存每个构建体的一小部分等分试样用于下一代测序以验证序列完整性，因为某些寡核苷酸可能无法有效扩增并导致组装不完整（终止点）。

图3：文库构建的工作流程。（A） 重叠PCR中使用的引物（另见 表1）。 （B） 重叠PCR的程序。简而言之，寡核苷酸库和剪接小基因的其他部分通过 25 个 PCR 循环扩增。通过使用 20 个扩增循环重叠 PCR，将含有启动子和第一个外显子（PCR 产物 1）的片段缝合到寡核苷酸池（PCR 产物 2）上。然后，使用20个扩增循环将缝合的产物（PCR产物1+2）进一步缝合到含有^第3个 外显子和聚腺苷酸化信号（PCR产物3）的片段上，以获得最终构建体（PCR产物1+2+3）。该图已经 Chiang 等人许可改编 ¹⁷。 请点击此处查看此图的大图。

MaPSy文库引物的构建		注意
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	PCR产物1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	PCR产物1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR产物2
图书馆	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR产物2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	PCR产物3
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	PCR产物3
用于扩增子测序的 MaPSy 文库 PCR 引物
P7-Lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTataagagacagnnncgaaggctcctgtctctgtagt
验证入门
Lib0F（库验证）	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R（库验证）	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

表1：本协议中使用的引物。

PCR反应混合物
组件	卷
ddH2O	13.4 微升
5x HF 缓冲液	4 μL
10 mM dNTP	0.4 微升
正向引物 10 μM	0.5 μL
反向引物 10 μM	0.5 μL
cDNA	1 μL
高保真 DNA 聚合酶	0.2 微升

运行 PCR 程序（20 μL 反应）
	临时	时间	周期
初始变性	98°C	1分钟	1
变性	98°C	30 秒	10–20
退火	65°C	30 秒
外延	72°C	30 秒	返回变性
最终扩展	72°C	5 分钟	1
拿	4°C	拿	拿

表 2：热循环仪设置。

3. 哺乳动物细胞剪接小基因的表达和回收

1. 细胞培养：在37°C下，将HEK293T细胞维持在补充有10%胎牛血清（FBS），100单位/ mL青霉素和链霉素以及2mM L-谷氨酰胺的5%CO₂ 中的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中。
2. 剪接小基因的转染：
   1. 在转染前 24 小时将 5 × 10⁵ HEK293T 细胞接种在 6 孔板中的 2 mL 培养基中。
   2. 用 1-2 μg MaPSy 构建体转染细胞，按照制造商的方案，用 3.75 μL 转染试剂预孵育 5 分钟。成功转染由剪接文库中 EGFP 信号的存在来指示。
   3. 转染后 24 小时使用 250 μL Trizol（或等效物）裂解细胞。
3. RNA 提取：按照制造商的方案，使用 RNA 小量制备试剂盒提取总 RNA。具体而言，将Trizol中的RNA结合到柱膜上，用含有70%乙醇的缓冲液洗涤以去除盐、蛋白质和其他杂质，并使用低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱纯化的RNA。
   注意：Trizol（或等效物）具有强腐蚀性和毒性。接触会导致严重的化学灼伤、永久性疤痕和肾功能衰竭。
   注意：RNA可以在-80°C下储存在Trizol（或等效的基于Trizol的试剂，例如TOOLS的TOOLSmart RNA提取器）中长达一年（停止点）。如果冻融循环最小化（停止点），纯化的 RNA 可以在 -80 °C 下储存长达两年。
4. 逆转录：按照制造商的方案，使用逆转录酶和随机六聚体从 2 μg 总 RNA 制备 cDNA。具体地，将RNA与50μM随机六聚体在室温下孵育10分钟以进行退火，然后在55°C下进行逆转录10分钟。
   注意：cDNA可以在-20°C下储存长达一年（停止点）。
5. 剪接的微型基因的扩增：使用剪接的微型基因的特定启动序列进行PCR（表2）。使用在琼脂糖凝胶上可视化产品所需的最小循环次数。
   注意：凝胶上应可见未剪接和剪接产物的混合条带。由于DNA物种的混合种群，条带可能出现弥漫性（图4A）。
6. 使用纯化柱（如步骤2.1.2）纯化PCR产物。
7. 连接测序适配器：执行最后一轮 PCR 以将测序适配器序列连接到扩增子末端。在扩增子末端包含 0-3 个随机核苷酸，以确保在 NextSeq 平台上平衡荧光检测（表 1）。
8. 使用纯化柱（如步骤2.1.2）纯化PCR产物。

4. 扩增子测序和分析

1. 短读长测序：通过核心设施或商业服务，使用 Illumina Miseq、Novaseq 或同等产品对 PCR 扩增子进行 150 个双端测序。
2. 对准：
   1. 创建参考基因组：通过将每个独特的基因型标记为单独的染色体来创建合成“参考基因组”。参考基因组包括扩增子中包含的合成外显子和内含子。
   2. 对齐测序读数：使用 HISAT2 ^22,23 将配对端读数与参考基因组对齐，调整参数以控制剪接特异性元件（有关命令行详细信息，请参阅补充文件 2）。
   3. 选择高质量读取：将 SAM 转换为 BAM 格式，筛选高质量读取（映射质量 ≥60），然后对 BAM 文件²⁴ 进行排序和索引（有关命令行详细信息，请参阅 补充文件 2 ）。
   4. 识别接头连接并计算连接读取：通过从对齐的 BAM 文件中的 CIGAR 字符串中提取外显子跳跃事件来量化剪接连接的使用。根据“N”作识别跨结读取，并汇总每个结坐标和链的读取计数以评估拼接模式（有关命令行详细信息，请参阅 补充文件 2 ）。
   5. 对规范剪接位点进行分类：如果剪接位点与带注释的 GT-AG 连接匹配，则将拼接位点分类为规范位点。
      注意：在极少数情况下，MaPSy 中的参考等位基因可能会使用非经典剪接位点。缺少跨指定剪接位点位置的连接的读取将保留为未拼接的读取。
3. 识别剪接变异的统计分析：将读数分为三组：
   （1）拼接与未拼接的读数;
   （2） 所有拼接读中的规范与非规范;
   （3） 规范与非规范加上未拼接的读取。
   进行双侧 Fisher 精确检验，然后进行错误发现率 （FDR） 校正（表 3），以评估变体对剪接效率和准确性的影响。
4. 过滤高置信度剪接变体：将四个重复序列中 q 值小于 0.05 的超过 100 个读取计数的参考/变体对分类为显着。然后，考虑具有 2 倍比值比变化的候选者，参考或变异等位基因具有 >5% 的未剪接和非规范读数，即高置信度剪接变体（图 4B）。

读	拼接	未拼接和/或非规范
参考	一个	b
变体	c	d

表 3：Fisher 精确检验的二乘二表。

5. 验证

1. 用于验证的微型基因剪接：
   1. 寡核苷酸合成和扩增：单独合成选定 MaPSy 候选序列的 DNA 寡核苷酸（例如，通过集成 DNA 技术）。然后，使用高保真DNA聚合酶通过PCR将使用设计的侧翼序列扩增寡核苷酸为双链（表2）。
   2. 小基因克隆：通过 BbsI 和 SmaI 消化所得 PCR 产物和 pGint-CAMTA2，并通过 DNA 连接酶连接消化产物。
   3. 转染：使用转染试剂将所得构建体转染到HEK293T细胞中，如步骤 3.2.2。
   4. RNA提取：从转染的细胞中提取RNA，如步骤3.3中所述。
   5. 逆转录：使用随机六聚体进行逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR）。
   6. 剪接亚型扩增：使用靶向微型基因前两个外显子的引物扩增剪接亚型（Lib0F 和 Lib0Rl， 表 1， 表 2 中的热循环仪设置）。通过电泳分离扩增产物，并使用 Gel Doc 系统进行可视化。
   7. 定量：使用ImageJ（美国国立卫生研究院）^25,26量化每种剪接亚型的信号强度。或者，使用 DNA 筛选试剂盒和 eGENE HDA-GT12 高性能核酸分析仪来量化 PCR 产物的强度和分子量。
   8. 亚型提取和确认：通过琼脂糖凝胶提取分离各亚型，如步骤2.3，并通过核心设施或商业服务对PCR产物进行Sanger测序确认剪接结果，评估剪接正常，内含子包含和外显子跳跃。
2. 多外显子剪接小基因：
   1. 验证 MaPSy 结果后，选择感兴趣的变体并从基因组 DNA （gDNA） 中克隆 3 到 5 个外显子，为观察到的剪接缺陷提供更基因组背景。
   2. 使用诱变引物和重叠PCR进行定点诱变，以组装在靶位点包含所需序列改变的小基因构建体。
      注意：如果侧翼内含子太长而无法克隆，则为每个剪接位点保留大约 300 nt 的内含子序列，以确保正确的剪接环境。
   3. 如上文 5.1 中所述进行基于细胞的剪接测定。
3. 细胞验证：要验证细胞中的剪接效果，请使用基于模板的 CRISPR 编辑来改变适当细胞模型中所选变体的序列。
   注意：如果可能，使用携带特定变体的人体样本直接评估剪接模式。

结果

在MaPSy构建体的细胞剪接之后，剪接和未剪接的产物都以混合物的形式存在。由于文库的大小多样性和非经典剪接的潜力，两种类型的产物在凝胶上可能显得有些弥散。在靶向3'端的构建体中，包含部分腺病毒序列的第二个内含子倾向于非常稳健地剪接（图4A）。

在MaPSy实验中，大约10-30%的疾病相关变异表现出剪接改变，大多数重要病例显示典型剪接效率降低（图4B）。尽管非经典剪接可能会适度改变剪接变体池，但在分析中包括这些事件对于识别在剪接位点竞争框架内促进非典型剪接位点的变体至关重要（图4C）。先前的一项研究表明，选择 3 的 ss 对邻近区域突变的竞争特别敏感¹⁷。

讨论

MaPSy 构建体中的固有 EGFP 信号能够对外显子跳跃进行基于荧光的检测。如果中间外显子或内含子中的序列促进外显子跳跃，则第一个和第三个外显子的连接会产生FACS可检测到的EGFP信号，使其成为识别影响外显子跳跃的变体和促进剪接变体的基于显微镜可视化的宝贵方法¹³。然而，本文描述的扩增子测序方法不能捕获外显子跳跃产物，因为它们缺乏文库信息，因此不会对它们进行测序。因此，我们的方法不能直接识别诱导外显子跳跃的变体。然而，根据之前的分析，减少经典剪接的变体通常会触发多个非经典剪接事件，包括非经典剪接位点的使用和外显子跳跃^17,27。因此，即使不检测外显子跳跃事件，我们的扩增子测序方法也能可靠地识别剪接变体。

与基于FACS的检测相比，扩增子测序在识别非经典剪接位点使用方面更加稳健。基于FACS的测定依赖于中间外显子包涵来破坏EGFP阅读框，使它们对剪接...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Direct-zol RNA MiniPrep Plus 试剂盒	Zymo研究	R2072
杜尔贝科's 改装鹰's 培养基 （DMEM）	赛默飞世尔科技	11965084
胎牛血清 （FBS）	赛默飞世尔科技	26140079
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	A2916801
脂外毒素 3000	赛默飞世尔科技	L3000015
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122
pGint质粒	阿德基因	24217
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	赛默飞世尔科技	F530L
QIAquick 凝胶提取试剂盒	洽根	28706
QIAquick PCR纯化试剂盒	洽根	28106
QIAxcel DNA 筛选试剂盒 （2400）	洽根	929004
SuperScript IV 逆转录酶	赛默飞世尔科技	18090010