小鼠咳嗽与喷嚏反射的精确诱导与区分

摘要

本研究通过向小鼠气管和鼻腔施加特定刺激，建立了小鼠咳嗽和喷嚏模型，并开发了一种基于声音的方法，通过分析其声学信号的差异来区分小鼠的咳嗽与喷嚏。

摘要

咳嗽和喷嚏作为重要的呼吸防御反射，其机制研究一直受到传统模型中非特异性刺激的限制。现有的方法（如辣椒素或柠檬酸雾化）可同时激活由气管C纤维介导的咳嗽和由鼻三叉神经介导的喷嚏，导致行为学观察结果相互混淆。尽管先前的研究尝试通过分析呼吸模式或声学特征来区分咳嗽与喷嚏，但这些研究缺乏能够特异性刺激气管和鼻腔的模型。本文中，我们建立了一种小鼠模型，通过部位特异性的刺激分别作用于气管（诱导咳嗽）和鼻腔（触发喷嚏）。结合同步多模态记录技术，包括全身体积描记法（WBP）、宽带超声麦克风（0–250 kHz）以及高速摄像（160帧/秒），我们量化了咳嗽与喷嚏各自独特的生理特征。研究发现，咳嗽和喷嚏均表现出单峰和双峰的呼吸模式，但在音频频谱组成上存在显著差异。通过构建基于声学特征的坐标系，我们能够有效区分咳嗽与喷嚏，并将其映射至坐标轴的不同象限。本研究通过解剖部位特异性刺激结合声学特征分析，建立了一种可定量区分咳嗽与喷嚏的小鼠模型，为空气道防御反射机制的研究及靶向治疗的开发提供了高精度的实验方法。

引言

咳嗽和打喷嚏是机体清除呼吸道异物的重要防御反射，其相关神经通路的异常常引发慢性咳嗽和鼻炎等慢性疾病。这两种反射均包括吸气期、压缩期和呼气期^1,2。咳嗽反射主要由迷走神经支配的气道感觉神经元介导^3,4,5。迷走神经元接收来自气道的机械性、化学性或电刺激，并将信号传递至延髓中的孤束核（NTS）⁶。NTS整合这些信息后，进一步投射至延髓和脑桥的呼吸中枢⁷。这些中枢最终协调相关的呼吸肌群（如膈肌、肋间肌和喉肌）执行咳嗽动作，通过口腔将潜在有害的刺激物和黏液排出呼吸道^8,9,10。打喷嚏反射主要由三叉神经节内的鼻部感觉神经元介导^11,12。这些神经元的机械性或化学性刺激被传递至三叉神经脊束核（SP5），再由其将信息传递至呼吸中枢^13,14,15,16。呼吸中枢调控相关肌肉（如呼吸肌、腭肌和面部肌肉）启动喷嚏反应¹⁷。强烈的呼气气流使大部分空气经鼻腔冲出，从而清除刺激物^9,18。对咳嗽和打喷嚏的研究不仅有助于阐明呼吸防御的神经机制，也为慢性咳嗽和鼻炎的治疗提供了潜在靶点。为此，建立稳定可靠的动物模型至关重要。

近年来，小鼠已成为研究咳嗽和喷嚏神经通路的关键模式生物^19,20,21目前主流的方法仍然是诱导这些反射行为 通过 吸入气溶胶化刺激物化合物^8,20,22该吸入方法的一个重要局限在于，刺激物会同时作用于鼻腔和气管，非特异性地激活介导喷嚏的不同感觉传入系统。通过 三叉神经通路）和咳嗽（通过 迷走神经通路）。这为实验中诱发行为类型的精确定义带来了重大挑战。文献中已显现出这一差异：一些研究将辣椒素诱导的小鼠呼吸反射定义为喷嚏反应²¹而其他研究则报告称，这些反射同时包含咳嗽和喷嚏成分^8,22.

为应对这一挑战，研究人员已开发出先进的方法，包括分析呼吸模式和轨迹以分类不同的反射行为⁸。另一项研究表明，咳嗽和喷嚏在时间和频谱特征（如持续时间、频率调制）上存在显著差异²²。他们的研究强调，咳嗽的能量集中在较低的峰值频率范围（20–80 kHz），而喷嚏的频率成分可延伸至90 kHz以上²²。这些声学差异为行为鉴别提供了新颖的无创分析框架，可作为传统呼吸波形分析的补充。尽管已有这些进展，仍存在一个关键空白：现有模型在刺激递送方面缺乏解剖特异性，常混淆气管和鼻腔反射通路。这一局限性表明，我们亟需更精确的方法来靶向并研究呼吸反射。

关于气道机械和化学刺激引发咳嗽与喷嚏机制的研究已在大型动物模型（例如猫）中广泛开展¹⁷。然而，在小型动物模型（例如豚鼠、大鼠和小鼠）中，由于技术上的限制，通常只能依赖气溶胶化化合物（如辣椒素或柠檬酸）来实现化学刺激。

本方案提出了一种在小鼠中诱导类似咳嗽和类似喷嚏行为的新方法，并建立了一套新的方法来量化和表征这些呼吸反射。该方法通过识别特征性发声并分析其频谱特征和声学强度，从而在小鼠中区分类似咳嗽与类似喷嚏行为。这一创新性方法有望标准化小鼠呼吸反射的量化评估，提高实验的可重复性，并加深对咳嗽和喷嚏神经生理机制的理解。

方案

所有实验均按照广州实验室动物使用与护理规程（GZLAB-AUCP- 2024-04-A10）的指南进行。本研究使用8至10周龄的雌性和雄性无特定病原体级C57BL/6小鼠。

1. 实验准备

1. 实验动物的准备
   1. 将小鼠饲养在笼中，自由摄取食物和水，于 22 ± 1 °C 环境下维持标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环。
2. 辣椒素溶液的制备
   1. 将 30.5 mg 辣椒素粉末溶解于含 10% 乙醇和 10% Tween-80 的 PBS 中，配制 10 mM 储存液。
   2. 将储存液用生理盐水按 1:100 稀释，配制 100 µM 工作液。
3. 三溴乙醇（Avertin）的制备
   1. 称取 0.5 g 三溴乙醇至 1.5 mL Eppendorf 管中，加入 1 mL 2-甲基-2-丁醇。
   2. 于 55 °C 避光条件下振荡（400–600 rpm）孵育，直至完全溶解（约 20 分钟）。
   3. 取 40 mL 生理盐水置于烧杯中，在搅拌下将已溶解的三溴乙醇溶液逐滴加入，继续搅拌至结晶完全消失（约 40 分钟）。
   4. 用 NaOH 调节 pH 至 7.0–7.3。

2. 咳嗽样行为模型的建立与记录

1. 植入套管制备
   1. 用剪刀将28 G针头（内径：0.19 mm，外径：0.35 mm）截成一段长约5 mm的套管。使用镊子夹住套管，以砂纸打磨两端使其光滑。将一端连接至硅胶管（内径：0.3 mm，外径：0.8 mm）。连接至1 mL注射器，用水冲洗套管以确认通畅性。
   2. 将套管弯曲成90°，两臂长度比为2:3。将较长的一端插入硅胶管中（内径：0.3 mm，外径：0.8 mm，长度：5 cm）； 图1A）。将弯曲的一端指定用于气管植入。将硅胶管从气管延伸至颅骨以进行固定（图1B).
2. 记录设备设置准备
   1. 准备全身体积描记系统（WBP）、超声记录仪、高速相机、微注射泵。
3. 小鼠分组
   1. 将小鼠随机分为三组（每组6只）：i）对照组：保持正常未处理状态。ii）假手术组：植入气管插管但不进行刺激。iii）刺激组：植入气管插管并给予辣椒素以诱导咳嗽。
4. 手术操作步骤
   1. 术前30分钟，通过皮下注射给予0.5–1.0 mg/kg的缓释布托啡诺。通过腹腔注射三溴乙醇（125–250 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏无反应确认麻醉完全。术前在双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。随后将小鼠置于设定温度为37 °C的加热垫上，并用无菌纱布覆盖动物。
   2. 剃除颅部和颈部毛发。将麻醉后的小鼠仰卧位固定。使用碘伏和酒精消毒。
   3. 在显微镜下：切开颈部皮肤约1 cm。钝性分离组织和肌肉以暴露气管。使用32 G针头穿刺环状软骨与气管软骨之间的软组织。用眼科剪在气管上创建一个微小开口。
      注意：切口大小应仅略大于套管直径，以防止组织损伤。
   4. 将金属导管（硅胶包被）插入气管腔约1毫米。用7-0缝线固定导管与气管连接处。
      注意：插入深度限制在1毫米以内，以避免呼吸功能受损。
   5. 在头皮上切开约1厘米。从颈部向头骨皮下钝性分离建立隧道。将硅胶管引至颅骨，并用牙科水泥固定。
   6. 缝合小鼠颈部和头顶的皮肤。将小鼠置于加热垫上直至恢复意识。在笼中饲养5天。
   7. 每日用1 mL空气注射器冲洗气管插管/导管。
      注意：诱导咳嗽前 24 小时内禁止冲洗。
5. 咳嗽录音
   1. 为超声探头安装与端口匹配的密封圈。将探头插入全脑灌注（WBP）腔室端口，确保密闭接触。
   2. 连接WBP腔室、流量传感器和偏置气流，进行校准 通过 软件
   3. 将颅骨固定的硅胶管连接至一段30 cm的延长管。将小鼠放入全身体积描记（WBP）舱内。将延长管从舱顶端口穿出，并用油泥密封端口。通过确认呼吸波形峰值维持在4 ± 2范围内，验证舱体的气密性。
   4. 用1 mL注射器吸取5 mL辣椒素溶液，排除气泡，连接至延长管。将注射器安装在微量注射泵上，并将流速设定为10 µL/min^-1.
      注意：过高的流速可能将辣椒素带入鼻腔。
   5. 将高速摄像机对准腔室，调整距离和焦距，采样率设置为160帧每秒（最大值）。
   6. 同时启动全身气溶胶暴露系统（WBP）、超声设备和相机软件；启动泵以输注辣椒素。记录10分钟内的咳嗽次数。

3. 喷嚏样行为模型的建立与记录

1. 实验设备准备
   1. 准备一根无菌PE管（内径：0.5 mm，外径：1 mm），用于固定在小鼠鼻骨上作为刺激套管。
   2. 准备一根直径为0.25 mm的无菌尼龙细丝，用于经套管鼻部刺激。参照Vonfrey校准法，当将长度为5 cm的细丝垂直压在天平上至其弯曲约45°时，测得的作用力为0.6 g。
2. 记录设备设置
   1. 准备一套全身体积描记系统、一台超声记录仪和一台高速相机。
3. 小鼠分组
   1. 将小鼠随机分为三组（n = 6/组）：i）对照组：维持未处理的基线状态。ii）假手术组：固定鼻导管但不进行刺激。iii）刺激组：固定鼻导管并诱发喷嚏 通过 丝状刺激
4. 手术操作步骤
   1. 术前30分钟，通过皮下注射给予0.5–1.0 mg/kg的缓释布托啡诺。通过腹腔注射三溴乙醇（125–250 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏无反应确认麻醉完全。术前在双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。随后将小鼠置于设定温度为37 °C的加热垫上，并用无菌纱布覆盖动物。
   2. 剃除颅骨顶部和鼻梁处的毛发。
   3. 将小鼠固定于立体定位仪中。使用碘伏和酒精消毒。切开颅骨和鼻骨上方的皮肤，暴露鼻骨。
   4. 使用微型钻头在鼻骨与鼻中隔软骨侧突连接处钻出一个0.5 mm的孔，暴露鼻黏膜。
      注意：将孔径限制在 0.5 mm 以内，以防止组织损伤。
   5. 用32 G针头轻轻抬起鼻黏膜，暴露鼻腔。
   6. 将PE管安装至立体定位仪的臂架上，调整管尖与颅骨钻孔处平齐。使用牙科水泥将导管固定于鼻骨，并缝合皮肤。
   7. 将小鼠置于加热垫上，直至意识恢复。
5. 喷嚏记录
   1. 根据说明书连接WBP腔室、流量传感器和偏置气流。使用软件进行校准。
   2. 为超声探头安装适配接口的垫圈。将探头插入腔室，确认密封严密。
   3. 将小鼠转移至WBP舱内。将PE管从顶部接口穿入，用油泥在管周密封接口。通过确认呼吸波形峰值处于4 ± 2范围内，验证舱体的气密性。
   4. 将高速摄像机对准腔室，调整距离和焦距，采样率设置为160帧每秒（最大值）。
   5. 将直径为0.25 mm的尼龙细丝通过软管推进鼻腔，深度为0–3 mm。手持软管外露出的细丝长度为5 cm。刺激时，按压该自由端直至其弯曲成45°，向鼻黏膜施加约0.6 g的力，持续1 s，每30 s重复一次。记录10 min内的喷嚏反应。

4. 小鼠辣椒素诱导的咳嗽与喷嚏

1. 分组
   1. 将小鼠分为假手术组和手术组（每组 n = 5）。假手术组：暴露双侧前筛神经和眶下神经。手术组：切断双侧前筛神经和眶下神经。
2. 超声雾化
   1. 准备行为观察箱（20 cm × 14 cm × 17 cm）。
   2. 调整超声记录仪和摄像头位置，以实现最佳监测效果。
   3. 向雾化器中加入 100 µM 辣椒素溶液，每 2 分钟输送一次，每次持续 30 秒，共进行 10 分钟。
   4. 使用超声记录仪和摄像头连续记录动物行为。

5. 数据分析流程

1. 全身体积描记法（WBP）呼吸轨迹分析
   1. 将WBP记录的文本文件导入Spike2软件，并与音频信号同步。
   2. 分析对应单峰和双峰呼吸模式的音频信号，记录每种模式下压缩相的持续时间。
   3. 选择呼气相的最低点作为中点，取该点前后各0.5秒的数据，用于计算平均值。
2. 音频波形分析
   1. 将音频文件导入Spike2软件，选取单次咳嗽或喷嚏的音频，并以TXT格式导出（采样率设置为100 kHz，持续时间为0.1 s）。
   2. 将TXT文件导入Excel，将其转换为音频信号的绝对值。
   3. 使用GraphPad Prism软件，通过包含50个点的平滑样条函数对音频波形的绝对值进行平滑处理。
      注：为确保曲线尽可能接近原始数据的同时避免过多拐点，选择50个点的平滑样条为最优方案；使用超过50个点生成的曲线与50个参数的曲线相比，偏差可忽略不计。
   4. 根据平滑后的音频波形，计算从起始点到最高点的斜率k。
3. 音频频谱分析
   1. 将音频文件导入Spike2软件。
   2. 选取单次咳嗽或喷嚏音频的起止时间点进行频谱分析，并导出频谱分析结果。
   3. 使用GraphPad Prism生成频谱分析曲线，并计算曲线下面积。
   4. 计算30–60 kHz与0–30 kHz频段曲线下面积的比值，以区分咳嗽与喷嚏。
4. 综合指数计算
   1. 对斜率k以及频谱分析曲线下的面积比值进行自然对数变换（ln），以增强数据的可区分性。

6. 统计学分析

1. 数据以均值 ± 标准误表示。两组之间的统计学比较采用 t 检验和双向方差分析，以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。所有分析均使用 GraphPad Prism 软件进行。

结果

本研究采用全身体积描记法（WBP）和超声记录技术，对小鼠咳嗽与喷嚏行为的呼吸模式进行了详细分析。结果显示，接受气管或鼻部手术的小鼠在咳嗽和喷嚏反应性方面与未经处理的对照组小鼠相当。然而，在这些经过手术处理的动物中，辣椒素（化学刺激）和机械刺激可有效诱发咳嗽和喷嚏反射（图2A，B）。WBP结果表明，这两种行为均表现出单峰和双峰模式，其声音信号出现在呼吸模式的排出阶段（图3A，C，E，G）。进一步的超声分析揭示了不同的声学特征：咳嗽声具有突然起始、强度峰值瞬时达到的特点，主要集中在0–30 kHz频率范围内，且持续时间较短（图3B，D；补充视频S1）；而喷嚏声则表现为强度逐渐增强至最大振幅，具有宽频频率分布（0–80 kHz），且持续时间更长（图3F，H；补充视频S2）。统计分析显示，单峰咳嗽行为的平均压缩相时长为32.39 ± 0.73 ms，显著短于双峰咳嗽行为的53.17 ± 2.29 ms（图4A，B，C）。单峰喷嚏行为的平均压缩相时长为44.03 ± 1.84 ms，低于双峰咳嗽行为的平均值；而双峰喷嚏行为的平均压缩相时长为74.24 ± 1.29 ms，显著长于单峰喷嚏行为（图4E，F，G）。此外，咳嗽行为中单峰模式的发生比例为77.55 ± 2.10%（图4D），而在喷嚏行为中，单峰模式仅占32.42 ± 5.88%，双峰模式则占67.58 ± 5.88%（图4H）。对声音持续时间的统计分析表明，咳嗽与喷嚏的声音时长之间存在显著差异，但两者之间也存在较大重叠（图5A）。通过对咳嗽和喷嚏超声音频的频谱分析发现，咳嗽声音的频率谱主要集中于0–30 kHz范围，而喷嚏声音在0–60 kHz范围内的占比更高（图5B）。尽管咳嗽声音在30–120 kHz范围内也存在频率成分，但低频部分的比例始终高于高频部分。因此，我们以声音强度从起始点到最大值的上升斜率（图5C）作为纵坐标，以30–60 kHz与0–30 kHz的能量比值（图5D）作为横坐标，构建了一个坐标系，可有效区分咳嗽与喷嚏的声音信号。此外，在该坐标系中，单峰与双峰咳嗽以及单峰与双峰喷嚏之间均无显著差异（图5E）。

接下来，我们采用上述分类方法，对辣椒素雾化诱导的小鼠咳嗽和喷嚏行为进行分类。我们发现，辣椒素雾化所诱导的咳嗽和喷嚏行为，与在相同坐标位置进行特异性刺激所引发的行为存在重叠（图5F，G）。在切断鼻部感觉传入神经（前筛神经和眶下神经）后，辣椒素雾化显著减少了与喷嚏相关的声学信号，而与咳嗽相关的音频特征则未受影响（图5H，I）。

图1：刺激性气管和鼻腔模型中操作的示意图。（A）导管植入气管的示意图。（B）冠状面（左）和矢状面（右）显示导管植入小鼠气管的位置。（C）矢状面显示导管在鼻腔内的植入位置以及纤维丝刺激的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：特异性位点刺激诱发的类似咳嗽和喷嚏行为的定量分析。（A）正常对照组、假手术组和机械性鼻腔刺激组的喷嚏行为定量结果。假手术组的喷嚏频率与对照组相当；机械性鼻腔刺激显著增加了喷嚏事件的发生次数。（B）正常对照组、假手术组和辣椒素气管激发组的咳嗽行为定量结果。假手术组的咳嗽频率与对照组相比无显著差异；辣椒素气管刺激显著增加了咳嗽次数。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，***P < 0.001，****P < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：咳嗽和喷嚏的呼吸轨迹及声音示波图。 （A）代表性图像，显示由辣椒素诱导咳嗽期间的单峰呼吸轨迹和音频记录。（B）图 A 中咳嗽音频记录的声音示波图（上图）和频谱图（下图）。（C）代表性图像，显示由辣椒素诱导咳嗽期间的双峰呼吸轨迹和音频记录。（D）图 C 中咳嗽音频记录的声音示波图（上图）和频谱图（下图）。（E）代表性图像，显示由机械刺激诱导喷嚏期间的单峰呼吸轨迹和音频记录。（F）图 E 中喷嚏音频记录的声音示波图（上图）和频谱图（下图）。（G）代表性图像，显示由机械刺激诱导喷嚏期间的双峰呼吸轨迹和音频记录。（H）图 G 中喷嚏音频记录的声音示波图（上图）和频谱图（下图）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：类似咳嗽和类似喷嚏行为呼吸轨迹的单峰与双峰特征。（A）具有单个呼吸峰的类似咳嗽行为的平均（红色）和个体（灰色）呼吸轨迹（n = 52）。（B）具有双呼吸峰的类似咳嗽行为的平均（红色）和个体（灰色）呼吸轨迹（n = 29）。（C）辣椒素诱导咳嗽的单峰和双峰呼吸峰压缩相持续时间（单峰 n = 52，双峰 n = 29）。（D）咳嗽中单峰与双峰呼吸峰轨迹的平均比例（n = 6 只小鼠）。（E）具有单个呼吸峰的类似喷嚏行为的平均（红色）和个体（灰色）呼吸轨迹（n = 40）。（F）具有双呼吸峰的类似喷嚏行为的平均（红色）和个体（灰色）呼吸轨迹（n = 74）。（G）机械刺激诱导喷嚏的单峰和双峰呼吸峰压缩相持续时间（单峰 n = 40，双峰 n = 74）。（H）喷嚏中单峰与双峰呼吸峰轨迹的平均比例（n = 6 只小鼠）。数据以均值 ± 标准误表示，****P < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：咳嗽与喷嚏声音示波图的频率和波形分类。（A）咳嗽和喷嚏声谱图持续时间的量化分析。（B）机械刺激诱发的喷嚏（n = 69，黑色）与辣椒素诱发的咳嗽（n = 140，红色）的平均声谱图分析。（C）计算声音示波图斜率的代表性示意图。平滑样条比较分析显示，在25个点时过度平滑会掩盖原始数据特征，而超过50个点的值（例如75个点）与50点样条曲线有显著重叠，但会引入额外的拐点。（D）面积比计算的代表性示意图，利用GraphPad Prism中的频谱分析结果计算不同频率曲线下的面积。面积比等于30–60 kHz曲线下的面积与0–30 kHz曲线下的面积之比。（E）机械刺激诱发的喷嚏和辣椒素诱发的咳嗽声音示波图的频率与波形分类，其中y轴表示声音波形从基线到峰值斜率的指数，x轴表示30–60 kHz与0–30 kHz之间声波比值的指数。（F）雾化辣椒素诱发的喷嚏（n = 36，黑色）与雾化辣椒素诱发的咳嗽（n = 42，红色）的平均声谱图分析。（G）雾化辣椒素诱发的喷嚏（n = 36，黑色）与雾化辣椒素诱发的咳嗽（n = 42，红色）声音示波图的频率和波形分类，其中y轴表示声音波形从基线到峰值斜率的指数，x轴表示30–60 kHz与0–30 kHz之间声波比值的指数。（H）切断前筛神经和眶下神经组与假手术组在辣椒素诱发喷嚏反射中的统计数据分析。（I）切断前筛神经和眶下神经组与假手术组在辣椒素诱发咳嗽反射中的统计数据分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，**P < 0.01，****P < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：咳嗽样行为与其音频频谱图同步的视频，以正常速度和 0.1 倍速度显示。请点击此处下载该文件。

补充视频 2：喷嚏样行为与其音频频谱图同步的视频，以正常速度和 0.1 倍速度显示。请点击此处下载该文件。

讨论

在本研究中，我们通过辣椒素特异性刺激小鼠气管以及机械刺激鼻腔，成功诱导出咳嗽和喷嚏行为^8,17。我们同步采集了全身体积描记法（WBP）、音频和视频记录的数据，发现音频频率比和声音强度斜率能够有效区分小鼠的咳嗽与喷嚏行为^8,23。

鉴于手术操作的精细性，必须特别关注若干关键步骤。首先，在气管手术过程中，植入的气管内套管应尽可能细，并以较浅的深度插入，以避免气道阻塞，否则可能导致呼吸困难甚至死亡。此外，由于气管内的分泌物容易堵塞导管，每日导管清理至关重要。在给予辣椒素时，注射速度必须严格控制，以防止药液反流至鼻腔，从而引发喷嚏反射。其次，在鼻骨植入手术中，钻孔的大小至关重要，需避免对小鼠造成过度损伤。导管应放置于鼻骨水平位置，不可插入过深，以防止对鼻腔产生过度刺激或干扰正常呼吸。最终，精确的手术操作对实验的成功实施至关重要。通过尽量减少对小鼠的损伤，不仅可加快其恢复速度，还能更准确地记录实验性的行为反应。此类手术方法有助于提高模型的可靠性，确保获得高质量的数据，从而为研究咳嗽、喷嚏等呼吸反射行为提供坚实的实验基础。

传统上，咳嗽行为建模依赖于辣椒素和柠檬酸等化合物的雾化吸入以诱导咳嗽^24,25。然而，这种方法存在明显局限性：它不仅引发咳嗽，还可能同时触发喷嚏反射^8,22。此外，个体对气溶胶刺激的敏感性存在显著差异²⁶，部分小鼠甚至完全不出现咳嗽反应。相比之下，本研究开发的新型机械刺激范式能够实现稳定的类咳嗽行为，并可通过更换执行器灵活定制刺激参数。类似地，使用气溶胶试剂的传统喷嚏模型也存在行为特异性差的问题，因其常伴随诱发咳嗽反应²²，从而难以区分这两种不同的呼吸反射。

既往研究已采用辣椒素建立小鼠咳嗽与喷嚏模型，并基于全身体积描记法（WBP）记录的呼吸模式特征（单峰或双峰）对二者进行区分⁸。我们的研究数据显示，在诱导产生的咳嗽行为中，单峰呼吸模式占77.55 ± 2.10%；而在喷嚏行为中，单峰模式仅占32.42 ± 5.88%。这些结果证实，基于WBP呼吸模式的分类方法在多数情况下有效，但仍存在局限性，无法实现两种行为的完全区分。此外，部分研究尝试利用声音信号的持续时间与频率特征来区分咳嗽与喷嚏²²。尽管喷嚏行为的声音信号平均持续时间通常长于咳嗽，但个体事件之间的持续时间存在显著重叠，因此仅依赖声音持续时间作为判别指标可能缺乏足够的区分能力。此外，对咳嗽与喷嚏的频谱分析尚未发现明确的分界：轻度咳嗽可能仅表现为低频信号，而剧烈咳嗽则可产生包含显著高频成分的声音，其频谱特征与喷嚏相似。值得注意的是，咳嗽事件始终表现出更高比例的低频能量。相比之下，高低频能量比（High-to-Low Frequency Energy Ratio）可能为区分咳嗽与喷嚏行为提供更具判别力的声学特征。

我们的创新通过空间受限的机械刺激克服了这些局限性。优化后的行为学模型展现出双重优势：（1）在刺激施加过程中实现毫米级精度并稳定探针，（2）增强行为特异性。此外，我们对咳嗽与喷嚏声学特征的深入分析表明，这两种行为具有明显不同的声音强度谱型，其高低频能量比存在统计学上的显著差异。进一步地，对咳嗽和喷嚏事件的全面声学分析也揭示了二者之间独特的声强分布特征，并伴有高低频能量比的显著统计学差异。此外，该分类方法在辣椒素雾化诱导的咳嗽和喷嚏行为声学记录中同样可行。综合来看，这些声学参数构建了一个多维特征空间，为区分咳嗽与喷嚏提供了客观、可量化的标准。该成果为研究气道防御机制建立了良好标准，减少了混杂因素，提高了实验可重复性。这不仅解决了呼吸反射研究中长期存在的挑战，也为咳嗽和喷嚏神经环路的精确神经调控研究开辟了新途径。

尽管该方法能有效诱导小鼠产生咳嗽和喷嚏行为，但仍存在一些局限性。与雾化诱导相比，手术可能会对小鼠造成一定程度的损伤，尽管我们在操作过程中力求将损伤降至最低。然而，手术仍能稳定地引发咳嗽和喷嚏行为，表明手术本身并未降低小鼠对这些刺激的敏感性。在行为表型分析中也出现了技术挑战。声学信号的保真度要求精确校准麦克风与受试动物之间的距离，以平衡信噪比，同时避免信号幅值饱和。此外，刺激递送导管与全身体积描记（WBP）舱室的整合需要特殊设计：导管必须从舱室顶部延伸进入，且不能妨碍小鼠的自然活动或刺激物的递送。总之，尽管手术方法存在局限性，但它为稳定诱导小鼠咳嗽和喷嚏行为提供了一种有效手段，通过精心设计的实验流程，可将对小鼠的损伤最小化，从而确保行为数据的准确采集。

综上所述，通过这些精细的外科操作和严谨的实验设计，我们建立了一种能够稳定诱导小鼠咳嗽和喷嚏行为的模型，为深入研究这两种呼吸反射行为提供了可靠的实验基础。

材料

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0.25毫米尼龙线材			https://item.taobao.com/item.htm?app =维欣&bc_fl_src=分享-1041234389 826863-2-1&bxsign=scdVy4Xlh07ZND yojKnPqZ8vQnR_0pjarQFoQH9h636l au-W1sONf-RPbGobT6VinB8J0CrFC xRXoB-tghl13JMFQh3DrBLpqflgMRg DY2repq1fcQGIoPm4AuDfQSUQXE p&CPP=1&h5_spm=a-tb-item.b-tb-ite m&id=595514372480&share_crt_ v=1&;shareurl=true&short_name=h .hIi5xvPc8rHTjez&sp_tk=eDdVczR SSG1vODU%3D&SPM=A2159R.13 376460.0.0&tbSocialPopKey=shar eItem&tk=x7Us4RHmo85&un=b3 859EAB62ef44248bd7Bab98FF2 63&un_site=0&ut_sk=1.ZZv9EYy wWWkDAI%2FaThaoYLYt_2164 6297_1755074424775.TaoPassw ord-WeiXin.1&wxsign=tbwr_qqSc esj7OBC_MTN-urBRm3r6GFm9t SERXxmOXNfgDGI3usP8mgVRu QmtuQ3LRrt9OkMGFP3XV55Hpp DzZZUQ4jUaki80cL79BKkrc85YE 5VYZfdiqppGkhao6kzkKF&x-ssr=真
28G针			https://item.taobao.com/item.htm？ 应用=weixin&bc_fl_src=分享-1041 234389566731-2-1&bxsign=scdfvM o7l21o6H5xXAgtKjf4TGT54QtHpk ED6yQRvvPvkGUKWiNyteUooM8e 6wcMmSKQpRsUCHjVo1q6Cliyp61 S3Nr1VadjTYKEJ1_SxSFZln_zI-0U omdKkkegvM6O5Rr&CPP=1&h5_sp m=a-tb-item.b-tb-item&id=670272 286239&share_crt _v=1&shareurl=true&short_name= h.hIiUFWFOj35n1LJ&sp_tk=eHFJ QTRSSE9xZDc%3D&SPM=A2159 R.13376460.0.0&tbSocialPopKey= shareItem&tk=xqIA4RHOqd7&un =b3859EAB62EF44248bd7Bab98ff eb263&un_site=0&ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt_2 1646297_17550744424775.TaoPa ssword-WeiXin.1&wxsign=tbwwJc wF20yLPkLax6kR7BPCJ3uPXx_ KPLTBjHUIph1nmN96mu0vYRC 0-DQxpG6mWPKWPZwSElseb HTR6nMzL7zthSG_67CIodTi_3i bFk7SKNFmbLeg1MVSDl9YzKs axPI&x-ssr=真
2-甲基-2-丁醇	西格玛-奥尔德里奇	240486-100ML
Avisoft 录音机 USGH	Avisoft		用于超声波记录
脑立体定向注射器	后驱	68801
辣椒素	MCE	HY-10448
电子天平	上海卓京	BSM-220.4
GraphPad 棱镜	GraphPadSoftware		用于图表和数据分析
高速摄像系统	菲尔	20102748
碘呼吸器	利尔孔		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
微注射泵	西曼诺科技	XMSP-C
塑形粘土			https://detail.tmall.com/item.htm？ app=weixin&bc_fl_src=分享-10 41234985980666-2-1&bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S&CPP=1&h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item&id=61 1429671875&share _crt_v=1&shareurl=true&short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU%3 D&spm=a2159r.13376460.0.0 &tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5&un=b385 9EAB62ef44248bd7Bab98ffeb 263&un_site=0&ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt _21646297_1755091386528.T aoPassword-WeiXin.1&wxsign =tbwPFmvLRyYmleaKSyVP7W t1XJnfAXUas_u1d5JJPUA91z9 4BTPKze3BbE2bNJHvC4-agGF ARD4JFW0c8hjdn7Z1Mfk1qgIZ VJ2SaGNFy8b809h3okigHQkp8 LhDopd5-VF&x-ssr=true
雾化器	尤威尔	M105	用于辣椒素的雾化
体育管	后驱	62323
硅胶管			https://item.taobao.com/item.htm？ id=618505617112&pisk=gFrice1c WPu1u5K6Stm15sEF8l7d5cijiSK xMmhV8XlBXSntDD-EBYH2ux8Z Ty27ifBf5cUniWPn_S2fCxl4gScY WwI8CRij0_Uc2ge6-dJRw5xZ3p Wqex8NpV5Fxrz-0_CR2epE51n 4Mg0bwy8EFXkZ3m8NK2krnm Z7jWnTxDWuCPq09XnnYxw_xu qLMksIm8q7n-ULYH-QCuZ72W nhX8Z0mPqY9DjTjoq0b1J0bq4A k5cCgtoXJh0xA0iaJbW0nvrQQhu QN-D0k4n8bR-tn-4xA2cQfKHqZ hzPf3-MWSpjm2En5hLag-nY44 7HxVGjhoT8yZsXkCkMVmK_4z q-OSaKccirl3lD1igu5Zm5PvfFJo aOzGS7w1IKlE-obgHT1yLKfuuo5 CB0fUuLW08vBK-cWa4gxVesglW 8U8O0ngpWb8XlVkIKbKQBDHRe 4RzM9XHPNgZdACRK9YXlVkIKb BhKUOj7vMOw&SPM=A21xTW.291 78619.0.0
Spike2 软件	尖刺2		用于呼吸追踪和音频分析
SpinView	菲尔		用于高速视频录制
三溴乙醇	西格玛-奥尔德里奇	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
WBP 支持软件	拖曳技术		用于WBP录音
WBP体积描记系统	拖曳技术	2403-3204