多重实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

摘要

该协议使用多重实时荧光定量PCR，引物/探针靶向SA特异性nuc和MRSA mecA基因。它可以快速（<1 小时）定性检测人痰样本中的 SA/MRSA 核酸，克服了基于培养的方法的局限性。

摘要

金黄色葡萄球 菌（S.aureus）是一种常见的革兰氏阳性人类病原体，可引起社区获得性和院内感染，临床表现多种多样，从局部浅表病变、食物中毒到致命的全身感染。抗生素的发现显著降低了死亡率，但耐药性问题却从此日益突出。自 1960 年首次发现 MRSA 以来，该毒株已成为全球公共卫生威胁。MRSA是院内感染的主要病原体，能够引起心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎、化脓性关节炎、菌血症等多种严重疾病。因此，快速准确地检测 金黄色葡萄球 菌及其耐药性对于指导临床治疗至关重要。

目前金 黄色葡萄球 菌和MRSA的常规检测方法具有显著的局限性。传统的细菌培养方法，几十年来一直是“金标准”，可以提供明确的物种鉴定和药物敏感性结果，但该过程耗时，需要 48 至 72 小时。此外，这种方法容易受到污染，并且依赖于专门的实验室设施和熟练的技术人员。血清学检测通过检测患者血清中的 金黄色葡萄球 菌抗体来实现无创诊断，但无法区分活动性感染和既往感染，也无法识别耐药菌株（如MRSA）。

本研究的重点是开发一种新型的多重实时荧光PCR检测方法，以克服上述局限性。该方法设计了针对 金黄色葡萄球 菌物种特异性nuc基因和介导甲氧西林耐药性的mecA基因的特异性引物和TaqMan荧光探针，能够在单个反应体系中同时扩增和检测金 黄色葡萄球 菌和MRSA。该技术大大缩短了检测时间，为 金黄色葡萄球 菌和MRSA检测提供了快速、准确且经济高效的解决方案。这种创新方法大大提高了临床诊断效率，有利于靶向抗生素治疗的早期实施，为控制耐药细菌感染做出了重要贡献。

引言

金黄色葡萄球菌是一种广泛分布的革兰氏阳性条件病原体，定植于健康个体的鼻粘膜 ^1,2。当宿主免疫力受损时，可引起局部皮肤感染、深层组织侵袭或全身性疾病（如肺炎、心内膜炎、骨髓炎和菌血症）³。甲氧西林是一种半合成青霉素，于1959年临床应用于金黄色葡萄球菌感染，两年后，MRSA在英国出现，迅速传播到丹麦、法国、瑞士等欧洲国家^4。MRSA 对β-内酰胺类抗生素的耐药性不仅使临床管理复杂化，而且还显着增加感染风险⁵。多种因素——包括无法控制的定植/传播、高昂的预防成本和抗生素的过度使用——共同推高了 MRSA 感染率⁶。由于其快速传播和复杂的耐药机制，MRSA 感染与高病死率有关，欧盟国家每年报告近 150,000 例病例和 >7,000 例死亡⁷。根据CHINET监测数据，过去五年中国MRSA感染率一直保持在30%^以上8。院内交叉感染的高风险进一步加剧了公共卫生负担并给医疗保健系统带来了压力 ^9,10。因此，开发高效、精准的MRSA快速检测技术对于实现早期诊断、个性化治疗、降低死亡率和中断传播链在临床上是迫切的。

目前金 黄色葡萄球 菌和MRSA的检测技术涵盖多个领域，包括表型检测、基因组检测、转录组检测、蛋白质组检测、质谱技术和基于生物信息学的分析¹¹。

表型检测方法，如圆盘扩散法（KB法）和最小抑制浓度法（MIC法），被临床和实验室标准协会（CLSI）和欧洲抗菌素药敏试验委员会（EUCAST）推荐为“金标准”。这些方法具有不需要专门仪器的优点，被广泛用于电药谱监测和流行病学调查。然而，它们的缺点也很明显：培养期长（超过24小时），并且一些新抗生素的KB方法结果需要通过MIC值进行验证，断点菌株的结果易受人为因素的影响^12,13。

在基因组水平检测方法中，常规PCR具有灵敏度高、特异性强等特点，能够初步判断耐药性，缩短实验时间，成本低、效率高。但它的局限性在于只能检测已知的耐药基因并依赖专门的仪器¹⁴。微生物耐药性机制高度复杂，因此开发能够覆盖未知耐药表型并能够快速识别的技术方法至关重要。新兴的GoPhAST-R（通过RNA检测结合基因型和表型AST）技术通过检测mRNA表达水平来确定耐药表型，能够同时检测多种病原体的不同耐药相关基因，缩短实验周转时间，并与机器学习相结合时达到94-99%的准确率¹⁵。

在蛋白质组学水平的检测方法中，PBP2a乳胶凝集法基于抗原-抗体特异性结合，作简单，结果迅速，对MRSA具有较高的特异性和灵敏度。但不能区分不同种类的葡萄球菌，市售试剂盒的检测灵敏度有所下降，需要用苯唑西林⁸诱导后重新检测。

基于MALDI-TOF质谱的检测方法，如DOT-MGA（DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification）方法，在孵育6-8小时后达到最佳分析性能，检出率高达96.4%，灵敏度和特异性均为100%。但成本高，目标板上的位置有限，难以同时检测数百个样品^16,17。

在生物信息学分析技术结合组学数据进行耐药性预测中，全基因组测序技术以其高分辨率和全面的信息分析能力脱颖而出。结合Resfinder等耐药基因分析数据库，可以分析菌株是否携带特异性抗性基因，预测耐药潜力，检测单核苷酸多态性（SNP）和耐药相关基因突变体，同时支持全基因组数据的存储和再分析¹⁸。然而，这种方法需要具有生物信息学背景的专业人员进行作，很少用于日常检测，常用于病原体的流行病学分析或分子监测¹⁹。

上述方法要么成本高、耗时，要么仍处于研发阶段。在临床上，迫切需要一种平衡“即时性”和“准确性”的解决方案——一种新型的多重荧光PCR技术通过在单个试管中同时扩增nuc/mecA基因来填补这一空白，将检测周期压缩到1小时。它精确弥合了传统“紧急筛查-耐药分型”过程中的时间窗口差距，为院内感染防控提供了更省时的分子诊断工具。这种特异性PCR检测主要用于呼吸道标本的检测，以痰标本为典型。它表现出 500 拷贝/mL 的灵敏度和高特异性，同时不受抗菌剂的影响。由于这些良好的性能特征，该PCR检测在呼吸道感染的诊断和MRSA引起的院内感染监测方面具有重要的应用价值。

方案

本研究经广东省人民医院伦理委员会批准（伦理编号：KY2025-510-01）。有关本研究中使用的材料（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息，请参阅 材料表。

1. 标本采集和保存协议

1. 纳入标准：除质量控制材料外，使用金标准方法（基于培养的测定）将所有收集的样品确定为阳性标本。
2. 采集人痰
   1. 使用无菌采样管从受试者的下呼吸道收集 1-3 mL 深咳痰液。立即密封管并运输以进行分析。立即处理样品进行测试。
3. 标本储存：
   1. 及时分析通过上述方法采集的样品。在以下条件下允许短期储存：
      2-8°C：≤7天
      -20°C ± 5°C：≤6个月
      -70°C ± 5°C：≤24个月
      注意：在本研究中，痰液样本未用防腐剂（如BHI肉汤+甘油等）处理。采集后，在上述条件下储存，严禁反复冻融。避免重复冻融循环。最大允许冻融循环：≤3。

2.核酸提取

注意：在生物安全柜内完成所有程序以避免污染。

1. 对于痰样预处理，将样品与4%NaOH溶液按1：4的比例（痰样：4%NaOH溶液）混合，使粘稠的痰液标本液化并消除干扰杂质，然后涡旋彻底（30 s）并在室温（22-25°C）下孵育30 min，以达到液化。
2. 核酸提取试剂的制备
   1. 从套件中取出预包装的 96 孔板。轻弹 96 孔板，将试剂和磁珠浓缩到 96 孔板的底部。
   2. 小心撕下铝箔密封膜，避免振动96孔板，防止液体溅出。
   3. 在 96 孔板的第 1 列和第 7 列溶液中：首先，加入 20 μL 蛋白酶 K，然后加入 200-300 μL 样品进行提取。
3. 自动核酸提取（基于磁珠的方法）
   1. 将预包装的添加样品的96孔板放入自动核酸提取仪器的相应槽中。
   2. 遵循核酸提取过程，如下所述。
      1. 使用实验室室上的磁棒，将吸附有核酸的磁珠转移到不同的试剂孔中。
      2. 使用搅拌装置快速反复混合液体，使液体和磁珠混合均匀。
      3. 随着液体和磁珠的和谐结合，全自动核酸提取机经过细胞裂解、核酸吸附（70°C，15 min，磁吸3次）、洗涤（3次，每次混合2 min，然后进行磁吸附2次（每次15 s）和洗脱（2次，每次混合5 min， 3倍磁吸附），最终得到高纯度的核酸。
      4. 使用分光光度计验证核酸浓度和纯度。核酸样品体积为50 μL，浓度范围为50-100 ng/μL，A260/A280比值为1.8 ± 0.2。
   3. 程序结束后，直接从第6柱和第12柱中吸出含有核酸的洗脱液进行后续检测。如果需要，将剩余提取的核酸样品储存在-20°C，以便长期保存和将来使用。

3. 金黄色葡萄球 菌核酸和MRSA核酸的qPCR检测

1. 扩增试剂的制备
   1. 从试剂盒中取出核酸扩增反应溶液和nuc/mecA反应溶液（金黄色葡萄球菌的nuc基因特异性引物/探针，MRSA的mecA）。22-25°C解冻后，充分振荡混合均匀，然后进行瞬时离心（~6000g，15秒，22-25°C）。
   2. 根据待测样品数N，以N+2的总量配制试剂（N为样品数，2为阴性和阳性质控）。具体步骤如下：
      1. 制备反应系统混合物（16 μL 核酸扩增反应溶液（缓冲液、dNTP、DNA 聚合酶、UDG 酶）+ 4 μL nuc/mecA 反应溶液（靶检测基因 nuc、mecA 和 GAPDH 内部参考的引物和探针）。
      2. 将其加入适当大小的离心管中，充分振荡并混合均匀，并进行瞬时离心（~6000 g，15 s，22°C-25°C）。然后将每管 20 μL 分配到 PCR 反应管中。
2. 添加核酸和质控样本：
   1. 在上述制备的PCR反应管（20μL）中，分别加入5μL来自测试样品、阳性对照和阴性对照的核酸，达到每管25μL的最终体积。
   2. 盖紧试管并进行瞬时离心（~6000 × g，15 秒，22-25 °C），然后将试管放入 PCR 仪器中。
3. PCR扩增：
   1. 循环程序设置如下：预变性：97°C，90秒，1个循环;以下 2 个步骤，共 42 个循环：97 °C 变性 2 秒和 55 °C 退火 15 秒。
   2. 荧光信号检测参数设置如下： 使用nuc 基因的FAM荧光标记; mecA 基因的VIC荧光标记;以及 GAPDH 基因的 CY5 荧光标记作为试剂盒的内部对照。在 55 °C 下收集数据。 反应完成后，确保保存数据以供将来分析。
   3. 使用 qPCR 专用软件 （SLAN 96P） 分析数据：
      1. 样品信息：在软件的孔板布局图中，标注与样品上样位置对应的样品类型（如阳性对照、阴性对照、未知样品、内部参比基因等）。
      2. 放置反应管：打开仪器加热模块的盖子，将密封的PCR板/管稳定地放入其中，确保它们与加热模块紧密贴合，并盖紧模块盖（避免温度不均匀）
      3. 开始反应：确认软件中的程序设置正确后，单击开始 运行 并记录实验 ID 以备日后参考。
      4. 停止运行并取出试管：程序运行完毕后，等待加热模块温度降至50°C以下，然后打开盖子取出PCR板/试管，并妥善处理样品。
4. 数据分析
   1. 数据分析前，确认三个视觉结果：1）所有样品（包括内控）的扩增曲线均呈典型的S形，无平坦或异常延迟的上升曲线;2）荧光阈值线穿过曲线的指数相位，内部对照（如GAPDH）的Ct值在≤38个周期以内（变异系数<5%）;3） 在整个实验中包括阴性/阳性对照，以监测污染的可能性。
      1. 如果实验失控，请重新检查整个批次。如果样品显示异常扩增（例如非典型 S 曲线或临界范围内的 Ct 值），请重新检查该特定标本。
   2. 在软件中调用实验数据，设置阈值和基线，并自动或手动计算Ct值，因为仪器会自动选择基线阈值。将最终阳性确定值设置为 Ct ≤ 36;内部参考基因的参考范围需要 Ct ≤ 38。确认它们的扩增曲线表现出特征性的 S 形轮廓。

结果

使用qPCR检测 金黄色葡萄球菌和MRSA
基于 金黄色葡萄球 菌的物种特异性nuc基因和MRSA的mecA耐药基因，设计了用不同荧光团标记的引物和探针进行qPCR检测。整个 qPCR 实验的所有质量控制结果始终在推荐阈值范围内，证实了检测结果的可靠性（图 1）。

在这项研究中，我们验证了检测试剂盒的灵敏度（检测限）、精密度和阳性/阴性一致性率。

检测限 （LOD）：为了评估试剂盒检测低丰度核酸的能力，对 500 拷贝/mL 的质量控制材料进行了 8 次重复测试。结果表明，nuc的Ct值为33.56—34.69，mecA为34.33—35.35。所有扩增图都显示出特征性的S状结肠荧光曲线，与有效的指数扩增一致，实现了100%的阳性率（图2，表1

讨论

准确、早期检测甲氧西林耐药性对于 金黄色葡萄球菌感染的预后至关重要。早期鉴定 金黄色葡萄球 菌和MRSA可以减少广谱抗生素的滥用，降低导致细菌耐药性出现和传播的选择压力。

传统的表型检测方法，如头孢西丁盘扩散，需要18-24 h的培养期，并且对异种耐药菌株表现出较高的假阴性率，难以满足严重感染的快速诊断需求²⁰。实时荧光PCR技术的出现，推动了病原体鉴定从表型依赖性推断向直接基因型检测的转变。通过对靶向核酸序列的高特异性识别，实现耐药基因的快速分型，为临床精准管理提供分子基础。

PCR技术在MRSA检测中应用已久，多重PCR成为MRSA检测的关键方法²¹。Pereira 等人建立了用于 MRSA 检测的多重 PCR 方案²²。然而，临床样本中含有蛋白质等杂质，可以抑制PCR反应，多重...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全自动核酸提取仪	达安	智能 32	用于DNA提取
BSC-1500IIA2-X	生物碱	SEDA 20143222263	生物安全柜
电动离心机	韦尔泰克		将残留的液体从管壁上离心
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测试剂盒	博杰	ZC-HX-38-2型	耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗性基因的检测
核酸提取试剂盒	博杰	TQ-BG-001-96B	提取核酸
SLAN 全自动医用 PCR 分析系统	宏石		数据分析
SLAN-96S 实时荧光定量 PCR 机	宏石	SLAN-96S型	荧光定量PCR扩增
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Scientific	纳米滴一号	DNA、RNA 和蛋白质的定量分析
超低温冷冻机 （DW-YL450）	梅林	SEDA 20172220091	-20 &g;C用于储存试剂
涡旋-5	麒麟钟		用于混合试剂