多重实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

摘要

该协议使用多重实时荧光定量PCR，引物/探针靶向SA特异性nuc和MRSA mecA基因。它可以快速（<1 小时）定性检测人痰样本中的 SA/MRSA 核酸，克服了基于培养的方法的局限性。

摘要

金黄色葡萄球 菌（S.aureus）是一种常见的革兰氏阳性人类病原体，可引起社区获得性和院内感染，临床表现多种多样，从局部浅表病变、食物中毒到致命的全身感染。抗生素的发现显著降低了死亡率，但耐药性问题却从此日益突出。自 1960 年首次发现 MRSA 以来，该毒株已成为全球公共卫生威胁。MRSA是院内感染的主要病原体，能够引起心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎、化脓性关节炎、菌血症等多种严重疾病。因此，快速准确地检测 金黄色葡萄球 菌及其耐药性对于指导临床治疗至关重要。

目前金 黄色葡萄球 菌和MRSA的常规检测方法具有显著的局限性。传统的细菌培养方法，几十年来一直是“金标准”，可以提供明确的物种鉴定和药物敏感性结果，但该过程耗时，需要 48 至 72 小时。此外，这种方法容易受到污染，并且依赖于专门的实验室设施和熟练的技术人员。血清学检测通过检测患者血清中的 金黄色葡萄球 菌抗体来实现无创诊断，但无法区分活动性感染和既往感染，也无法识别耐药菌株（如MRSA）。

本研究的重点是开发一种新型的多重实时荧光PCR检测方法，以克服上述局限性。该方法设计了针对 金黄色葡萄球 菌物种特异性nuc基因和介导甲氧西林耐药性的mecA基因的特异性引物和TaqMan荧光探针，能够在单个反应体系中同时扩增和检测金 黄色葡萄球 菌和MRSA。该技术大大缩短了检测时间，为 金黄色葡萄球 菌和MRSA检测提供了快速、准确且经济高效的解决方案。这种创新方法大大提高了临床诊断效率，有利于靶向抗生素治疗的早期实施，为控制耐药细菌感染做出了重要贡献。

引言

金黄色葡萄球菌是一种广泛分布的革兰氏阳性条件病原体，定植于健康个体的鼻粘膜 ^1,2。当宿主免疫力受损时，可引起局部皮肤感染、深层组织侵袭或全身性疾病（如肺炎、心内膜炎、骨髓炎和菌血症）³。甲氧西林是一种半合成青霉素，于1959年临床应用于金黄色葡萄球菌感染，两年后，MRSA在英国出现，迅速传播到丹麦、法国、瑞士等欧洲国家^4。MRSA 对β-内酰胺类抗生素的耐药性不仅使临床管理复杂化，而且还显着增加感染风险⁵。多种因素——包括无法控制的定植/传播、高昂的预防成本和抗生素的过度使用——共同推高了 MRSA 感染率⁶。由于其快速传播和复杂的耐药机制，MRSA 感染与高病死率有关，欧盟国家每年报告近 150,000 例病例和 >7,000 例死亡⁷。根据CHINET监测数据，过去五年中国MRSA感染率一直保持在30%^以上8。院内交叉感染的高风险进一步加剧了公共卫生负担并给医疗保健系统带来了压力 ^9,....

方案

本研究经广东省人民医院伦理委员会批准（伦理编号：KY2025-510-01）。有关本研究中使用的材料（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息，请参阅 材料表。

1. 标本采集和保存协议

1. 纳入标准：除质量控制材料外，使用金标准方法（基于培养的测定）将所有收集的样品确定为阳性标本。
2. 采集人痰
   1. 使用无菌采样管从受试者的下呼吸道收集 1-3 mL 深咳痰液。立即密封管并运输以进行分析。立即处理样品进行测试。
3. 标本储存：
   1. 及时分析通过上述方法采集的样品。在以下条件下允许短期储存：
      2-8°C：≤7天
      -20°C ± 5°C：≤6个月
      -70°C ± 5°C：≤24个月
      注意：在本研究中，痰液样本未用防腐剂（如BHI肉汤+甘油等）处理。采集后，在上述条件下储存，严禁反复冻融。避免重复冻融循环。最大允许冻融循环：≤3。

2.核酸提取

注意：在生物安全柜内完成所有程序以避免污染。

1. 对于痰样预处理，将....

结果

使用qPCR检测 金黄色葡萄球菌和MRSA
基于 金黄色葡萄球 菌的物种特异性nuc基因和MRSA的mecA耐药基因，设计了用不同荧光团标记的引物和探针进行qPCR检测。整个 qPCR 实验的所有质量控制结果始终在推荐阈值范围内，证实了检测结果的可靠性（图 1）。

在这项研究中，我们验证了检测试剂盒的灵敏度（检测限）、精密度和阳性/阴性一致性率。

检测限 （LOD）：为了评估试剂盒检测低丰度核酸的能力，对 500 拷贝/mL 的质量控制材料进行了 8 次重复测试。结果表明，nuc的Ct值为33.56—34.69，mecA为34.33—35.35。所有扩增图都显示出特征性的S状结肠荧光曲线，与有效的指数扩增一致，实现了100%的阳性率（图2，表1

讨论

准确、早期检测甲氧西林耐药性对于 金黄色葡萄球菌感染的预后至关重要。早期鉴定 金黄色葡萄球 菌和MRSA可以减少广谱抗生素的滥用，降低导致细菌耐药性出现和传播的选择压力。

传统的表型检测方法，如头孢西丁盘扩散，需要18-24 h的培养期，并且对异种耐药菌株表现出较高的假阴性率，难以满足严重感染的快速诊断需求²⁰。实时荧光PCR技术的出现，推动了病原体鉴定从表型依赖性推断向直接基因型检测的转变。通过对靶向核酸序列的高特异性识别，实现耐药基因的快速分型，为临床精准管理提供分子基础。

PCR技术在MRSA检测中应用已久，多重PCR成为MRSA检测的关键方法²¹。Pereira 等人建立了用于 MRSA 检测的多重 PCR 方案²²。然而，临床样本中含有蛋白质等杂质，可以抑制PCR反应，多重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全自动核酸提取仪	达安	智能 32	用于DNA提取
BSC-1500IIA2-X	生物碱	SEDA 20143222263	生物安全柜
电动离心机	韦尔泰克		将残留的液体从管壁上离心
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测试剂盒	博杰	ZC-HX-38-2型	耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗性基因的检测
核酸提取试剂盒	博杰	TQ-BG-001-96B	提取核酸
SLAN 全自动医用 PCR 分析系统	宏石		数据分析
SLAN-96S 实时荧光定量 PCR 机	宏石	SLAN-96S型	荧光定量PCR扩增
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Scientific	纳米滴一号	DNA、RNA 和蛋白质的定量分析
超低温冷冻机 （DW-YL450）	梅林	SEDA 20172220091	-20 &g;C用于储存试剂
涡旋-5	麒麟钟		用于混合试剂