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方法文章

利用细菌蛋白质组学分析评估乳制品的微生物安全性 通过 基质辅助激光解吸电离方法

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DOI：

10.3791/68993

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2025年10月7日

 ,  , 
1Centre for Modern Interdisciplinary Technologies, Nicolaus Copernicus University in Toruń

本文内容

摘要

本方案通过将培养组学与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）相结合，实现对乳制品中微生物组成的快速、低成本评估。该方法获得的分类学结果与16S rRNA测序相当，且比传统培养方法具有更短的检测周期。

摘要

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS，下文简称“MS”）结合蛋白质组学方法、现代培养组学及多种样品前处理步骤，对不同乳制品（如黄油、马苏里拉奶酪、牛奶、奶油）中微生物的存在情况进行监测的实验方案。该方法可作为食品安全质量控制实验室中快速、可靠且稳健的微生物安全监测工具。方案包括微生物分离、挑取生长菌落、样品前处理（完整细胞法、原位提取法和离心管内提取法）、设定质谱分析参数、获取并收集质谱图谱（蛋白质指纹图谱），最终通过质谱平台获得分类学鉴定结果，并进行数据分析与可视化呈现。该方法已通过多项研究验证，相较于商业化的生化检测系统，可更可靠且经济地实现对牛奶来源微生物的鉴定。作为一种食品微生物学领域的有前景的技术进步，该方法凭借操作简便的流程和显著缩短的分析时间，满足了各类实验室的多样化需求。本方案针对食品工业的实际需要，可在合理的周转时间（TAT）内提供可靠的微生物鉴定结果，与生产流程高度契合。

引言

本方案的总体目标是通过采用质谱法（MS）进行细菌蛋白质组分析，为监测黄油、奶酪、牛奶和奶油等各种乳制品的微生物安全性提供一套全面的方法学。该方法结合了现代培养组学与优化的样品制备流程，旨在为食品安全与质量控制实验室提供一种快速、可靠且稳健的工具。开发并应用此方法学的依据在于传统微生物鉴定方法的局限性。多年来，兽医和食品诊断实验室一直依赖传统的生化检测方法，即通过观察细菌在鉴别培养基上的生长和代谢情况，再结合多种酶学分析来进行鉴定1。尽管这些方法通常基于《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）等标准指南，具有相对低廉的成本，并能提供定量和定性的数据，但其操作繁琐且耗时，需要大量的培养基制备、样品稀释、涂布接种、培养、菌落计数、分离及详细的表征步骤2,3。

商业半自动和全自动系统（如 Analytical Profile Index (API)、BBL Crystal、Vitek 和 Biolog MicroPlates）的引入，通过生化检测简化了微生物鉴定流程，从而降低了成本并缩短了检测周期。然而，这些系统存在一些缺陷，例如重复性差、各自数据库中条目不足，以及在菌株间表型变异的判定上存在困难，特别是对于非发酵细菌或种内生化特性差异较小的菌株，可能导致体外（in vitro）检测结果错误4。鉴于上述局限，质谱（MS）技术已发展成为一种强有力的替代方法，目前在临床微生物学中广泛应用，并逐渐受到兽医诊断和乳品质量检测实验室的关注。该方法因其在检测多种微生物时具备快速、准确和成本效益高的优势而受到青睐1。大量研究表明，质谱在从牛奶中鉴定微生物方面提供了更可靠的鉴定结果，相较于商业生化检测系统，其检测速度更快、成本更低5,6,7。尽管生化检测可能足以实现属级或群组级的鉴定，但种级鉴定通常需要更先进的方法，如质谱或16S rRNA测序8。事实上，质谱被认为是一种具有前景的平台，可用于食品微生物分离株的灵活且可靠的鉴定，通过其简化的操作流程和显著缩短的分析时间，满足食品微生物学实验室的多样化需求，从而提升食品安全水平4,5。由于试剂消耗量低，其运行成本极低，且样品处理过程更易于实现自动化和高通量操作8。然而需注意的是，该方法的应用效果在本质上依赖于所选择的微生物培养条件（包括培养基类型）以及参考数据库中物种覆盖范围，这两者被公认为限制其应用价值的关键因素。

质谱技术在食品微生物学中具有重要作用，可用于鉴定和区分食源性致病菌、乳酸菌（LAB）及其他发酵菌9。该技术的应用还延伸至现代培养组学，能够鉴定培养基上生长的所有微生物菌落，并有助于获取菌落形成单位（CFU）信息7。这一方法已成功应用于复杂微生物群落的研究，例如人体肠道中的菌群、糖尿病足感染相关的微生物群，以及与泌尿道相关的菌群，从而重新振兴了微生物学实践中依赖培养的方法10,11。

本方案旨在指导实验室有效实施质谱法（MS），用于乳制品微生物安全性的常规评估，以满足工业界在适合生产流程的实际周转时间（TAT）内进行可靠微生物鉴定的需求。本方案详细说明了关键步骤，包括：（1）从液态（牛奶、奶油、乳清）和固态（黄油、奶酪）乳制品中分离微生物，采用多种适宜的培养基（如 de Man、Rogosa 和 Sharpe 琼脂 - MRS 琼脂，M-17 琼脂，通用 Tween 80 琼脂 - APT 琼脂，中国蓝乳糖琼脂 - CBL 琼脂，乳品平板计数琼脂 - MPCA，胰蛋白胨大豆琼脂 - TSA）并结合定制的培养条件；（2）标准化的质谱分析样品制备流程，提供多种可选方法，如直接菌落转移、靶上甲酸提取以及试管内乙醇/甲酸蛋白提取，以适应不同类型的细菌及实验室工作流程；（3）系统的质谱分析过程，包括仪器校准、确定最佳谱图采集参数，以及数据解读指南，涵盖评分值评估和一致性检查，以实现可靠的分类学鉴定。通过提供结构化且经过验证的方法，本方案旨在提高乳制品行业微生物监测的准确性与效率，最终有助于提升食品安全质量与公共健康水平。

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方案

本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。

1. 奶制品相关细菌的分离

  1. 从液态或固态乳制品中获取细菌培养物
    1. 培养基选择
      1. 为从乳制品样品中分离细菌，应根据预期的微生物类群选择培养基，包括通用生长培养基、革兰氏阴性菌培养基、乳酸菌（LAB）培养基、产孢菌培养基，以及适用于生长缓慢或营养要求苛刻的微生物的培养基。
        注：为最大程度地回收优势菌和稀有菌种，应平行接种多种培养基。用于乳制品样品微生物组分析的一组示例培养基见表1。
    2. 接种与涂布
      1. 取具有代表性的乳制品样品并充分混匀。
      2. 无菌操作下，取1 mL液态样品（如牛奶、稀奶油、酪乳）或1 g固态样品（如奶酪、黄油），转移至含有9 mL无菌液体培养基（蛋白胨水/0.85% NaCl溶液）的15 mL锥形离心管中。对于固态样品，在加入样品前将液体培养基预热至40–42 °C。
      3. 通过剧烈涡旋振荡30–60秒使样品均质化。对于高脂或质地较硬的样品，持续均质直至获得均匀的悬浮液。
      4. 取1 mL悬浮液转移至含9 mL无菌溶液的试管中，依次制备十倍系列稀释液。每次稀释后充分混匀。
        注：根据样品类型及预期的微生物污染水平，制备从10-1到10-6的稀释度。大多数样品稀释至10-3即可；但在分析生鲜牛奶或蓝纹奶酪时，可能需要进一步稀释。为确保准确分离并便于菌落挑选，最佳接种稀释度应使每平板菌落数在30–300之间。该范围有利于清晰区分单个菌落，减少菌落重叠生长的风险，从而便于获得无污染且均一的细菌纯培养物用于后续分析。对于某些加工乳制品（如酪乳），可直接取未稀释的新鲜样品（例如0.1 mL）进行涂布。
      5. 取0.1 mL样品或其稀释液，转移至预先准备好的、含有适当琼脂培养基的培养皿表面。
      6. 使用无菌涂布棒将接种物均匀涂布于琼脂表面。静置15分钟使接种物充分吸收，然后将平板倒置。
    3. 培养
      1. 需氧培养：对所有待测样品，接种APT、M-17、CBL、MPCA和TSA琼脂平板，在37 °C和30 °C下需氧培养24小时。培养温度的选择基于不同关键微生物类群的最佳生长需求，以评估乳制品的卫生质量（30 °C适用于一般中温菌）和公共健康安全性（37 °C适用于人源性病原菌及指示菌）。
        注：若预计存在大量产孢菌生长，则TSA平板宜采用较短（约12小时）的培养时间。
      2. 厌氧培养：对所有待测样品，接种MRS琼脂平板，在37 °C和30 °C下厌氧培养24–72小时，每日观察微生物生长情况。培养温度设定同步骤3.1所述。
        注：可通过将平板置于密闭容器中，并使用厌氧产气袋创造无氧环境，以实现厌氧培养条件，从而消除氧气并为厌氧菌生长提供适宜气氛。
    4. 获得纯培养物
      1. 培养结束后，检查平板，根据菌落形态特征（如大小、形状、颜色、质地）挑选生长出的单个菌落。
      2. 使用1 µL微生物接种环，在相同琼脂培养基上通过划线法（转接）对所选菌落进行纯化，并采用相同的培养条件。
培养基应用培养条件
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）用于培养多种细菌的通用培养基30–37 °C，24–48 小时，需氧
血琼脂（BLA；含5%绵羊血）富集，溶血分化，对……有用 链球菌，李斯特菌，芽孢杆菌30–37 °C，24–48 小时，需氧
MRS 琼脂（de Man、Rogosa 和 Sharpe 琼脂）选择性针对 乳酸杆菌 以及其他乳酸菌，在培养基中添加 1% Tween-80 以促进其生长 干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌。30 °C，48–72 小时，厌氧或微需氧
M17 琼脂选择性作用于 乳酸乳球菌，嗜热链球菌30 °C，48–72 小时，厌氧或微需氧
APT琼脂（All-Purpose Tween 80琼脂）选择性针对乳酸菌（LAB）及某些其他菌 双歧杆菌30 °C，48–72 小时，厌氧或微需氧
Scheadler 琼脂选择性富集分离厌氧菌，包括 双歧杆菌属，梭菌属30–37 °C，48–72 小时，厌氧条件
CBL 琼脂（中国蓝乳糖琼脂）用于大肠菌群及其他乳糖发酵菌的鉴别培养基37 °C，24–48 小时，有氧
牛奶平板计数琼脂（MPCA）通用，用于需氧嗜温细菌总数30–37 °C，24–48 小时，需氧培养

表1：用于乳制品样本微生物组分析的推荐培养基及相应培养条件列表。

2. 质谱分析用细菌样品的制备

  1. 开始前，准备 MALDI 基质溶液
    注意：最常用的基质化合物是 HCCA（α-氰基-4-羟基肉桂酸）。该化合物具有光敏性，因此应在避光容器中或远离光照的条件下配制和储存基质。
    1. 使用以下比例配制溶剂混合液：50% 乙腈（HPLC 级）、47.5% 水（HPLC 级）和 2.5% 三氟乙酸（TFA）。
    2. 将基质溶解于溶剂混合液中，终浓度约为 10 mg/mL（或直至饱和——即有未溶解的晶体可见）。
    3. 如果溶液不澄清（仍有晶体存在），则离心或过滤溶液（例如，通过 0.22 µm 注射器滤膜）以获得澄清液体。
      ​注意：可短期冷藏保存，但应尽量减少冻融次数。
  2. 使用质谱法鉴定细菌时，可采用以下三种样品制备方法之一：
    1. 直接菌落转移法——适用于生长良好且不易产生裂解抗性的细菌（如大多数革兰阴性菌），此为最简单、最快的方法。
      1. 使用无菌接种环或牙签，将少量生长的菌落（约 1 µL）转移至 MALDI 板上的指定位置。
      2. 将细菌材料直接涂布在 MALDI 目标板的指定位置，形成一层薄而均匀的膜。
      3. 待其干燥后，加入 1 µL HCCA 基质溶液覆盖该点，并在室温下自然干燥。
    2. 靶上甲酸提取法——适用于难以鉴定的细菌（如革兰阳性菌、酵母菌），因其细胞壁较难在无额外处理的情况下释放蛋白质。
      1. 使用一次性微生物接种环或无菌牙签，从单个细菌菌落中取少量细菌生物量。
      2. 将细菌材料直接涂布在 MALDI 目标板的指定位置，形成一层薄而均匀的膜。
      3. 在涂布的细菌材料上覆盖 1 µL 70% 甲酸溶液，并在室温下自然干燥。
      4. 待其干燥后，加入 1 µL HCCA 基质溶液覆盖该点，并在室温下自然干燥。
    3. 管内蛋白提取法（乙醇/甲酸法）——适用于难以鉴定的微生物，包括某些革兰阳性菌、酵母菌和分枝杆菌。
      1. 使用无菌接种环或拭子，将 1–3 个完整的菌落从琼脂培养平板转移至含有 300 µL 无菌水的 1.5 mL 微量离心管中。
      2. 加入 900 µL 无水乙醇，使最终乙醇浓度约为 75%。混合或涡旋数秒。
      3. 在 15,000 × g 条件下离心 2 分钟（室温）。
      4. 小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
        注意：对于黏液型菌株，建议在 4 °C 下进行额外离心。
      5. 将沉淀管敞口放置，直至所有残留乙醇完全蒸发（5–10 分钟，室温）。
      6. 向干燥的细胞沉淀中加入 20–50 µL 70% 甲酸（FA）。通过移液或涡旋混合，直至沉淀完全重悬。
        注意：加入体积应与生物材料的量成正比。
      7. 向甲酸悬液中加入等体积的乙腈（ACN），小心混匀。
      8. 在 15,000 × g 条件下离心 2 分钟（室温）。
      9. 取 1 µL 上清液转移至 MALDI 目标板的指定位置。
      10. 在室温下使其完全自然干燥。
      11. 在干燥的样品点上覆盖 1 µL α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质溶液。
      12. 在质谱分析前，让基质在室温下完全自然干燥（图 1）。
        注意：70% 甲酸：具有腐蚀性，可致灼伤。应在通风橱中操作。乙腈：易燃且有毒。远离火焰，避免吸入或接触。三氟乙酸（TFA）：强酸、具腐蚀性和挥发性；避免皮肤、眼睛接触及吸入。操作时应始终穿戴实验服、耐化学腐蚀手套和护目镜。所有试剂均应在通风橱中操作以避免吸入。避免皮肤和眼睛接触；远离明火操作。酸性和有机溶剂废液应收集于明确标识、兼容的容器中，进行妥善处理。

Bacterial Identification via MALDI-TOF flowchart; methods: colony transfer, acid extraction.
图1用于可视化选择细菌分离株鉴定中适当样本制备方法的决策树 通过 质谱技术 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 使用质谱技术进行光谱采集与微生物鉴定

  1. 校准
    注意：为在质谱（MS）中获得准确的质量测定结果，在分析未知样品前，需使用适当的标样对仪器进行校准。正确的仪器校准对于可靠鉴定至关重要。
    1. 在MALDI靶板上制备校准点，每点加入1 µL：（a）细菌测试标准品（BTS），包含大肠杆菌（Escherichia coli）DH5 alpha的提取物，覆盖质量范围为3.6–17 kDa（适用于MBT Biotyper）；（b）微生物校准品，包含大肠杆菌（E. coli）ATCC 25922蛋白提取物、核糖核酸酶和肌红蛋白，覆盖质量范围为3.6–17 kDa（适用于EXS2600系统）。待其自然干燥后，每个干燥的校准点上叠加1 µL HCCA基质溶液，操作方式与样品制备相同。
    2. 将含有制备好的样品和校准点的MALDI靶板装入仪器中。使用校准模式（自动）运行校准点的分析。
    3. 验证校准结果，确保在整个指定质量范围（2–20 kDa）内的质量准确性处于可接受范围内（100 ppm）。
  2. 谱图采集
    注意：仪器完成校准后，即可采集每个制备好的样品点的质谱图。
    1. 通用采集参数
      1. 以线性正离子模式操作质谱仪。
      2. 设定质荷比（m/z）检测范围为2,000–20,000（2–20 kDa）。
    2. 使用以下仪器特异性设置
      1. 离子源电压：离子源1（IS1）为20 kV，离子源2（IS2）为18 kV，聚焦透镜电压为9 kV。加速电压最高可达25 kV。
      2. 检测器电压：设定为约2.65 kV。
      3. 脉冲离子提取设置：100 ns，延迟提取时间固定为230 ns。
      4. 激光能量设置：手动调节以获得最佳谱图质量（根据信号数量和信号强度），通常为最低所需功率的40%–65%。
      5. 每张谱图的激光 shots 数：从每个样品点的不同区域采集足够数量的激光 shots，以生成信噪比（S/N）良好的总和谱图 → （a）平均采集200次，每次50次 shots，从每个点的4个不同区域采集；或（b）以AutoXecute模式分步采集500次 shots，即从靶点上10个不同位置各采集50次 shots。
    3. 样品测量策略
      1. 对每个分离株测量多个点（每个分离株至少2个点）。
      2. 对每个点重复采集谱图，以确保结果的一致性和准确性 → 每个点测量两次，目标是每个样品获得一定数量的总谱图（每个样品至少4张谱图 → 技术重复）。
        注意：应使用至少3个生物学样本进行实验，以获得生物学重复。

4. 微生物鉴定与数据分析

注意：通过将获得的蛋白质谱（微生物的特异性蛋白质“指纹”）与参考数据库进行比对来实现生物体鉴定，通过比对信号位置和强度的相关性，生成一个匹配值，该值描述了所研究生物体与其对应的参考微生物匹配的置信度。通过将处理后的质谱数据与参考数据库进行比对来鉴定微生物。

  1. 质谱数据处理
    1. 使用适当的软件进行质谱数据处理：(a) MALDI Biotyper 系统使用 flexAnalysis，或 (b) EXS2600 系统使用 EX-Accuspec。
    2. 采用 Savitzky-Golay 方法作为平滑算法（窗口宽度 2 m/z，循环次数 10 次）。
    3. 使用 TopHat 算法进行基线校正以去除背景噪声（信噪比阈值 = 2，TopHat 滤波器宽度 0.2 Da）。
    4. 采用质心模式作为峰检测算法（信噪比阈值 = 2）。
  2. 数据库比对与得分解读
    1. 将处理后的未知菌株质谱数据上传至微生物鉴定用 MALDI 平台，并运行鉴定程序。
      注意：本研究中使用的软件包括：Biotyper 版本 4.1.100 和 Ex-Accuspec 版本 V1。对于 MALDI Biotyper 软件，建议从原始谱图生成主谱（MSPs），以确保最佳匹配可靠性。
    2. 根据制造商提供的标准阈值评估鉴定结果。
      注意：MALDI Biotyper 与 EXS2600 系统的得分范围如下：
      2.300–3.000：高度可信的种水平鉴定；
      2.000–2.299：可靠的属水平鉴定，可能的种水平鉴定；
      1.700–1.999：可能的属水平鉴定；
      0.000–1.699：鉴定结果不可靠。
      在评估 MALDI Biotyper 平台所得鉴定结果时，可参考一致性分类（Consistency Categories）支持判断：A 类 - 种一致性（Species Consistent）→ 最佳匹配结果，且所有其他高分匹配结果（>1.999）均指向同一物种；B 类 - 属一致性（Genus Consistent）→ 最佳匹配与其他相似得分（1.700–1.999）的匹配均指向同一属，但在种水平上可能存在差异；C 类 - 无一致性（No Consistency）→ 未达到种或属水平的一致性要求。

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结果

培养组学方法
培养组学方法是一种旨在最大限度地多样化微生物培养条件的策略，以提高分离出稀有、难培养或此前未描述过的物种的机会12。该方法能够更全面地揭示存在于各种样本（如食品样本）中的微生物群落的生物多样性。在菌落的视觉评估阶段即可观察到微生物多样性的增加，这些菌落在形态、颜色、大小和生长速率上各不相同，反映了所采用的培养组学方法的有效性（图2）。

不同琼脂培养基上的细菌菌落生长；培养皿实验；微生物分析结果。
图 2：采用培养组学...

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讨论

该专注于乳制品微生物鉴定的实验方案，通过在速度、可靠性和成本效益方面实现最佳平衡，较传统方法具有重要进步。然而，该方案中的某些关键步骤需要特别注意。首先，分离与培养阶段是基础。培养基和培养条件必须与预期的微生物多样性和载量相匹配。获得纯培养物至关重要，通常需要进行转接培养，以避免混合菌群干扰质谱鉴定结果，因为此阶段菌落分离不充分或污染可能导致鉴定结果模糊或错误4。

其次，质谱分析的样品制备是决定谱图质量的关键因素。本方案概述了三种标准方法：直接菌落转移法、靶上提取法和管内蛋白质提取法。虽然直接转移法最为简便，但对于所有微生物而言可能并不充分，特别是对于细胞壁较厚的革兰氏阳性菌或产孢菌7,8。靶上提取法对许多细菌而言在简便性和有效性之间提供了良好的平衡14。然而，对于更难处理的分离株，尤其是具有坚固细胞壁的细菌（如某些革兰氏阳性菌，包括产孢菌），通常推荐采用管内乙醇/甲酸提...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

E.S.、M.Z. 和 P.P. 是托伦卓越中心的成员 "迈向个性化医疗" 卓越计划—研究型大学项目框架内开展。本研究在LIDER项目资助下完成 "一种用于分离生物活性乳铁蛋白的制备方法的开发" DPWP/LIDER-XIII/6/2023，由波兰国家研究与发展中心（华沙，波兰）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 甲酸Chempur115676307
乙腈Merck KGaA1.00014.1011
APT 琼脂Merck KGaA1.10453.0500
细菌测试标准品Bruker Daltonik GmbH8255343
CBL 琼脂（中国蓝乳糖琼脂）Merck KGaA1.02348.0500
哥伦比亚血琼脂 OxoidCM0331B
M17 琼脂
牛奶平板计数琼脂（MPCA）Oxoidcm0681
MRS 琼脂（de Man、Rogosa 和 Sharpe 琼脂）Merck KGaA1.10660.0500
MSP 96 目标板抛光钢 BCBruker Daltonik GmbH8280800
蛋白胨水Sigma-Aldrich70179
Schaedler 琼脂Sigma-Aldrich91019
绵羊血BiomaximaSL0160-100
三氟乙酸Sigma-AldrichT6508
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）Sigma-Aldrich22091
水Merck KGaA1.15333.2500
α-氰基-4-羟基肉桂酸Bruker Daltonik GmbH8201344

参考文献

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