本方案通过将培养组学与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）相结合，实现对乳制品中微生物组成的快速、低成本评估。该方法获得的分类学结果与16S rRNA测序相当，且比传统培养方法具有更短的检测周期。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍一种利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS，下文简称“MS”）结合蛋白质组学方法、现代培养组学及多种样品前处理步骤，对不同乳制品（如黄油、马苏里拉奶酪、牛奶、奶油）中微生物的存在情况进行监测的实验方案。该方法可作为食品安全质量控制实验室中快速、可靠且稳健的微生物安全监测工具。方案包括微生物分离、挑取生长菌落、样品前处理（完整细胞法、原位提取法和离心管内提取法）、设定质谱分析参数、获取并收集质谱图谱（蛋白质指纹图谱），最终通过质谱平台获得分类学鉴定结果，并进行数据分析与可视化呈现。该方法已通过多项研究验证，相较于商业化的生化检测系统，可更可靠且经济地实现对牛奶来源微生物的鉴定。作为一种食品微生物学领域的有前景的技术进步，该方法凭借操作简便的流程和显著缩短的分析时间，满足了各类实验室的多样化需求。本方案针对食品工业的实际需要，可在合理的周转时间（TAT）内提供可靠的微生物鉴定结果，与生产流程高度契合。
引言
本方案的总体目标是通过采用质谱法（MS）进行细菌蛋白质组分析，为监测黄油、奶酪、牛奶和奶油等各种乳制品的微生物安全性提供一套全面的方法学。该方法结合了现代培养组学与优化的样品制备流程，旨在为食品安全与质量控制实验室提供一种快速、可靠且稳健的工具。开发并应用此方法学的依据在于传统微生物鉴定方法的局限性。多年来，兽医和食品诊断实验室一直依赖传统的生化检测方法，即通过观察细菌在鉴别培养基上的生长和代谢情况，再结合多种酶学分析来进行鉴定1。尽管这些方法通常基于《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）等标准指南，具有相对低廉的成本，并能提供定量和定性的数据，但其操作繁琐且耗时，需要大量的培养基制备、样品稀释、涂布接种、培养、菌落计数、分离及详细的表征步骤2,3。
商业半自动和全自动系统（如 Analytical Profile Index (API)、BBL Crystal、Vitek 和 Biolog MicroPlates）的引入，通过生化检测简化了微生物鉴定流程，从而降低了成本并缩短了检测周期。然而，这些系统存在一些缺陷，例如重复性差、各自数据库中条目不足，以及在菌株间表型变异的判定上存在困难，特别是对于非发酵细菌或种内生化特性差异较小的菌....
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方案
本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。
1. 奶制品相关细菌的分离
- 从液态或固态乳制品中获取细菌培养物
- 培养基选择
- 为从乳制品样品中分离细菌，应根据预期的微生物类群选择培养基，包括通用生长培养基、革兰氏阴性菌培养基、乳酸菌（LAB）培养基、产孢菌培养基，以及适用于生长缓慢或营养要求苛刻的微生物的培养基。
注：为最大程度地回收优势菌和稀有菌种，应平行接种多种培养基。用于乳制品样品微生物组分析的一组示例培养基见表1。
- 为从乳制品样品中分离细菌，应根据预期的微生物类群选择培养基，包括通用生长培养基、革兰氏阴性菌培养基、乳酸菌（LAB）培养基、产孢菌培养基，以及适用于生长缓慢或营养要求苛刻的微生物的培养基。
- 接种与涂布
- 取具有代表性的乳制品样品并充分混匀。
- 无菌操作下，取1 mL液态样品（如牛奶、稀奶油、酪乳）或1 g固态样品（如奶酪、黄油），转移至含有9 mL无菌液体培养基（蛋白胨水/0.85% NaCl溶液）的15 mL锥形离心管中。对于固态样品，在加入样品前将液体培养基预热至40–42 °C。
- 通过剧烈涡旋振荡30–60秒使样品均质化。对于高脂或质地较硬的样品，持续均质直至获得均匀的悬浮液。
- 取1 mL悬浮液转移至含9 mL无菌溶液的试管中，依次制备十倍系列稀释液。每次稀释后充分混匀。
注：根据样品类型及预期的....
- 培养基选择
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结果
培养组学方法
培养组学方法是一种旨在最大限度地多样化微生物培养条件的策略，以提高分离出稀有、难培养或此前未描述过的物种的机会12。该方法能够更全面地揭示存在于各种样本（如食品样本）中的微生物群落的生物多样性。在菌落的视觉评估阶段即可观察到微生物多样性的增加，这些菌落在形态、颜色、大小和生长速率上各不相同，反映了所采用的培养组学方法的有效性（图2）。
图 2：采用培养组学.......
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讨论
该专注于乳制品微生物鉴定的实验方案，通过在速度、可靠性和成本效益方面实现最佳平衡，较传统方法具有重要进步。然而，该方案中的某些关键步骤需要特别注意。首先，分离与培养阶段是基础。培养基和培养条件必须与预期的微生物多样性和载量相匹配。获得纯培养物至关重要，通常需要进行转接培养，以避免混合菌群干扰质谱鉴定结果，因为此阶段菌落分离不充分或污染可能导致鉴定结果模糊或错误4。
其次，质谱分析的样品制备是决定谱图质量的关键因素。本方案概述了三种标准方法：直接菌落转移法、靶上提取法和管内蛋白质提取法。虽然直接转移法最为简便，但对于所有微生物而言可能并不充分，特别是对于细胞壁较厚的革兰氏阳性菌或产孢菌7,8。靶上提取法对许多细菌而言在简便性和有效性之间提供了良好的平衡14。然而，对于更难处理的分离株，尤其是具有坚固细胞壁的细菌（如某些革兰氏阳性菌，包括产孢菌），通常推荐采用管内乙醇/甲酸提.......
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
E.S.、M.Z. 和 P.P. 是托伦卓越中心的成员 "迈向个性化医疗" 卓越计划—研究型大学项目框架内开展。本研究在LIDER项目资助下完成 "一种用于分离生物活性乳铁蛋白的制备方法的开发" DPWP/LIDER-XIII/6/2023，由波兰国家研究与发展中心（华沙，波兰）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 甲酸 | Chempur | 115676307 | |
| 乙腈 | Merck KGaA | 1.00014.1011 | |
| APT 琼脂 | Merck KGaA | 1.10453.0500 | |
| 细菌测试标准品 | Bruker Daltonik GmbH | 8255343 | |
| CBL 琼脂（中国蓝乳糖琼脂） | Merck KGaA | 1.02348.0500 | |
| 哥伦比亚血琼脂 | Oxoid | CM0331B | |
| M17 琼脂 | |||
| 牛奶平板计数琼脂（MPCA） | Oxoid | cm0681 | |
| MRS 琼脂（de Man、Rogosa 和 Sharpe 琼脂） | Merck KGaA | 1.10660.0500 | |
| MSP 96 目标板抛光钢 BC | Bruker Daltonik GmbH | 8280800 | |
| 蛋白胨水 | Sigma-Aldrich | 70179 | |
| Schaedler 琼脂 | Sigma-Aldrich | 91019 | |
| 绵羊血 | Biomaxima | SL0160-100 | |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） | Sigma-Aldrich | 22091 | |
| 水 | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Bruker Daltonik GmbH | 8201344 |
参考文献
- Savage, E., et al. Evaluation of three bacterial identification systems for species identification of bacteria isolated from bovine mastitis and bulk tank milk samples. Foodborne PathogDis. 14 (3), 177-187 (2017).
- Holt, J. G., et al.
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重印与许可
