本方案采用多重实时荧光定量PCR，引物和探针靶向金黄色葡萄球菌（SA）特异性的nuc基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因，可实现快速（<1 小时），可定性检测人痰液样本中的SA/MRSA核酸，克服了基于培养方法的局限性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
研究文章
* These authors contributed equally
本方案采用多重实时荧光定量PCR，引物和探针靶向金黄色葡萄球菌（SA）特异性的nuc基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因，可实现快速（<1 小时），可定性检测人痰液样本中的SA/MRSA核酸，克服了基于培养方法的局限性。
Staphylococcus aureus（S. aureus）是一种常见的人类革兰氏阳性病原菌，可引起社区获得性感染和医院内感染，临床表现多样，从局部浅表病变和食物中毒到致命性全身感染不等。抗生素的发现显著降低了其所致疾病的死亡率，但随之而来的耐药性问题日益突出。自1960年首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）以来，该菌株已成为全球公共卫生的重大威胁。MRSA是医院内感染的主要病原体之一，可导致心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎、化脓性关节炎和菌血症等多种严重疾病。因此，对S. aureus及其耐药性的快速、准确检测对于指导临床治疗至关重要。
当前常规检测方法 S.aureus 以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）存在显著局限性。传统的细菌培养方法作为数十年来的“金标准”，虽可提供明确的菌种鉴定和药物敏感性结果，但耗时较长，通常需要48至72小时。此外，该方法易受污染，且依赖专业的实验室设备和熟练的技术人员。血清学检测通过检测 S.aureus 患者血清中的抗体，但无法区分活动性感染与既往感染，也不能识别耐药菌株（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）。
本研究旨在开发一种新型多重实时荧光PCR检测方法，以克服上述局限性。该方法针对金黄色葡萄球菌（S.aureus）的种特异性nuc基因以及介导甲氧西林耐药的mecA基因，设计特异性引物和TaqMan荧光探针，可在同一反应体系中实现对S.aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的同步扩增与检测。该技术显著缩短了检测时间，为S.aureus和MRSA的检测提供了一种快速、准确且经济高效的方法。这一创新策略显著提高了临床诊断效率，有助于尽早实施靶向抗菌治疗，对控制耐药菌感染具有重要意义。
S. aureus 是一种广泛存在的革兰氏阳性条件致病菌，可定植于健康个体的鼻黏膜1,2。当宿主免疫力受损时，可引起局部皮肤感染、深层组织侵袭或全身性疾病（如肺炎、心内膜炎、骨髓炎和菌血症）3。甲氧西林是一种半合成青霉素，于1959年首次用于临床治疗金黄色葡萄球菌感染，两年后， 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在英国出现，并迅速传播至丹麦、法国和瑞士等欧洲国家4。MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性不仅使临床治疗复杂化，还显著增加了感染风险5。多种因素，包括难以控制的定植与传播、高昂的预防成本以及抗生素的过度使用，共同导致MRSA感染率持续上升6。由于其传播迅速且耐药机制复杂，MRSA感染具有较高的病死率；据报告，欧盟国家每年约有15万例病例，>7,000例死亡7。根据CHINET监测数据，中国MRSA感染率在过去五年中一直保持在30%以上8。医院内交叉感染的高风险进一步加重了公共卫生负担，并对医疗系统造成压力9,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究经广东省人民医院伦理委员会批准（伦理编号：KY2025-510-01）。有关本研究中所用材料（试剂、化学品、仪器设备和软件）的详细信息见材料表。
1. 标本采集与保存方案
2. 核酸提取
注意：为避免污染，所有操作均须在生物安全柜内完成。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
使用qPCR检测S. aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）
基于S. aureus的种特异性nuc基因和MRSA的mecA耐药基因，我们设计了带有不同荧光标记的引物和探针用于qPCR检测。qPCR实验过程中所有质量控制结果均持续处于推荐阈值范围内，证实了检测结果的可靠性（图1）。
在本研究中，我们验证了该检测试剂盒的灵敏度（检测限）、精密度以及阳性/阴性符合率。
检测下限（LOD）：为评估试剂盒检测低丰度核酸的能力，对浓度为500拷贝/mL的质控样品进行了8次重复检测。结果显示，nuc基因的Ct值范围为33.56至34.69，mecA基因的Ct值范围为34.33至35.35。所有扩增曲线均呈现典型的S型荧光曲线，符合高效的指数扩增特征，阳性检出率达到100%（图2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
准确且早期检测耐甲氧西林耐药性对于由S. aureus引起的感染的预后至关重要。早期鉴定S. aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可减少广谱抗生素的滥用，并降低导致细菌耐药性出现和传播的选择性压力。
传统的表型检测方法（如头孢西丁纸片扩散法）需要18-24小时的培养周期，且对异质性耐药菌株的假阴性率较高，难以满足严重感染的快速诊断需求20。实时荧光PCR技术的出现推动了病原体鉴定从依赖表型推断向直接基因型检测的转变。通过高特异性识别靶向核酸序列，该技术可实现耐药基因的快速分型，为临床精准管理提供分子依据。
PCR 技术长期以来已应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测，其中多重 PCR 已成为 MRSA 检测的关键方法21。Pereira 等人建立了一种用于 MRSA 检测的多重 PCR 方案22。然而，临床样本中含有蛋白质等杂.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在任何竞争利益。
本研究由广东省医学科研基金（A2025034）资助。本工作得到上海伯杰医疗科技股份有限公司的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及论文撰写过程中均未参与。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自动化核酸提取仪 | DAAN | Smart 32 | 用于DNA提取 |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | 生物安全柜 |
| E-Centrifuge | WEALTEC | 离心去除管壁残留液体 | |
| 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测试剂盒 | BOJIE | ZC-HX-38-2 | 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因 |
| 核酸提取试剂盒 | BOJIE | TQ-BG-001-96B | 提取核酸 |
| SLAN全自动医用PCR分析系统 | HONGSHI | 数据分析 | |
| SLAN-96S实时荧光定量PCR仪 | HONGSHI | SLAN-96S | 荧光定量PCR扩增 |
| Thermo Scientific NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop One | 对DNA、RNA和蛋白质进行定量分析 |
| 超低温冰箱（DW-YL450） | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C用于试剂储存 |
| Vortex-5 | Kylin-bell | 用于试剂混匀 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。