基于重组工程的工程化病毒载体研发与生产用于科研与治疗

摘要

重组工程（recombineering）是一种基于同源重组的基因工程技术，能够对病毒基因组进行精确修饰，而无需依赖酶切消化。该技术在基础研究中具有重要作用，例如实现靶向缺失，同时也可用于开发用于溶瘤治疗、基因治疗和基因疫苗的工程化病毒，从而拓展了科研与临床应用的前景。

摘要

在基础研究和转化研究中，对工程化病毒载体的需求日益增长，凸显了开发灵活、快速且可扩展的重组DNA病毒制备方法的必要性。依赖限制性内切酶消化与连接的策略受限于序列依赖性的限制以及耗时的克隆步骤。本文介绍了一种基于同源重组的遗传工程技术（recombineering），该技术通过在细菌人工染色体（BACs）中实现对病毒基因组的精确且无缝的修饰，从而克服上述局限。该方法可高效地对编码或非编码遗传元件进行删除、插入或替换，为高通量病毒载体开发提供了强大平台。在基础研究应用中，recombineering尤其有价值，例如通过删除或突变病毒基因以研究其功能。更重要的是，该方法能够并行构建数十种携带不同免疫刺激或治疗性载荷的重组病毒，因此特别适用于新型构建体的快速临床前评估。尽管该技术可潜在应用于任何科学目的，本文重点介绍recombineering在两个特定领域的应用：基于单纯疱疹病毒的溶瘤病毒的构建，以及用于基因转移的非复制型腺病毒载体的开发。总之，recombineering为病毒基因组工程提供了一种多功能的方法，显著加速了从设计到功能验证的整个流程。其应用价值涵盖基础病毒学研究到转化医学，以满足不断发展的科研与临床需求。

引言

病毒载体因其能够将遗传物质递送至宿主细胞的天然能力，已成为基因治疗、溶瘤病毒治疗和遗传疫苗开发中的有力工具。它们利用病毒的天然嗜性及转导机制，实现外源基因的瞬时或长期表达。病毒载体能够在细胞外环境中存活，特异性结合细胞表面受体（决定病毒嗜性的关键因素），促进自身内化，劫持宿主细胞的基因表达系统以驱动自身基因的表达，并逃避膜结合及细胞内天然免疫传感器的识别^1,2。通过这一过程，在成功感染后，病毒将细胞转化为病毒子代的生产工厂，使新生成的病毒在机体内扩散，最终导致疾病发生。

通过基因工程，野生型病毒可被改造为一种生物技术工具：其基因组易于操控，可在保留转导能力的同时获得特定的临床效果。根据其临床应用需求，病毒载体可被设计为保留（至少部分保留）或完全丧失复制能力，从而生成复制型或复制缺陷型载体^3,4。

具有复制能力的病毒主要用于溶瘤病毒治疗。癌细胞通常缺乏抗病毒防御机制¹，因此允许通过缺失毒力基因而改造的减毒重组病毒进行复制。这类病毒可在肿瘤组织中选择性复制，同时不损害正常组织。随着对病毒学认识的深入，减毒病毒已逐渐被更精确的基因组修饰技术所取代，这些修饰旨在提高病毒的安全性和治疗效果。

需要对病毒基因组进行外科分子工程改造的研究领域包括：i) 复制条件性溶瘤病毒，其中病毒启动子被替换为肿瘤相关启动子（在肿瘤细胞中过度转录的细胞启动子），从而将病毒基因表达限制在病变细胞中⁵。ii) 改变嗜性的病毒^6,7，可通过修饰包膜糖蛋白或将其替换为抗体片段或配体，以靶向在肿瘤细胞表面过表达的蛋白质^8,9。iii) 武装型溶瘤病毒。溶瘤病毒诱导的肿瘤细胞死亡可引发免疫原性细胞死亡（ICD），其特征是释放炎性介质^1,10和肿瘤抗原¹¹。这些信号可促进免疫系统高效识别肿瘤抗原，恢复免疫监视功能¹²，并可与免疫检查点抑制剂^13,14,15以及其他免疫治疗手段（如基于RNA的疗法和疫苗）联合使用¹⁶。

为了支持这种免疫治疗作用，可将目的转基因除编码于病毒基因组中，从而不仅利用病毒的溶瘤活性，还通过原位表达相关有效载荷来增强其免疫治疗潜力^3,7,17,18,19。这些有效载荷可包括细胞因子、趋化因子、抗体、自杀基因以及抗原^3,20。插入操作需要高度精确，通常优先选择病毒基因组的基因间区域，以尽量减少对病毒基因的干扰，并保持其复制能力和效力⁷。因此，能够筛选最佳插入位点和目的转基因的技术至关重要。

另一方面，在基因治疗或作为遗传疫苗载体所使用的非复制型病毒中，重要的是病毒载体能够在不于宿主细胞内复制的情况下递送目的基因（无论是短暂还是长期表达），以避免毒性²¹。腺病毒载体具有高效的转导能力、强大的外源基因表达水平，以及感染分裂期和非分裂期细胞的能力³。这些特性使其成为开发遗传疫苗的首选载体，包括针对新发传染病（如COVID-19）的疫苗，以及基因替代疗法²²。已上市的腺病毒载体中最著名的例子是牛津-阿斯利康COVID-19疫苗，其商品名为Covishield或Vaxzevria，该疫苗基于一种经过改造的黑猩猩腺病毒ChAdOx1，编码SARS-CoV-2的刺突蛋白。通过肌内注射后，Covishield能够进入细胞并诱导刺突蛋白的表达，从而激活免疫系统，使其针对该蛋白产生免疫应答³。

显然有必要在不受限制性内切酶识别位点约束的情况下对病毒基因组进行修饰。在溶瘤病毒中，基于单纯疱疹病毒1型（Herpes Simplex Virus-1, HSV-1）的载体具有独特优势，包括裂解能力、安全性以及较大的基因组尺寸，可插入较大尺寸的外源基因或多个遗传元件^23,24。除HSV外，许多其他病毒也展现出治疗潜力，Sasso等人最近对此进行了综述³。不同病毒载体平台适用于不同的治疗需求，而非存在一种普适的"最优"载体³。目前，细菌内的同源重组系统或酵母-细菌杂合克隆技术仍是限制性内切酶之外最常用的替代方法，但这些方法步骤繁琐、耗时且效率较低²⁵。

一种新兴的替代方法是使用CRISPR/Cas9技术，该技术最近已被应用于改造病毒基因组，包括痘苗病毒（VV）、单纯疱疹病毒和腺病毒载体。Cas9通过插入缺失突变实现基因失活具有显著优势，但在需要多次切割以删除基因组片段或通过供体DNA插入转基因时，其应用变得不那么实用。此外，基因编辑还受到gRNA设计、在病毒和宿主基因组中的脱靶效应以及对目标区域PAM序列依赖性的限制²⁵。

基于此，并通过单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒的两个实例，本文阐述了重组工程（recombineering）方法，该方法可广泛应用于病毒、噬菌体、复杂质粒以及多种实验系统。重组工程（同源重组介导的基因工程，homologous RECOMBInation-mediated genetic engiNEERING）是一种体内基因工程技术，主要应用于Escherichia coli，利用温度依赖性的噬菌体重组蛋白，催化具有低至30 bp同源序列的DNA元件之间的同源重组²⁶。该方法可实现序列的精确插入、删除或修饰，且不依赖于限制性酶切位点或DNA片段大小。在本文中，我们描述了一种基于热诱导的E. coli菌株SW102的版本，尽管也存在其他具有特定诱导系统的替代菌株²⁷。

重组工程首先通过可控的温度休克处理制备电转化感受态细菌细胞，以激活噬菌体的重组机制。随后将携带适当同源臂的DNA分子通过电穿孔导入细胞。这些DNA可以是通过限制性酶切或PCR产生的双链DNA（dsDNA），也可以是寡核苷酸等单链DNA（ssDNA）。在同源序列和活性重组蛋白共同存在的情况下，能够生成含有目标修饰的新DNA分子。

重组工程分子克隆技术可实现精确的基因工程操作，广泛应用于多种场景，包括在质粒、细菌染色体DNA以及细菌人工染色体（BACs）中插入可筛选或不可筛选的标记。BACs特别适用于克隆较大的基因组片段，如腺病毒和HSV DNA，从而实现病毒载体的快速构建。除转化医学应用外，重组工程还通过允许对病毒基因或蛋白质结构域进行靶向删除、修饰或替换，支持基础科学研究。重组工程也存在一些局限性：较短的同源臂会阻碍重复区域中的重组；PCR扩增的模板可能偶尔引入突变；且目标区域的序列必须已知。

方案

进行重组工程之前，必须获得一种高效的细菌菌株（例如 SW102），该菌株含有目标BAC基因组。尽管重组工程是一种高效富集发生预期修饰菌落的方法，本文中我们描述了一种两步重组工程策略，分别称为第一步和第二步（图1）。在第一步中，将包含正向和负向筛选标记的表达盒插入目标位点；在第二步中，用最终基因组所需的特定遗传修饰替换该表达盒。本研究中使用的筛选标记包括氨苄青霉素抗性（AmpR）、β-半乳糖苷酶活性（β-gal）以及 sacB 基因；然而，可根据研究团队的具体需求，选用任意组合的正向与负向筛选标记。

1. 将筛选盒插入目标区域

1. 第0天
   1. 将含有目标BAC的SW102细胞划线接种于LB琼脂+抗生素（抗生素抗性基因位于BAC中，例如氯霉素12.5 µg/mL）平板上，在32 °C培养箱中过夜培养。
      ​注意：此阶段应避免温度>32 °C，以防诱导重组基因表达。
2. 第1天
   1. 进行PCR扩增AmpR/LacZ/SacB筛选盒。引物设计为：3'端序列用于退火并扩增筛选盒，5'端包含30–80 bp与待修饰病毒基因组区域同源的同源臂（表1）。
      注意：筛选盒以及插入片段可直接向专业供应商订购合成构建体。但需注意避免在BAC内（调控BAC基因）或病毒基因组中存在重复的启动子、终止子或其他遗传元件，以防发生非预期的重组事件。
   2. 通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR片段的身份和纯度（AmpR/LacZ/SacB筛选盒大小为3,400 bp，使用1%琼脂糖凝胶），并确保260/230和260/280比值符合纯核酸标准。
   3. 下午将单个SW102菌落接种至5 mL LB培养基中，32 °C过夜培养。
3. 第2天
   1. 取1–2 mL过夜培养物接种至新鲜的100 mL LB培养基中，将细菌培养至OD₆₀₀为0.55–0.7，定期测定OD₆₀₀，避免错过对数生长期。
   2. 准备42 °C水浴，并将约250 mL无菌ddH₂O预冷至4 °C用于后续洗涤。
   3. 当培养物达到目标OD值时，转移50 mL至洁净锥形管中，在42 °C水浴中孵育15分钟。同时设置未诱导的阴性对照。
      注意：此步骤将诱导λ Red蛋白表达。
   4. 将管子置于冰上10分钟，然后在4 °C下以3,200 × g离心5分钟（包括42 °C诱导组和未诱导组）。
   5. 弃上清，加入40 mL冰冻无菌ddH₂O，重悬沉淀（包括42 °C诱导组和未诱导组）。
   6. 再次离心8分钟（参见步骤1.3.4），重复洗涤步骤（步骤1.3.5）和离心。重复洗涤直至上清液清澈透明（无浑浊或悬浮物），通常需洗涤2–4次。
   7. 最后一次离心后，弃上清，将沉淀重悬于200 µL冰冻无菌ddH₂O中（包括42 °C诱导组和未诱导组）。
   8. 取重悬沉淀的等分试样（HSV-1取50 µL，Adeno取25 µL）转移至预冷的1.5 mL离心管中（包括42 °C诱导组和未诱导组）。加入50–400 ng纯化的PCR产物（体积不超过5 µL）。轻柔混匀后冰上孵育5分钟。
   9. 将上述混合液转移至预冷电转杯中，在2.50 kV（2,500 V，0.2 cm电转杯）条件下进行电穿孔（包括42 °C诱导组和未诱导组）。
   10. 电穿孔后，将细菌转移至1 mL LB培养基中，在32 °C恢复培养1.5小时。向电转杯中加入1 mL LB以清洗残留菌液并全部收集。
   11. 取不同体积的菌液（10、50、200 µL）涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）、X-Gal（20 µg/mL）和IPTG（0.5 mM）的LB琼脂平板上，32 °C过夜培养（ON）。
   12. 准备AMP/X-Gal平板（浓度同步骤1.3.11）以及含蔗糖⁵的平板。
4. 第3天
   注意：此时应观察到菌落生长，且仅在经42 °C诱导并电穿孔转入含筛选盒插入片段的细菌平板上出现蓝色菌落。确认此现象后，需进一步验证部分菌落中筛选盒的完整性。
   1. 选择过夜培养的平板，挑选菌落数<50的平板，以避免挑取多个菌落。挑选多个菌落（通常8–10个足以鉴定出至少一个合适克隆），将其稀释于约50 µL H₂O中。将单个蓝色菌落分别接种于50 µL H₂O中，并划线接种至阴性筛选平板（LB琼脂/蔗糖/氯霉素）和阳性筛选平板（LB琼脂/氨苄青霉素/氯霉素/X-Gal/IPTG）（浓度同步骤1.1.2和1.3.11）（图2）。
      注意：在涂布50 µL菌液的平板上，预期可观察到20–100个菌落。若菌落数较少，并不一定意味着重组效率受损。
   2. 将步骤1.4.1中的水溶液接种至5 mL LB培养基中，同时将平板和LB培养物在32 °C下过夜培养（图2）。
5. 第4天
   1. 仅挑选在Amp/X-Gal平板上生长而在蔗糖平板上不生长的蓝色菌落（图3）。对于这些阳性克隆（表2），取500 µL过夜培养物转移至50 mL新鲜LB培养基中。
6. 第5天
   1. 对每个阳性克隆制备甘油保存管，并提取和纯化BAC质粒（中量提取）。
   2. BAC提取完成后，进行质量控制以确认重组是否正确发生。对插入位点进行Sanger测序。若结果均正确，则进入下一阶段实验。

2. 用目标修饰替换筛选盒

1. 第0天
   1. 将阳性克隆划线接种于LB琼脂平板上，32 °C过夜培养。
2. 第1天
   1. 通过PCR扩增插入片段/修饰序列。使用正向和反向引物，其3'端包含与筛选盒序列互补并用于扩增该片段的序列，5'端则包含与步骤1.3.1中所用相同的30–80 bp同源臂序列。表1).
   2. 通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR片段的同一性和纯度，并确保其260/230和260/280比值符合纯核酸的标准。
   3. 挑取单菌落接种于5 mL LB培养基中，32 °C过夜培养。
3. 第2天
   1. 将2 mL过夜培养物转移至100 mL LB培养基中，于32 °C培养至OD₆₀₀ 达到 0.55–0.7（约 2.5–3 小时）。准备 42 °C 水浴用于诱导，并将约 250 mL 无菌 ddH₂O 冷却至 4 °C₂O 用于洗涤。
   2. 当达到所需OD值后，将50 mL培养物转移至锥形管中，于42 °C水浴孵育15分钟，以诱导λ噬菌体重组蛋白的表达。另取50 mL培养物置于32 °C条件下作为未诱导对照。
   3. 热诱导后，将试管置于冰上10分钟。
   4. 离心8分钟，3,200 × g 在4 °C下（包括42 °C诱导的和未诱导的）
      注意：从此时起，需在冰上操作，以维持SW102细胞的感受态。
   5. 移除上清液，加入40 mL预冷的水，轻轻摇动以重悬沉淀。
   6. 离心5分钟，3,200 × g 在 0–4 °C 下。
   7. 重复洗涤步骤（步骤 2.3.5）一次。
   8. 移去上清液，并在沉淀中加入100 µL水，轻轻重悬。
   9. 将重悬沉淀物的等分试样（HSV-1 为 50 µL，Adeno 为 25 µL）转移至预冷的 1.5 mL 离心管中（包括 42 °C 诱导和未诱导的样品）。加入 50–400 ng 纯化的 PCR 产物（体积不超过 5 µL）。轻轻混匀，冰上孵育 5 分钟。
   10. 将上一步的混合物转移至预冷的比色皿中，并在2.50 kV条件下进行电穿孔（包括42 °C诱导和未诱导的样本）。
   11. 在32 °C、振荡条件下，将细胞置于5 mL LB培养基中复苏4–5小时。
       注意：与第一次重组步骤相比，恢复时间更长，以确保在片段替换后残余的SacB蛋白得以降解。
   12. 在含有蔗糖、X-Gal 和 IPTG（浓度与步骤 1.1.2 和 1.3.11 相同）的 LB 琼脂培养皿上，分别接种不同体积（50、200、500 µL）的培养物。于 32 °C 过夜培养。
4. 第3天
   1. 筛选大量菌落（20–100个），以提高获得成功与携带目标修饰片段及筛选盒发生重组的阳性克隆的概率。采用菌落PCR进行初筛。使用带网格的培养皿，从特定象限中挑取菌落并进行标记（图4).
      注意：一种特别有效的方法是使用一对引物，其中一条引物与靶区域外侧（位于病毒基因组上）退火，另一条则与重组片段内部退火。图5).
   2. 通过琼脂糖凝胶（1.5%）检测PCR扩增产物的存在及大小。
   3. 从正确的象限中挑取阳性克隆，接种于100 mL LB培养基中，于32 °C过夜培养。
5. 第4天：
   1. 进行中量提取质粒，从细菌培养物中提取质粒DNA。
   2. 用限制性内切酶消化质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳分析消化产物的酶切图谱。
   3. 如果消化模式正确，则对病毒基因组的修饰区域进行测序。
   4. 在确认重组克隆的分子身份后，再进行转染并拯救病毒颗粒。

结果

编码IL12的溶瘤性疱疹病毒的构建
如本研究引言部分所述，重组工程的一种潜在应用是将免疫刺激性转基因插入溶瘤病毒基因组中，以增强其免疫治疗潜力。以下，我们以基于HSV-1的溶瘤载体为例，展示此类应用的具体实施。具体而言，本研究探讨了将转基因插入HSV-1基因组Us1-Us2区域内的一个基因间位点的影响。事实上，病毒基因组内的插入可能对病毒功能产生不利影响，导致复制缺陷，从而可能削弱其在体内的抗肿瘤疗效以及生产产量。此类问题最终可能导致生产工艺无法满足临床开发的要求。在本研究中，我们旨在插入一个表达盒，该表达盒包含一个组成型真核启动子（增强型CMV），其后接一段短的5'非翻译区（UTR）、小鼠IL-12的编码序列，以及一个多聚腺苷酸化信号（BGH）。

选择IL-12是基于其对多种具有抗肿瘤活性的免疫细胞群已有充分记录的免疫刺激作用。起始载体为一种完全致病性的靶向性单纯疱疹病毒（Targeted Herpes Virus, THV），并携带重靶向修饰。具体而言，该病毒的糖蛋白D第6至38位氨基酸被替换为靶向肿瘤相关抗原间皮素的SS1抗体的单链可...

讨论

本“重组工程”（RECOMBINEERING，即通过同源重组介导的基因工程）方案采用两步策略：首先，将筛选盒整合到目标基因组位点；其次，用期望的修饰替换该筛选盒（图1）。

所使用的筛选标记包括氨苄青霉素抗性（AmpR）、β-半乳糖苷酶（β-gal）和 sacB。AmpR 可实现基于抗生素抗性的筛选，β-gal 可用于蓝/白筛选，而 sacB 则赋予蔗糖敏感性以实现反向筛选。整合了表达盒的菌落在诱导平板上呈蓝色；非诱导对照组中出现生长则提示材料质量较差。在进入下一步之前，必须验证所有标记的功能是否正常。

第二步中，sacB 表达可在蔗糖平板上实现反向筛选。由于可能发生 sacB 基因突变，仍可能出现菌落，可通过使用额外的标记基因或筛选更多菌落来减少此问题。通过跨越整合位点的引物进行菌落 PCR，可确认阳性重组子。

在精心设计的支持下，重组工程的效率可超过80%。基因组操作前应先进行基因组分析，特别注意含有临床相关基...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	任意	任意	分子级
用于扩增 Il-12 的引物：CTGGCTAGCGTTTAA ACGGGCCCTCTAGACTCG AGCGGCCGCACGCCACCA TGTGTCCTCAGAAGCTAACC	任意	任意	HPLC 纯化
用于扩增 AmpR/LacZ/SacB 盒的引物：CTGGCTAGCGTTTAAA CGGGCCCTCTAGACTCGAG CGGCCGCACGCCACCACC CCTATTTGTTTATTTTTC	任意	任意	HPLC 纯化
IPTG	任意	任意	分子级
LB 琼脂
LB 培养基
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F549S
扩增 Il12 的反向引物：GGCAACTAGAAGGCA CAGTCGAGGCTGATCAGC GGTTTAAACTTAAGCTTTC AGGCGGAGCTCAGATAG	任意	任意	HPLC 纯化
扩增 AmpR/LacZ/SacB 盒的反向引物：GGCAACTAGAAGGCAC AGTCGAGGCTGATCAGC GGTTTAAACTTAAGCTTT TATTTGTTAACTGTTAATTG	任意	任意	HPLC 纯化
SacB/AmpR/LacZ 筛选盒	本手稿	-	-
蔗糖	任意	任意	分子级
含 BAC-HSV-1 或 BAC-Adv 的 SW102	本手稿	-	-
胰蛋白胨	任意	任意	分子级
Wizard SV 凝胶	Promega	A9281
X-gal	任意	任意	分子级
酵母提取物	任意	任意	分子级