通过 MALDI 方法 使用 细菌蛋白质组学分析评估乳品的微生物安全性

摘要

该协议通过将培养组学与 MALDI-TOF MS 相结合，能够快速、经济高效地评估乳制品中的微生物组成。它提供的分类结果可与 16S rRNA 测序相媲美，并且周转时间比传统培养方法更短。

摘要

我们提出了一种使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS，以下简称“MS”）鉴定方法的协议，用于监测不同乳制品（黄油、马苏里拉奶酪、牛奶、奶油）中微生物的存在，使用蛋白质组学方法，现代培养组学和各种样品制备程序，可以作为一种快速， 用于监测微生物安全性的可靠、强大的工具。它包括微生物分离步骤、挑选生长菌落、样品制备程序（完整细胞、现场和管内提取）、设置 MS 分析参数、生成和收集 MS 谱图（蛋白质指纹图谱），最后使用 MS 平台进行分类，然后进行数据解释和可视化。与商业生化测试系统相比，这种方法经过大量研究的验证，可以更可靠、更具成本效益地鉴定牛奶中的微生物。它是食品微生物学领域的一项有希望的进步，通过其简单的方案和显着减少的分析时间满足实验室的多样化要求。所提出的协议通过在非常适合制造过程的适当周转时间（TAT）内提供可靠的微生物鉴定来满足食品行业的需求。

引言

该协议的总体目标是通过采用MS进行细菌蛋白质组学分析，提供一种全面的方法来监测各种乳制品（包括黄油、奶酪、牛奶和奶油）的微生物安全性。这种方法将现代培养组学与优化的样品制备程序相结合，旨在成为食品安全和质量控制实验室的快速、可靠和强大的工具。创建和应用这种方法背后的基本原理来自标准微生物鉴定方法的局限性。多年来，兽医和食品诊断实验室一直依赖传统的生化测试，在差异培养基上检查细菌的生长和代谢，然后进行各种酶促测定¹。虽然这些方法通常基于Bergey的《确定性细菌学手册》等标准指南，相对便宜，并且可以产生定量和定性数据，但它们既费力又耗时，需要大量的培养基制备，样品稀释，电镀，孵育，菌落计数，分离和详细的表征步骤^2,3。

Analytical Profile Index （API）、BBL Crystal、Vitek 和 Biolog MicroPlates 等商业半自动和自动化系统的引入简化了使用生化测定的微生物鉴定，从而降低了成本和周转时间。然而，这些系统有一些缺点，例如可重复性差，各自数据库中缺少条目，以及难以确定菌株之间的表型变异，特别是对于非发酵细菌或具有微小生化差异的物种内的菌株，这可能导致不正确的体外结果⁴.鉴于此，多发性硬化症已发展成为一种有效的替代品，目前在临床微生物学中很常见，并在兽医诊断和牛奶质量实验室中受到关注。这种方法在检测多种微生物方面的速度、准确性和成本效益得到了补充¹。大量研究表明，MS 可以更可靠地鉴定牛奶中的微生物，比商业生化测试系统提供更快、更便宜的结果 ^5,6,7。虽然生化检测可能足以进行属级或类群级鉴定，但物种级诊断通常需要更先进的方法，如 MS 或 16S rRNA 测序⁸。事实上，MS被认为是一个有前途的平台，可以灵活可靠地鉴定食品微生物分离株，通过其简单的方案和显着减少的分析时间满足食品微生物实验室的多样化要求，从而提高食品安全^4,5。由于试剂消耗量低，运营成本极低，并且样品处理可实现更高的自动化和高通量⁸。然而，应该注意的是，该方法的效用本质上取决于所选的微生物生长条件（包括培养基类型）和参考数据库物种覆盖率，这被认为是限制其有用性的关键因素。

MS 通过识别和区分食源性致病菌、乳酸菌 （LAB） 和其他发酵细菌，在食品微生物学中发挥着重要作用⁹。其实用性扩展到现代培养组学，能够鉴定在培养基上生长的所有微生物菌落，并促进菌落形成单元（CFU^）信息的获取7。这种方法已经成功应用于发现人类肠道中存在的复杂微生物群落，参与糖尿病足感染或与泌尿道相连的微生物群落，从而振兴了微生物学实践中的培养依赖性方法^10,11。

该协议旨在指导实验室有效实施质谱，以对乳制品中的微生物安全性进行常规评估，满足行业在适合制造过程的实际周转时间（TAT）内进行可靠微生物鉴定的需求。该协议详细介绍了关键步骤，包括（1）使用选择适当的培养基（de Man，Rogosa和Sharpe琼脂-MRS琼脂，M-17琼脂，通用吐温80琼脂-APT琼脂，中国蓝乳糖琼脂-CBL琼脂，牛奶平板计数琼脂-MPCA，胰蛋白酶大豆琼脂-TSA）和定制的孵育条件;（2）用于MS分析的标准化样品制备程序，提供直接菌落转移、靶向甲酸提取和管内乙醇/甲酸蛋白提取等选项，以适应不同的细菌类型和实验室工作流程;（3）系统MS分析，包括仪器校准、定义最佳光谱采集参数和数据解释指南，包括评分值评估和一致性检查，以实现可靠的分类分配。通过提供结构化和经过验证的方法，该协议旨在提高乳制品行业微生物监测的准确性和效率，最终有助于改善食品质量和公众健康。

方案

本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 乳制品相关细菌的分离

1. 从液体或固体乳制品中获取细菌培养物
   1. 培养基选择
      1. 对于从乳制品样品中分离细菌，请根据预期的微生物组选择培养基，包括一般生长培养基、革兰氏阴性菌培养基、乳酸菌 （LAB）、孢子形成细菌以及生长缓慢或挑剔的微生物。
         注意：为了最大限度地提高优势和稀有物种的回收率，应同时接种多种培养基。 表 1 列出了一组用于乳制品样品微生物组分析的示例培养基。
   2. 接种和电镀
      1. 获得具有代表性的乳制品样品并充分混合。
      2. 将 1 mL（液体样品：牛奶、奶油、酪乳）或 1 g（固体样品：奶酪、黄油）无菌转移到含有 9 mL 无菌液体培养基（蛋白胨水 / 0.85% NaCl 溶液）的 15 mL 锥形离心管中。对于固体样品，在添加样品之前将液体介质加热至 40-42 °C。
      3. 通过剧烈涡旋30-60秒使样品均质化。对于脂肪或硬质样品，继续均质化，直到获得均匀的悬浮液。
      4. 通过取 1 mL 悬浮液并将其转移到含有 9 mL 无菌溶液的连续试管中，制备一系列十倍稀释液。充分混合每种稀释液。
         注意：根据样品类型和预期的微生物污染水平，制备^10-1 至^10-6的稀释液。对于大多数样品，稀释度高达 ^10-3 就足够了;然而，在分析鲜奶或蓝纹奶酪时，有必要准备进一步的稀释液。为确保准确分离和易于菌落选择，最佳接种稀释度应为每板提供 30-300 个菌落。该范围可以清楚地区分单个菌落，并最大限度地降低重叠生长的风险，从而有助于获得未受污染且均匀的细菌培养物以供以后分析。对于一些加工乳制品（例如酪乳），可以使用未稀释的新鲜样品（例如 0.1 mL）进行直接铺板。
      5. 取0.1mL样品或其稀释液，转移到含有适当琼脂培养基的先前制备的培养皿表面。
      6. 使用无菌撒布器将接种物均匀地铺布在琼脂表面。让接种物吸收到培养基中 15 分钟，然后倒置板。
   3. 孵化
      1. 有氧孵育：对于所有研究的样品，接种APT，M-17，CBL，MPCA和TSA琼脂平板，在37°C和30°C的有氧条件下孵育24小时。孵育温度是根据不同微生物组的最佳生长要求确定的，这对于评估乳制品的卫生质量（一般中温微生物为 30 °C）和公共卫生安全（人类相关病原体和指示生物为 37 °C）至关重要。
         注意：如果预计孢子形成细菌会密集生长，则在TSA的情况下，优选更短（~12小时）的孵育时间。
      2. 厌氧孵育：对于所有研究的样品，接种MRS琼脂平板，在37°C和30°C的厌氧条件下孵育24-72小时，每天检查微生物生长。如步骤3.1所述确定孵育温度。
         注意：厌氧孵育条件可以通过将板放入装有厌氧气氛产生小袋的密封容器中来实现，这消除氧气并为厌氧细菌的生长提供合适的气氛。
   4. 获得纯培养物
      1. 孵育后，检查板并根据其形态特征（例如，大小，形状，颜色，质地）选择生长的单个菌落。
      2. 使用 1 μL 微生物环和相同的孵育条件，通过传代（条纹）到同一琼脂培养基上纯化选定的菌落。

培养基	应用	培养条件
胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA）	用于培养多种细菌的通用培养基	30–37 °C，24–48 小时，有氧
血琼脂（BLA;含 5% 羊血）	富集，分化溶血，对链球菌、李斯特菌、芽孢杆菌有用	30–37 °C，24–48 小时，有氧
MRS 琼脂（de Man、Rogosa 和 Sharpe 琼脂）	选择性乳杆菌和其他实验室添加 1% 吐温-80 以支持干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌的生长。	30 °C，48–72 小时，厌氧或微需氧
M17琼脂	选择性乳 球菌、嗜热链球菌	30 °C，48–72 小时，厌氧或微需氧
APT 琼脂（通用吐温 80 琼脂）	对 LAB 和一些双歧杆菌具有选择性	30 °C，48–72 小时，厌氧或微需氧
Scheadler琼脂	选择性和富集性分离厌氧菌，包括双歧杆菌、梭状芽孢杆菌	30–37 °C，48–72 小时，厌氧
CBL琼脂（中国蓝乳糖琼脂）	差异培养基，用于大肠菌群和其他乳糖发酵细菌	37 °C，24–48 小时，有氧
奶板计数琼脂 （MPCA）	通用，为需氧嗜温细菌总数	30–37 °C，24–48 小时，有氧

表1：在指定培养条件下对乳制品样品进行微生物组分析的建议培养基列表。

2. 用于MS分析的细菌样品制备

1. 在开始之前，准备MALDI基质溶液
   注意：最常用的基质化合物是HCCA，α-氰基-4-羟基肉桂酸。这种化合物是光敏的，因此请准备基质并将其储存在黑暗容器中或远离光线。
   1. 使用以下比例制备溶剂混合物：50% 乙腈（HPLC 级）、47.5% 水（HPLC 级）和 2.5% 三氟乙酸 （TFA）。
   2. 将基质溶解在溶剂混合物中，最终浓度约为 10 mg/mL（或直至饱和 - 直到未溶解的晶体仍然可见）。
   3. 如果溶液不透明（晶体残留），则离心或过滤溶液（例如，通过 0.22 μm 注射器过滤器）以获得透明液体。
      注意： 如果除霜周期次数较少，则允许在冰箱中短期储存。
2. 要使用 MS 鉴定细菌，请使用 3 种样品制备程序之一：
   1. 直接菌落转移 - 在处理生长良好、不抗裂解的细菌（例如大多数革兰氏阴性菌）时，使用这种最简单、最快的方法。
      1. 使用无菌环或牙签，将少量（~1μL）生长的菌落转移到MALDI板上的一个点上。
      2. 将细菌材料直接涂抹在 MALDI 靶板上的指定位置上，以形成薄而均匀的层。
      3. 干燥后，用 1 μL HCCA 基质溶液覆盖斑点，并在室温下风干。
   2. 靶向甲酸提取 - 用于难以识别的细菌（例如革兰氏阳性菌、酵母菌），其细胞壁使其难以在不进行额外加工的情况下释放蛋白质。
      1. 使用一次性微生物环或无菌牙签从单个细菌菌落中拾取少量细菌生物质。
      2. 将细菌材料直接涂抹在 MALDI 靶板上的指定位置上，以形成薄而均匀的层。
      3. 用 1 μL 70% 甲酸溶液覆盖涂抹的细菌材料，并在室温下风干。
      4. 干燥后，用 1 μL HCCA 基质溶液覆盖斑点，并在室温下风干。
   3. 管内蛋白质提取（乙醇/甲酸法）- 将此方法用于难以识别的微生物，包括一些革兰氏阳性菌、酵母菌和分枝杆菌。
      1. 使用无菌环或拭子，将 1-3 个完整的菌落从琼脂培养板转移到含有 300 μL 无菌水的 1.5 mL 微量离心管中。
      2. 加入 900 μL 无水乙醇，将最终乙醇浓度调节至约 75%。混合或涡旋几秒钟。
      3. 将样品在 15,000 x g （室温）下离心 2 分钟。
      4. 小心地丢弃上清液，不要干扰细胞沉淀。
         注意：对于粘液菌株，建议在4°C下额外离心。
      5. 让沉淀管打开，直到所有残留乙醇蒸发（5-10 分钟，室温）。
      6. 向干燥的细胞沉淀中加入 20-50 μL 70% 甲酸 （FA）。通过移液或涡旋混合，直到沉淀完全重悬。
         注意：体积应与生物材料的量成正比。
      7. 向甲酸悬浮液中加入等体积的乙腈（ACN）。仔细混合。
      8. 以 15,000 x g 离心 2 分钟（室温）。
      9. 将 1 μL 上清液转移到 MALDI 靶板上的指定点上。
      10. 让斑点在室温下完全风干。
      11. 用 1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸 （HCCA） 基质溶液覆盖干燥的样品点。
      12. 在MS分析之前，让基质在室温下完全风干（图1）。
          注意：70% 甲酸：腐蚀性;导致烧伤。在通风橱中处理。乙腈：易燃有毒。远离火焰，避免吸入/接触。三氟乙酸（TFA）：强、腐蚀性、挥发性;避免皮肤/眼睛接触和吸入。始终穿着实验室外套、耐化学手套和安全护目镜。在通风橱中处理所有试剂，以避免吸入。避免皮肤和眼睛接触;远离明火工作。将酸性和有机溶剂废物收集在标签清晰、兼容的容器中，以便正确处置。

图 1：决策树可视化了 通过 MS 技术为细菌分离株鉴定选择适当的样品制备程序的过程。 请点击此处查看此图的大图。

3. 使用MS技术进行光谱采集和微生物鉴定

1. 校准
   注意：为了在 MS 中进行准确的质量测定，在分析未知样品之前，请使用适当的标准品校准仪器。正确的仪器校准对于可靠识别至关重要。
   1. 在含有 1 μL 的 MALDI 靶板上制备校准点：（a） 细菌测试标准品 （BTS），含有 大肠杆菌 DH5 α 提取物，覆盖 3.6-17 kDa 的质量范围（用于 MBT Biotyper）;（b）含有 大肠杆菌 ATCC 25922蛋白提取物、核糖核酸酶和肌红蛋白的微生物校准品，质量范围为3.6-17 kDa（用于EXS2600系统）。让其风干并用 1 μL HCCA 基质溶液覆盖干燥的校准品点，类似于样品制备。
   2. 将包含制备样品和校准点的MALDI靶板加载到仪器中。使用校准模式（自动）对校准点运行分析。
   3. 验证校准以确保质量精度在指定质量范围 （2-20 kDa） 内 （100 ppm） 的可接受范围内。
2. Spectra 采集
   注意：校准仪器时，从每个制备的样品点获取质谱。
   1. 常规采集参数
      1. 在线性正离子模式下作质谱仪。
      2. 将质量检测范围设置为 2,000-20,000 m/z （2-20 kDa）。
   2. 使用以下仪器特定设置
      1. 离子源电压：离子源 1 （IS1） 在 20 kV，离子源 2 （IS2） 在 18 kV，透镜电压在 9 kV。加速电压最高可达 25 kV。
      2. 检测器电压：设置为约 2.65 kV。
      3. 脉冲离子提取设置：100 ns，延迟提取时间固定为 230 ns。
      4. 激光功率设置：手动调整以获得最佳光谱质量（根据信号数量和信号强度），通常范围为最小所需功率的 40%-65%。
      5. 每个光谱的拍摄次数：从每个光斑的不同区域采集足够数量的激光拍摄，以生成具有良好信噪比 （S/N） 的总光谱→（a） 平均 200 次拍摄，从每个光斑的 4 个不同区域以 50 次拍摄，或 （b） 以 500 次拍摄步骤采集 - 使用 AutoXecute 模式从目标光斑的 10 个不同位置拍摄 50 次拍摄。
   3. 样品测量策略
      1. 测量每个分离株的多个点（每个分离株至少 2 个点）。
      2. 重复获取每个点的光谱，以确保结果的一致性和准确性→一式两份测量，目标是每个样品一定数量的总光谱（每个样品至少 → 个技术重复 4 个光谱）。
         注意：受试者生物样本（至少 3 个）以获得生物重复。

4. 微生物鉴定和数据分析

注意：通过将获得的蛋白质谱（微生物的特定蛋白质“指纹”）与参考数据库进行比较来进行生物体鉴定，并使用信号位置和强度的相关性生成匹配值，该值描述了所研究的生物体与其相应的参考微生物匹配的置信水平。通过将处理后的光谱与参考数据库进行比较来识别微生物。

1. 光谱处理
   1. 使用适当的软件进行光谱处理：（a） 用于 MALDI Biotyper 系统的 flexAnalysis 或 （b） 用于 EXS2600 系统的 EX-Accuspec。
   2. 应用 Savitzky-Golay 方法作为平滑算法（宽度 2 m/z，10 个周期）。
   3. 使用 TopHat 算法执行基线校正以消除背景噪声（信噪比阈值 = 2，TopHat 滤波器宽度 0.2 Da）。
   4. 使用质心模式作为峰值检测算法（信噪比阈值 = 2）。
2. 数据库比较和分数解释
   1. 将未知分离株的处理后的质谱图上传到微生物鉴定的MALDI平台。随后，运行标识。
      注意：这些研究中使用了以下软件：Biotyper 版本 4.1.100，Ex-Accuspec 版本 V1。对于 MALDI Biotyper 软件，建议从原始光谱创建主光谱 （MSP），以确保最佳匹配可靠性。
   2. 根据制造商标准阈值评估鉴定结果。
      注意：对于 MALDI Biotyper 和 EXS2600，分数值为：
      2.300-3.000：极有可能的物种鉴定;
      2.000-2.299：安全属鉴定、可能物种鉴定;
      1.700-1.999：可能的属鉴定;
      0.000-1.699：识别不可靠。
      在评估 MALDI Biotyper 平台得出的鉴定结果期间，使用一致性类别支持结果：A- 物种一致→最佳匹配，所有其他具有相似高分数值 （>1.999） 的匹配都指向同一物种;B - 属 一致 → 最佳匹配和其他具有相似分数值 （1.700 - 1.999） 的匹配指向同一属，但在物种水平上可能有所不同;C- 没有一致性→对物种或属级一致性的要求尚未得到满足。

结果

文化组学方法
培养组学方法是一种旨在最大限度地使微生物培养条件多样化的策略，以增加分离稀有、难以培养或以前未描述的物种的机会¹²。这使得可以更广泛地了解各种样品（例如食品样品）中存在的微生物群落的生物多样性。在菌落的视觉评估阶段就已经可以观察到微生物多样性的增加，菌落的形态、颜色、大小和生长速度各不相同，这反映了应用培养组学方法的有效性（图2）。

图 2：用于牛奶微生物组分析的培养方法中使用的不同培养基上的培养物示例图像。 中...

讨论

专门用于乳制品微生物鉴定的协议通过确保在速度、可靠性和成本效益方面达成最佳共识，比传统方法取得了重要进步。然而，协议中的一些关键步骤需要仔细关注。首先，分离和培养阶段是基础阶段。培养基和孵育条件必须与预期的微生物多样性和载量相匹配。获得纯培养物至关重要，通常需要传代培养以避免混淆 MS 鉴定的混合谱，因为在此阶段菌落分离不充分或污染会导致鉴定不明确或不正确⁴。

其次，质谱分析的样品制备是光谱质量的关键决定因素。该方案概述了三种标准方法：直接菌落转移、靶向提取和管内蛋白质提取。虽然直接转移是最简单的，但可能不够所有微生物，尤其是细胞壁较厚的革兰氏阳性菌或孢子形成细菌 ^7,8。靶向提取为许多细菌提供了简单性和功效的良好平衡¹⁴。然而，对于更具挑战性的分离株，特别是那些具有坚固细胞壁的分离株，如某些革兰氏阳性菌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70%甲酸	切姆普尔	115676307
乙 腈	默克KGaA	1.00014.1011
APT琼脂	默克KGaA	1.10453.0500
细菌检测标准	布鲁克达尔托尼克有限公司	8255343
CBL琼脂（中国蓝乳糖琼气）	默克KGaA	1.02348.0500
哥伦比亚血琼脂及nbsp;	氧化物	CM0331B
M17琼脂
牛奶盘琼天种植（MPCA）	氧化物	CM0681
MRS琼脂（德曼、罗戈萨和夏普琼脂）	默克KGaA	1.10660.0500
MSP 96 目标是抛光钢 BC	布鲁克达尔托尼克有限公司	8280800
佩普顿水	西格玛-奥尔德里奇	70179
雪德勒琼脂	西格玛-奥尔德里奇	91019
羊血	生物极大	SL0160-100
三氟乙酸	西格玛-奥尔德里奇	T6508
三氧化钠大豆琼脂（TSA）	西格玛-奥尔德里奇	22091
水	默克KGaA	1.15333.2500
&α;-氰-4-羟基肉桂酸	布鲁克达尔托尼克有限公司	8201344