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方法文章

小鼠早发性卵巢功能不全模型的制备与评价

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DOI：

10.3791/69000

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2025年9月19日

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

本文内容

摘要

本方案阐述了一种通过注射环磷酰胺构建早发性卵巢功能不全小鼠模型的方法。via 环磷酰胺注射构建的该模型能够有效、便捷且灵活地模拟人类早发性卵巢功能不全的病理进展过程，具有高度的可靠性和成本效益。

摘要

早发性卵巢功能不全（POI）是一种导致女性不孕的重要疾病，需要可靠的动物模型以开展机制与治疗研究。本文介绍了一种建立和评估环磷酰胺（CTX）诱导的POI小鼠模型的标准化方案。选取6至8周龄、动情周期规律的雌性小鼠，进行腹腔注射CTX：第1天给予100 mg/kg的初始剂量，随后连续14天每日给予20 mg/kg剂量。通过动态监测动情周期的变化 通过 阴道涂片细胞学检测采用 Wright 染色法。采用 ELISA 法测定血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）和抗缪勒管激素（AMH）水平，以评估内分泌变化。通过苏木精-伊红（H&E）染色进行卵巢组织病理学评估。&E）染色法对石蜡包埋切片进行染色以定量分析卵泡闭锁程度，同时通过免疫组化检测caspase-3剪切片段以评估颗粒细胞凋亡。结果显示，CTX处理小鼠出现动情周期紊乱、雌二醇（E2）和抗穆勒氏管激素（AMH）水平显著降低、促卵泡激素（FSH）浓度升高、卵泡闭锁增加以及颗粒细胞凋亡增强，证实了早发性卵巢功能不全（POI）模型构建成功。该建模方法可高度模拟化疗所致卵巢损伤的机制，呈现出卵泡储备耗竭和性激素紊乱等典型病理特征，为揭示化疗生殖毒性机制、筛选卵巢保护药物及优化生育力保存策略提供了可靠的实验平台。此外，该模型操作相对简便、成本低、制备周期短，易于开展和推广。该方法学符合 乔维 用于可视化、逐步展示的实验演示。

引言

早发性卵巢功能不全（POI）是女性生殖衰老障碍中最常见的形式，不仅通过雌激素缺乏症状和生殖功能障碍严重损害患者的身心健康，还会增加多种共病风险，包括骨折、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病等1。因此，开发高效且安全的治疗策略已成为现代医学中极为紧迫的优先事项。鉴于临床样本获取有限、病因多因素性以及POI研究相关的高伦理风险，建立可靠的动物模型以支持系统的机制研究和安全性验证已变得不可或缺。

目前，化疗诱导的卵巢损伤模型被广泛用于早发性卵巢功能不全（POI）的研究。环磷酰胺（CTX）是一种具有免疫抑制特性的烷化剂，已被确认为强效的生殖腺毒性化合物。其作用机制是通过引起DNA交联损伤来抑制细胞增殖2，从而导致卵巢储备细胞发生凋亡3,4。基于CTX的模型能够有效模拟POI的临床特征，包括原始卵泡耗竭、低雌激素血症以及卵泡刺激素（FSH）水平升高。在小鼠中采用腹腔注射CTX具有明显优势：通过腹膜快速吸收实现高生物利用度，操作标准化且技术变异小，适合大规模研究并具有成本效益。值得注意的是，小鼠的卵巢结构与人类高度相似，有利于动态观察卵泡耗竭过程及激素水平变化。此外，小鼠成本低、繁殖速度快，能够满足大样本研究的需求。

尽管具有这些优势，CTX给药方案（例如单次推注与分次注射）和给药时间窗的异质性导致了不同研究之间建模结果不一致。为弥补这一不足，我们提出了一种系统性方案，优化在小鼠中诱导原发性卵巢功能不全（POI）的CTX剂量和给药频率。本研究旨在通过定量评估卵巢储备耗竭、激素失调及组织病理学相关指标，建立一个可重复的动物模型，从而为机制探索和治疗药物筛选提供一个可靠的平台。

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方案

本方案已通过安徽神东生物科技发展有限公司伦理委员会审查并批准（伦理编号：SDLL202502281）。本研究在所有动物实验操作中均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指导方针。实验所用雌性C57BL/6小鼠年龄为6–8周，在无特定病原体（SPF）条件下饲养。C57BL/6小鼠为近交系，属于C57品系的一个亚系，其特征为黑色被毛。实验前，小鼠在动物实验室中经一周的适应性饲养，环境温度与湿度严格控制，并维持12小时光照/12小时黑暗循环，以模拟自然昼夜节律。在适应期间，小鼠可自由获取 随意摄取 食物和水的获取

1. 动物准备

注意：选择24只6至8周龄、具有正常动情周期的SPF级雌性C57BL/6小鼠。连续10天于上午9:00采集小鼠阴道灌洗液，制备脱落阴道细胞涂片。观察动情周期，并挑选出至少具有一个连续且完整周期的小鼠。

  1. 实验前让小鼠在环境中适应1周。适应期结束后，使用耳缘打孔法对小鼠进行标记，并在标记后立即记录体重。
  2. 牢固抓握小鼠，直至其因自然应激而排尿。用左手拇指和食指捏住小鼠背部颈部皮肤以固定，将小鼠头部朝下放置，充分暴露腹部区域。
  3. 将无菌移液器吸头安装至微量移液器上。吸取10 µL无菌生理盐水溶液。通过阴道管腔进行三次连续冲洗循环，并将灌洗液保留在移液器吸头内。
  4. 将灌洗液均匀涂布于玻璃显微镜载玻片上，在室温下完全空气干燥。将细胞浸入95%乙醇中固定以保存。根据实验参数对载玻片进行完整标记，并在未处理时将其存放于避光的载玻片盒中，于4 °C条件下保护性保存。
  5. 瑞氏染色方案
    1. 将载玻片浸入95%乙醇中（3–10分钟），然后在蒸馏水下彻底冲洗。
    2. 将载玻片转移至95%乙醇浴中（持续1分钟）。
    3. 使用洁净滤纸刮除苏木精溶液表面的氧化膜。将载玻片浸入过滤后的苏木精溶液中（5分钟）。
    4. 用蒸馏水冲洗载玻片，短暂浸入1% HCl溶液中（<1秒），最后进行长时间的蒸馏水冲洗。
    5. 使用橙黄G（Orange G）与EA50溶液配制混合染液。将载玻片浸入混合染液中染色（3分钟）。
    6. 将载玻片依次通过三个95%乙醇浴（每个间隔5秒）。
    7. 分两个阶段用二甲苯处理（每阶段2分钟）。
      注意：操作应在通风橱内进行，避免吸入二甲苯蒸气。使用后立即关闭容器。
    8. 使用中性树脂封片介质永久保存标本
  6. 在显微镜下观察载玻片时，识别具有淡粉色胞质和深紫色细胞核的细胞为有核上皮细胞，不规则鳞状、无核、呈淡粉色的细胞为角化上皮细胞，小而圆形、呈蓝色的细胞为白细胞。
    注意：根据以下细胞学特征判断动情周期阶段：（1）动情前期：以有核上皮细胞为主，表现为单个细胞或成片聚集，白细胞稀少（<5%视野）；（2）动情期：大量无核角化上皮细胞，特征为大而扁平、边界不规则的形态，白细胞和有核细胞几乎不存在（合计<2%）；（3）动情后期：角化细胞数量减少，出现白细胞浸润，有核上皮细胞重新出现（占20%–40%）；（4）动情间期：以白细胞和有核细胞为主（>80%），角化细胞几乎不存在（<1%）5。参照图1中的标准化细胞学图谱进行模式验证。
  7. 整理并分析数据，筛选出24只具有正常动情周期的小鼠。

2. 环磷酰胺注射液的制备

注意：环磷酰胺对光不稳定，整个操作过程中应避光处理。环磷酰胺具有毒性，操作时应穿戴防护服、双层丁腈手套和口罩。

  1. 将200 mg无菌药用级环磷酰胺粉末加入10 mL无菌生理盐水中，充分混匀，得到20 mg/mL的环磷酰胺溶液。保留一部分立即使用；用剩余溶液配制其他浓度。
  2. 取200 µL的20 mg/mL储备液加入一支用铝箔包裹的1.5 mL离心管中，加入800 µL无菌生理盐水，终体积为1 mL。涡旋振荡混匀30秒，得到4 mg/mL溶液。分装成14份等量样品（每份1 mL）。将所有样品置于-20 °C垂直放置的试管架中保存。

3. 注射环磷酰胺溶液

注意：使用计算机系统将24只小鼠随机分为三组：（1）空白组：不进行任何处理（n = 8）；（2）生理盐水对照组（NS）：给予生理盐水（n = 8）；（3）POI组：环磷酰胺处理组（n = 8）。每天上午9:00进行注射。对于POI组，第1天腹腔注射100 mg/kg的环磷酰胺溶液，随后连续14天每天腹腔注射20 mg/kg的环磷酰胺溶液。对NS组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水，空白组小鼠则不作任何处理。每次注射前需每日称量所有小鼠的体重，并在注射后采集阴道脱落细胞进行涂片。

  1. 用镊子将浸有异氟烷的棉球放入可密封容器中。将小鼠置于容器内，进行10秒吸入麻醉。
    注意：异氟烷是一种具有特定毒性和刺激性的挥发性麻醉剂，操作应在通风良好的环境中进行，并遵循机构批准的规程。
  2. 计算注射体积：体重（g）× 5 = µL。用75%乙醇棉片消毒右下腹区域。以30–45°角（斜面向上）插入26 G针头，穿过腹壁推进5 mm，直至 "流行病学" 感觉。以 50 µL/s 的速率输送溶液。
  3. 将残留液体和受污染的设备放入贴有标签的避光废物容器中 "光敏性废物"将沾有异氟烷的棉球丢弃至指定的密封容器中，容器须贴有明显的“有害废物”标签。
  4. 将冷冻的4 mg/mL分装样品在37 °C水浴中解冻（3 min）。重新计算每日剂量：体重（g）× 5 = µL。在装填注射器前确认溶液澄清。

4. 血清采集

注意：在注射环磷酰胺溶液15天后，采集所有小鼠心脏尖端的血液。离心后获取血清。对照组和NS组小鼠应在动情间期采样。POI组小鼠与对照组/NS组小鼠进行时间匹配的配对采样，并确认处于动情间期。

  1. 麻醉小鼠
    1. 将小鼠放入一个透明、密闭的容器中，容器内放置浸有异氟烷的棉球。
    2. 观察小鼠的行为。当小鼠失去翻正反射（即轻柔地将其翻至仰卧位时无法自行恢复体位）时，表明麻醉诱导充分。此过程通常需要 2–3 分钟。
    3. 将小鼠从容器中取出。用左手固定其头部，右手食指轻轻按压上眼睑。右手持无菌棉签，蘸取红霉素眼膏，取直径约 1–2 mm 的量。
      1. 将眼膏均匀涂抹于眼球表面及眼睑内侧。闭合眼睑后，用指尖轻轻按摩 10 秒，使眼膏均匀分布。用干燥的棉签擦去眼部周围多余的药膏。
  2. 将小鼠仰卧位固定于泡沫板上。使用手术剪修剪胸部毛发。用 75% 乙醇对胸腹部区域进行消毒。
    1. 沿中线切开皮肤和皮下组织。沿胸骨左侧纵向切开肋间肌，暴露心脏。
  3. 将注射器（针尖斜面朝上）以约 30° 角插入心脏心尖部位。缓慢推进针头并轻柔抽吸。将采集的血液注入 1.5 mL 离心管中。
  4. 将采集的血液放入离心机。设置离心条件为 4 °C、850 × g 离心 10 分钟。使用移液器吸取上层血清，转移至 0.5 mL 离心管中。于 -80 °C 保存。

5. 血清雌激素、FSH 和 AMH 的检测

  1. 将冷冻的血清置于4 °C冰箱中过夜，使其缓慢融化。
  2. 提前30分钟将ELISA试剂盒从冰箱中取出，使其中的试剂恢复至室温。
  3. 根据试剂盒说明书，使用标准品稀释液对标准品进行系列稀释。通常设置多个浓度梯度，如0、10、20、40、80、160 pg/mL等。
  4. 将稀释后的标准品和待测血清样本各100 µL加入ELISA板的相应孔中。同时设置空白对照孔，每孔加入100 µL样本稀释液。
  5. 将ELISA板放入37 °C培养箱中孵育1–2小时，使抗原与抗体充分结合。
  6. 孵育结束后，小心吸去孔内液体。用洗涤液洗涤ELISA板3–5次，每次洗涤后轻轻拍干ELISA板，去除残留洗涤液。
  7. 每孔加入100 µL酶标抗体工作液，继续在37 °C培养箱中孵育1小时。
  8. 重复上述洗涤步骤，洗涤3–5次，并将ELISA板拍干。
  9. 每孔加入100 µL底物溶液，轻轻振荡混匀。在37 °C避光孵育15–30分钟，直至出现明显的蓝色。
  10. 每孔加入100 µL终止液以终止反应，观察颜色由蓝色变为黄色。
  11. 使用酶标仪在450 nm波长下读取各孔的吸光度值（A值），并记录数据。
  12. 以标准品浓度为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。通常采用多项式拟合，确保标准曲线的相关系数r²大于0.99。
    1. 根据标准曲线，将待测血清样本的吸光度值代入标准曲线方程，计算样本中激素的浓度。

6. 卵巢组织的采集

  1. 按照机构批准的方案，通过颈椎脱位法处死仍处于麻醉状态的小鼠，然后使用手术剪打开小鼠的腹部。
  2. 卵巢位于肾脏下方，包裹在白色脂肪垫中。用镊子轻轻提起脂肪垫以暴露卵巢和输卵管。使用剪刀将卵巢与周围结缔组织分离。
  3. 将取出的卵巢组织放入4%多聚甲醛中固定24小时。

7. 石蜡切片的制备

  1. 脱水：取出卵巢，依次通过不同浓度的乙醇溶液（75%、85%、95%、100%），每步持续1 h。
  2. 透明处理：先将卵巢置于二甲苯与乙醇的混合液中处理15 min；然后分别浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中，各15 min。
  3. 浸蜡：将卵巢浸入二甲苯与石蜡的混合液中；随后转移至石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ和石蜡Ⅲ中，每步0.5 h。
  4. 包埋：将浸蜡后的卵巢置于包埋模具中，调整组织方向（切面朝下），倒入熔化的石蜡，冷却凝固。
  5. 切片：使用切片机将石蜡块切成5 µm厚的切片，进行连续切片，并用毛笔小心转移切片带，确保其在水浴中漂浮时形成均匀、半透明且无扭曲变形的平整条带。

8. H&E 染色

  1. 脱蜡：将石蜡包埋的切片浸入二甲苯Ⅰ中，10分钟。然后将切片转移至二甲苯Ⅱ中，再浸泡10分钟。
  2. 复水：依次将切片通过不同浓度的乙醇溶液：100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇，每种浓度浸泡5分钟。最后用蒸馏水冲洗切片1分钟。
  3. 苏木精染色：将切片浸入苏木精染色液中染色5分钟。用流水冲洗切片30秒。
  4. 分化：将切片浸入1%盐酸乙醇溶液中1-3秒。用流水冲洗切片1-2分钟。
  5. 胞质染色：浸入伊红Y溶液中（1分钟）。用滤纸吸去多余染液。
  6. 脱水：将切片依次通过下列乙醇溶液：85%乙醇、95%乙醇和100%乙醇（两次），每次浸泡5秒。
  7. 透明：将切片浸入二甲苯Ⅰ中5分钟。然后将切片转移至二甲苯Ⅱ中，再浸泡5分钟。
  8. 封片：在染色后的切片上滴加中性树胶。小心地盖上盖玻片。
  9. 卵泡计数：在显微镜下观察染色切片。计数并记录不同发育阶段的卵泡数量。

9. 卵巢组织中 Caspase-3 的免疫组织化学检测

  1. 抗原修复：将脱蜡并复水的切片放入柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，在微波炉中高火加热5分钟，取出后自然冷却。
    1. 重复加热过程2次，共进行3次加热循环。待自然冷却后，用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
  2. 内源性过氧化物酶灭活：在切片上滴加3% H₂O₂，室温避光孵育10分钟。用PBS洗涤切片3次，每次3分钟。
  3. 血清封闭与抗体孵育：在切片上滴加兔抗caspase-3一抗，置于湿盒中4 °C过夜孵育。次日，将切片恢复至室温30分钟。用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
  4. 显色、复染与封片：使用DAB进行显色，通常持续约1–5分钟。用苏木精复染切片2分钟。复染后，用PBS洗涤5分钟。
    1. 然后将切片置于氨水中1分钟，使其返蓝。最后依次进行梯度乙醇脱水、透明处理，并封片。

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结果

建立POI小鼠模型的过程如图2所示。从小鼠首次注射药物的第一天开始记录其体重和动情周期。在连续注射CTX 15天后，POI组小鼠的平均体重下降率（3.717% ± 1.463%）显著高于空白组（0.2526% ± 0.1469%）和NS组（0.4305% ± 0.2494%）（p < 0.0001）。NS组与空白组之间的体重变化差异无统计学意义（p > 0.05）（图3A）。

通过观察小鼠阴道脱落细胞涂片来监测动情周期。结果显示，POI组小鼠的动情周期紊乱，表现为动情间期延长或阴道脱落细胞持续出现不规则变化。空白组与NS组之间动情周期的规律性无显著差异。正常情况下，小鼠的动情周期依赖于卵泡的依次发育、成熟及排卵过程。因此，动情周期的紊乱直接反映了卵巢功能障碍。

完成15天的药物注射后，使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）和抗缪勒...

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讨论

卵巢早衰（POI）严重影响女性的身心健康和生活质量，其全球患病率逐年上升。然而目前对于POI仍缺乏安全有效的治疗方法。建立可靠且可重复的动物模型对于推进POI研究至关重要。临床上，POI的病因多样，化疗药物是已知的重要致病因素8。作为烷化剂类化疗药物，CTX主要通过氧化应激和颗粒细胞凋亡引起卵巢毒性，导致卵泡加速闭锁9。使用烷化剂环磷酰胺构建动物模型，可模拟化疗所致的卵巢损伤，使POI研究更具针对性。

在现有研究中，环磷酰胺的给药方案多种多样。例如，雌性ICR小鼠可连续14天每天腹腔注射50 mg/kg CTX7，或连续3天每天给予80 mg/kg CTX10，或单次注射120 mg/kg CTX11。为了建立标准化的实验方案，本研究对给药方案进行了优化。鉴于长期低剂量CTX注射可对卵巢结构和功能造成更显著且稳定的损伤

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者衷心感谢吴阶平医学基金会通过其临床科研专项资助项目（项目编号：320.6750.17067）提供的资金支持。我们还衷心感谢安徽神东生物科技发展有限公司提供的研究平台和技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛Sangon Bioengineering Co., LtdA500684-0500
75% 酒精山东德鑫康医疗科技有限公司200603
无水乙醇蚌埠化学试剂厂
离心管biosharpBS-15-M
冷台全林医疗QL-LT20230003
棉球山东光辉有限公司20241008
盖玻片江苏世泰实验设备有限公司80312-3412
环磷酰胺Baxter Oncology GmbH3K645A
脱水机湖北孝感海阔医疗科技有限公司KH-TS
染色机湖北孝感海阔医疗科技有限公司KH-S101 
EA50 染色液湖北泰康医疗设备有限公司J7EC20
耳标钳深圳瑞沃德生命科学与技术有限公司C22002-10
高效切片石蜡桐乡华菱蜡业有限公司20241018
电热鼓风干燥箱（烘箱）上海跃进医疗器械有限公司HCZF-11
电热恒温水浴箱上海跃进医疗器械有限公司HSW-600
包埋机普瑞斯泰常州医疗器械有限公司PMB-A
伊红染液赛维尔生物技术有限公司G1005-2
苏木精分化液赛维尔生物技术有限公司G1039-500ML
苏木精染色液赛维尔生物技术有限公司G1005-1
异氟烷山东安特畜牧科技有限公司2024101501
显微镜安徽嘉尚生物科技有限公司SQS-12P
小鼠抗苗勒管激素（AMH）ELISA 试剂盒恒远生物技术HB1334-Mu
小鼠雌二醇（E2）酶联免疫分析试剂盒恒远生物技术HB975-Mu
小鼠促卵泡激素（FSH）ELISA 试剂盒恒远生物技术HB967-Mu
中性树胶南昌玉鹭实验设备有限公司240504
病理组织漂白装置普瑞斯泰常州医疗器械有限公司PHY-III
PBS 缓冲液biosharpBL302A
移液器吸头biosharpBS-10-T
移液器大龙医疗设备有限公司YE213AT0257922
快速组织脱水机湖北孝感海阔医疗科技有限公司KH-TS
切片机GheddyYD-315
载玻片江苏世泰实验设备有限公司80312-3161
涂片机湖北泰康医疗设备有限公司131001305
氯化钠注射液武汉滨湖双鹤药业有限公司240525K04
注射器江苏致宇医疗器械有限公司
振动切片机上海智信仪器有限公司ZQP-86
二甲苯天津凯通化学试剂有限公司20240102

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