小鼠早发性卵巢功能不全模型的制备与评价

摘要

本方案阐述了一种通过注射环磷酰胺构建早发性卵巢功能不全小鼠模型的方法。via 环磷酰胺注射构建的该模型能够有效、便捷且灵活地模拟人类早发性卵巢功能不全的病理进展过程，具有高度的可靠性和成本效益。

摘要

早发性卵巢功能不全（POI）是一种导致女性不孕的重要疾病，需要可靠的动物模型以开展机制与治疗研究。本文介绍了一种建立和评估环磷酰胺（CTX）诱导的POI小鼠模型的标准化方案。选取6至8周龄、动情周期规律的雌性小鼠，进行腹腔注射CTX：第1天给予100 mg/kg的初始剂量，随后连续14天每日给予20 mg/kg剂量。通过动态监测动情周期的变化 通过 阴道涂片细胞学检测采用 Wright 染色法。采用 ELISA 法测定血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）和抗缪勒管激素（AMH）水平，以评估内分泌变化。通过苏木精-伊红（H&E）染色进行卵巢组织病理学评估。&E）染色法对石蜡包埋切片进行染色以定量分析卵泡闭锁程度，同时通过免疫组化检测caspase-3剪切片段以评估颗粒细胞凋亡。结果显示，CTX处理小鼠出现动情周期紊乱、雌二醇（E2）和抗穆勒氏管激素（AMH）水平显著降低、促卵泡激素（FSH）浓度升高、卵泡闭锁增加以及颗粒细胞凋亡增强，证实了早发性卵巢功能不全（POI）模型构建成功。该建模方法可高度模拟化疗所致卵巢损伤的机制，呈现出卵泡储备耗竭和性激素紊乱等典型病理特征，为揭示化疗生殖毒性机制、筛选卵巢保护药物及优化生育力保存策略提供了可靠的实验平台。此外，该模型操作相对简便、成本低、制备周期短，易于开展和推广。该方法学符合 乔维 用于可视化、逐步展示的实验演示。

引言

早发性卵巢功能不全（POI）是女性生殖衰老障碍中最常见的形式，不仅通过雌激素缺乏症状和生殖功能障碍严重损害患者的身心健康，还会增加多种共病风险，包括骨折、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病等¹。因此，开发高效且安全的治疗策略已成为现代医学中极为紧迫的优先事项。鉴于临床样本获取有限、病因多因素性以及POI研究相关的高伦理风险，建立可靠的动物模型以支持系统的机制研究和安全性验证已变得不可或缺。

目前，化疗诱导的卵巢损伤模型被广泛用于早发性卵巢功能不全（POI）的研究。环磷酰胺（CTX）是一种具有免疫抑制特性的烷化剂，已被确认为强效的生殖腺毒性化合物。其作用机制是通过引起DNA交联损伤来抑制细胞增殖²，从而导致卵巢储备细胞发生凋亡^3,4。基于CTX的模型能够有效模拟POI的临床特征，包括原始卵泡耗竭、低雌激素血症以及卵泡刺激素（FSH）水平升高。在小鼠中采用腹腔注射CTX具有明显优势：通过腹膜快速吸收实现高生物利用度，操作标准化且技术变异小，适合大规模研究并具有成本效益。值得注意的是，小鼠的卵巢结构与人类高度相似，有利于动态观察卵泡耗竭过程及激素水平变化。此外，小鼠成本低、繁殖速度快，能够满足大样本研究的需求。

尽管....

方案

本方案已通过安徽神东生物科技发展有限公司伦理委员会审查并批准（伦理编号：SDLL202502281）。本研究在所有动物实验操作中均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指导方针。实验所用雌性C57BL/6小鼠年龄为6–8周，在无特定病原体（SPF）条件下饲养。C57BL/6小鼠为近交系，属于C57品系的一个亚系，其特征为黑色被毛。实验前，小鼠在动物实验室中经一周的适应性饲养，环境温度与湿度严格控制，并维持12小时光照/12小时黑暗循环，以模拟自然昼夜节律。在适应期间，小鼠可自由获取 随意摄取 食物和水的获取

1. 动物准备

注意：选择24只6至8周龄、具有正常动情周期的SPF级雌性C57BL/6小鼠。连续10天于上午9:00采集小鼠阴道灌洗液，制备脱落阴道细胞涂片。观察动情周期，并挑选出至少具有一个连续且完整周期的小鼠。

1. 实验前让小鼠在环境中适应1周。适应期结束后，使用耳缘打孔法对小鼠进行标记，并在标记后立即记录体重。
2. 牢固抓握小鼠，直至其因自然应激而排尿。用左手拇指和食指捏住小鼠背部颈部皮肤以固定，将小鼠头部朝下放置，充分暴露腹部区域。
3. 将无菌移液器吸头安装至微量移液器上。吸取10 µL无菌生理盐水溶液。通过阴道管腔进行三次连续冲洗循环，并将灌洗液保留在移液器吸头内。
4. 将灌洗液....

结果

建立POI小鼠模型的过程如图2所示。从小鼠首次注射药物的第一天开始记录其体重和动情周期。在连续注射CTX 15天后，POI组小鼠的平均体重下降率（3.717% ± 1.463%）显著高于空白组（0.2526% ± 0.1469%）和NS组（0.4305% ± 0.2494%）（p < 0.0001）。NS组与空白组之间的体重变化差异无统计学意义（p > 0.05）（图3A）。

通过观察小鼠阴道脱落细胞涂片来监测动情周期。结果显示，POI组小鼠的动情周期紊乱，表现为动情间期延长或阴道脱落细胞持续出现不规则变化。空白组与NS组之间动情周期的规律性无显著差异。正常情况下，小鼠的动情周期依赖于卵泡的依次发育、成熟及排卵过程。因此，动情周期的紊乱直接反映了卵巢功能障碍。

完成15天的药物注射后，使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）和抗缪勒.......

讨论

卵巢早衰（POI）严重影响女性的身心健康和生活质量，其全球患病率逐年上升。然而目前对于POI仍缺乏安全有效的治疗方法。建立可靠且可重复的动物模型对于推进POI研究至关重要。临床上，POI的病因多样，化疗药物是已知的重要致病因素⁸。作为烷化剂类化疗药物，CTX主要通过氧化应激和颗粒细胞凋亡引起卵巢毒性，导致卵泡加速闭锁⁹。使用烷化剂环磷酰胺构建动物模型，可模拟化疗所致的卵巢损伤，使POI研究更具针对性。

在现有研究中，环磷酰胺的给药方案多种多样。例如，雌性ICR小鼠可连续14天每天腹腔注射50 mg/kg CTX⁷，或连续3天每天给予80 mg/kg CTX¹⁰，或单次注射120 mg/kg CTX¹¹。为了建立标准化的实验方案，本研究对给药方案进行了优化。鉴于长期低剂量CTX注射可对卵巢结构和功能造成更显著且稳定的损伤

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Sangon Bioengineering Co., Ltd	A500684-0500
75% 酒精	山东德鑫康医疗科技有限公司	200603
无水乙醇	蚌埠化学试剂厂
离心管	biosharp	BS-15-M
冷台	全林医疗	QL-LT20230003
棉球	山东光辉有限公司	20241008
盖玻片	江苏世泰实验设备有限公司	80312-3412
环磷酰胺	Baxter Oncology GmbH	3K645A
脱水机	湖北孝感海阔医疗科技有限公司	KH-TS
染色机	湖北孝感海阔医疗科技有限公司	KH-S101
EA50 染色液	湖北泰康医疗设备有限公司	J7EC20
耳标钳	深圳瑞沃德生命科学与技术有限公司	C22002-10
高效切片石蜡	桐乡华菱蜡业有限公司	20241018
电热鼓风干燥箱（烘箱）	上海跃进医疗器械有限公司	HCZF-11
电热恒温水浴箱	上海跃进医疗器械有限公司	HSW-600
包埋机	普瑞斯泰常州医疗器械有限公司	PMB-A
伊红染液	赛维尔生物技术有限公司	G1005-2
苏木精分化液	赛维尔生物技术有限公司	G1039-500ML
苏木精染色液	赛维尔生物技术有限公司	G1005-1
异氟烷	山东安特畜牧科技有限公司	2024101501
显微镜	安徽嘉尚生物科技有限公司	SQS-12P
小鼠抗苗勒管激素（AMH）ELISA 试剂盒	恒远生物技术	HB1334-Mu
小鼠雌二醇（E2）酶联免疫分析试剂盒	恒远生物技术	HB975-Mu
小鼠促卵泡激素（FSH）ELISA 试剂盒	恒远生物技术	HB967-Mu
中性树胶	南昌玉鹭实验设备有限公司	240504
病理组织漂白装置	普瑞斯泰常州医疗器械有限公司	PHY-III
PBS 缓冲液	biosharp	BL302A
移液器吸头	biosharp	BS-10-T
移液器	大龙医疗设备有限公司	YE213AT0257922
快速组织脱水机	湖北孝感海阔医疗科技有限公司	KH-TS
切片机	Gheddy	YD-315
载玻片	江苏世泰实验设备有限公司	80312-3161
涂片机	湖北泰康医疗设备有限公司	131001305
氯化钠注射液	武汉滨湖双鹤药业有限公司	240525K04
注射器	江苏致宇医疗器械有限公司
振动切片机	上海智信仪器有限公司	ZQP-86
二甲苯	天津凯通化学试剂有限公司	20240102