优化的 LIVE/DEAD 测定与流式细胞术相结合，用于量化酵母细胞的应激后存活率

摘要

在这里，我们提出了一种方案来量化酵母样品中的应激后存活率。该测定采用两种荧光染料 SYTO 9 和碘化丙啶 （PI） 来量化质膜完整性。它使用流式细胞术为氧化应激后样品提供活细胞、死细胞和受损细胞组分的定量和可重复估计。

摘要

量化存活率是酵母研究中一项常见且关键的任务。基于质膜完整性的LIVE/DEAD染色剂与流式细胞术结合使用时，为酵母存活提供了快速、高通量的检测。然而，染色缓冲液、染料浓度、孵育时间和流式细胞术设置的变化会影响数据质量和重现性。该协议提供了一种标准化的LIVE/DEAD测定，用于使用流式细胞术在酵母中进行应激后生存定量。用不同剂量的过氧化氢处理机会性酵母病原体光 头念珠菌后，用由SYTO 9和碘化丙啶（PI）组成的双组分LIVE/DEAD染色剂对后应激样品进行染色。流式细胞术用于区分活细胞、受损细胞和死细胞群，并量化它们在每个样品中的百分比。将基于活体百分比统计量的存活估计值与同一样本的菌落形成单位 （CFU） 结果进行比较。这两种方法对模拟剂量和致死剂量（1 M H₂O₂）处理的样品产生了一致的结果。在100mM H₂O₂的亚致死剂量下，SYTO 9 / PI估计的存活率高于CFU，反映了两者之间的关键差异，其中此处介绍的方案在应激后立即评估细胞存活率，而CFU量化了能够恢复和繁殖的细胞百分比。因此，该协议在细胞死亡过程的早期阶段测量活力。总之，此处描述的方案为酵母中的应激后存活定量提供了CFU的快速且可扩展的替代方案。其结果通过评估早期阶段的存活率并区分死亡细胞和受损细胞，为 CFU 提供了补充信息。

引言

出芽酵母亚门包含许多重要的生物学和生物技术模型。酵母研究中的一项常见且关键的任务是量化遗传或环境扰动的影响，后者包括应激或药物治疗。例如，在工业发酵中，生产者必须监测酵母培养物的活力，以确保发酵过程的效率和质量 ^1,2。在研究致病酵母菌种时，测量其在胁迫或抗真菌治疗后的存活率对于了解感染相关性状（如抗真菌耐药性）的遗传和机制基础至关重要。在临床环境中，测量导管和表面的存活率也是一项重要任务³.这些不同的场景都需要能够快速准确地测量药物和应激治疗结果的定量方法。

实现上述目标的现有方法根据其衡量标准分为三大类。第一类测量克 隆原性，或单个酵母细胞在应激后形成单个菌落的能力。该类别中的代表性方法是菌落形成单元（CFU）测定。第二类测量 活力，它依赖于检测活细胞中的酶活性。例子包括化学探针，例如 FUN-1 染料⁴。第三类方法测量质膜完整性 - 质膜完整性的不可逆损失被认为是细胞死亡的“不归路”^5。此类示例包括荧光染料，例如碘化丙啶 （PI）。

这项工作提出了一种优化的LIVE/DEAD测定与流式细胞术相结合，以实现应激处理后酵母存活的快速和可扩展的定量。这种基于膜通透性的测定比CFU更快，染色时间为15-30分钟，而菌落形成孵育时间为24-48小时。此外，除了显微镜之外，还可以使用流式细胞术轻松分析用 LIVE/DEAD 染色剂染色的样品，显微镜可在几秒钟内测量数万个细胞，并可以轻松处理 96 孔样品以进行高通量检测。因此，该检测是快速、定量且可扩展的。在该协议中，使用由 SYTO 9 和 PI 组成的双组分 LIVE/DEAD 染色剂来实现增强的分辨率。SYTO 9 标记所有细胞，无论是活的还是死的，而 PI 仅进入质膜受损的细胞 ^6,7。因此，活细胞只积累SYTO 9，而死细胞同时积累SYTO 9和PI。由于PI对核酸的亲和力高于SYTO 9，因此它在细胞⁸中竞争性地排除了后者。此外，这两种染料形成 Förster 共振能量转移 （FRET） 对，其中 SYTO 9 发射被 PI 吸收作为其激发。结果，死细胞表现出柔和的绿色和强烈的红色荧光。相比之下，活细胞显示亮绿色荧光⁸。这种差异可以在每组内荧光强度存在变化的情况下更好地区分活细胞和死细胞。

自 2004 年首次报告其在酵母中的应用以来，SYTO 9/PI 在酵母研究中的使用一直参差不齐，并且主要局限于使用显微镜 7,9,10,11,12,13,14,15 进行定性评估。采用其作为酵母存活定量测定的一个主要限制是缺乏系统表征以及与广泛使用的方法（如 CFU）的比较。该协议描述了一种标准化测定，包括染色缓冲液，染料浓度，染色时间和流式细胞术设置，发现当应用于光滑念珠菌和另外两种酵母物种时，可以最大限度地减少伪影并产生可重复的结果¹⁶。由于 SYTO 9/PI 染色揭示了中间“受损”细胞群，其染色模式与活细胞和死细胞不同，因此它可以通过揭示有关应激处理对酵母细胞影响的更细致入微的信息来补充 CFU，从而有可能实现新的应用。

方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1、双氧水应力的应用

1. 至少在实验前一天，将过夜的 光滑念珠菌 培养物从新鲜划线板上的单个菌落接种到3mL合成完全（SC）培养基（1.7g/L酵母氮碱，完全氨基酸混合物，2%w / v葡萄糖，水）中，并通过将玻璃管放入滚筒中并在30°C下生长来培养。 或者，可以通过将玻璃管倾斜放置并以 200 rpm 的速度摇动培养物来使用轨道振荡器。
   1. 第二天早上测量过夜培养物的光密度（OD₆₀₀），并用新鲜的SC培养基将其稀释至OD₆₀₀ ~0.2，总体积为10mL。让它生长两次倍增，大约需要 4 小时，以达到对数中期 （OD₆₀₀ ~1） 阶段。
      示例：如果过夜培养物的OD₆₀₀ = 10，则将200μL该培养物添加到9.8mL SC培养基中。
2. 在应力处理前30分钟内，制备双氧水应力介质。将过氧化氢从 30% 储备液 （9.798 M） 连续稀释到合成完整 （SC） 培养基中至所需浓度。包括模拟治疗（不添加过氧化氢的 SC）和致死剂量（1 M 适用于 光滑念珠菌）。
   示例：要制备 100 mM 过氧化氢应激培养基，请将 10.3 μL 9.798 M 过氧化氢储备液加入 1 mL SC 中。要制备 10 mM 过氧化氢应激培养基，请将 500 μL 的 100 mM 过氧化氢应激培养基稀释到 4.5 mL SC 中。
3. 测量对数培养物的OD₆₀₀ ，并通过添加SC培养基将其标准化为，例如OD₆₀₀ = 1。
   示例：对数中培养物的OD₆₀₀ = 1.2。每 1 mL 培养物加入 0.2 mL SC 培养基。
4. 根据测试条件将 600 μL 对数中培养物转移到 96 深孔板中。在室温下以3,000 x g 离心5分钟沉淀细胞。通过抽吸小心地去除上清液，不要干扰细胞沉淀。
5. 将步骤 1.2 中制备的 600 μL 模拟或过氧化氢应激培养基加入每个孔中，轻轻移液以重悬细胞。
6. 将板在 30°C 下孵育 120 分钟，并以 300 rpm 摇动。
   注意：孵育时间取决于感兴趣的生物学问题。

2. SYTO 9/PI染色剂的应用

1. 在实验之前，准备至少10mL无菌0.85%盐水缓冲液。
   注意：我们发现，与去离子水或生长培养基相比，0.85%盐水缓冲液产生的染色伪影最小，即在模拟处理的样品中未染色和死样细胞¹⁶。
2. 使用无菌去离子水制备 0.2 mM 的 PI 工作储备溶液。
   注意：这种PI工作库存可在4°C下储存长达6个月。
3. 在实验前，用无菌去离子水制备33.4μM的工作SYTO 9储备溶液。
   注意：为每次实验准备新鲜的 SYTO 9 工作储备液。请勿储存和重复使用。
4. 轻轻移液以混合处理板中每个孔中的细胞。测量每种处理条件的OD₆₀₀ ，并计算将细胞重悬至OD₆₀₀ 为1所需的缓冲液量。
   注意：多通道移液器可用于高效、均匀的混合。避免过度混合样品。
5. 通过以3,000 x g 离心5分钟，在模拟或应激处理后收集酵母细胞。通过抽吸小心地去除上清液。将细胞重悬于无菌0.85%盐水缓冲液中，至OD₆₀₀ = 1（在步骤2.4中计算）。
   注意：使用多通道移液器重悬细胞。小心处理所有处理后培养物，避免过度混合。
6. 每个样品保留 50 μL 作为未染色和单染料染色对照。
   注意：在SYTO 9和PI的两个通道中，野生型 C. glabrata 的自发荧光极小。但是，请务必检查未染色的样品是否有自发荧光，并进行适当的背景减法或使用低自发荧光生长培养基。
7. 将 16 μL 后处理样品等悬于 0.85% 盐水缓冲液中，直至 50 μL PCR 管中。将 2 μL 0.2 mM PI 工作储备液加入细胞悬液中。然后将 2 μL 的 33.4 μM SYTO 9 工作储备液加入同一管中，最终体积为 20 μL。
   1. PI 和 SYTO 9 的最终浓度分别为 20 μM 和 3.34 μM。轻轻移液混合并在室温下在黑暗中孵育30分钟（可以使用黑匣子）。

3. 设置和校准流式细胞仪

注意：这应该在每台新仪器以及 SYTO 9/PI 染色的新应用上进行，包括不同的物种/菌株、新的应激源或生长方案等。以下设置是在 Attune NxT 流式细胞仪上开发的。有关具体说明，请参阅所用仪器的用户手册。

1. 为流式细胞仪选择合适的荧光通道/滤光片：使用 530 nm ± 30 nm 带通滤光片 （BL1） 和 600 nm 长通滤光片 （> 600 nm，BL3） 收集绿色 （SYTO 9） 和红色 （PI 和 SYTO 9） 通道中的信号。两人都对 488 nm 蓝色激光器感到兴奋。
2. 将流速设置为 200 μL/min，并在收集到至少 30,000 个事件时停止。
   注意：可以调整每个样本的事件数，以实现对百分比的稳健估计。应排除事件（细胞）过少的样本。下一步是在初始设置期间调整 FSC 和 SSC 通道上的电压。
3. 将 16 μL 模拟处理的未染色样品稀释到 200 μL 无菌 0.85% 盐水缓冲液中。在流式细胞术前立即轻轻移液混合。运行此示例并调整 FSC 和 SSC 通道的电压，使总体位于 FSC 与 FSC 的中心。SSC 密度图。
   注意：FSC 和 SSC 分别使用 345 mV 和 399 mV 的电压。接下来的步骤是在初始设置期间调整收集（BL1和BL3）通道上的电压。
4. 将 24 μL 模拟处理的样品与 24 μL 1000 mM 过氧化氢处理或热灭活的样品混合。
5. 将混合的活细胞和死细胞样品分成三个管，每个管 16 μL。用（1）2μL SYTO 9和2μL水染色三个试管30分钟;（2）2μL PI和2μL水30分钟;（3） 2 μL SYTO 9 和 2 μL PI 30 分钟。遵循上一节中的染色方案。
   1. 孵育后，向每个试管中加入 200 μL 无菌 0.85% 盐水缓冲液。他们现在已经准备好进行流式细胞术了。
6. 运行管（1）以调节绿色荧光（BL1）通道的电压;然后运行管子（2）以调节红色荧光（BL3）的电压。目标是使每个通道的强度分布模式为 ~10^{4-10 5} ，以便利用仪器的全部动态范围。
   注意： 调整电压时请遵循特定流式细胞仪的说明。有些流式细胞仪具有固定电压，省略了此步骤。
7. 运行管 （3） 以检查活细胞群和死细胞群是否分离良好。如果需要，调整 BL1 或 BL3 通道电压。
   注意：Attune NxT 上的 BL200 和 BL1 通道均使用 3 mV 的电压。
8. 在既定的电压设置下运行模拟处理的未染色样品，以确保样品在目标通道中具有最小的自发荧光 （<10²）。

4. 在流式细胞仪上运行样品

1. 应用上面建立的流式细胞仪设置，并首先运行未染色的样品，以确保 BL1 和 BL3 通道中的自发荧光信号均低于 10² 。
2. 向每个染色样品中加入 200 μL 0.85% 盐水缓冲液，并在流式细胞仪上运行。
   注意：如果测定多个样品，请错开染色步骤，使每个样品在流式细胞仪上运行之前染色30分钟。
3. 将流式细胞术输出导出为 .fcs 文件（FCS 3.0 或 3.1 标准）。

5. R 中的数据分析

注意：示例分析脚本作为 补充文件 1 提供。“代表性结果”部分提供了示例门控策略。

1. 安装并加载所需的软件包：（1） flowCore （2） ggplot2 （3） ggcyto。
2. 将 .fcs 文件导入到当前 R 环境中。
3. 调整文件名并指定处理条件。
4. 为 FSC 上的所有事件制作 2D 密度图。H 对 SSC。使用多边形门排除非细胞事件。将此门命名为“cells”。
   注意：在某些流式细胞仪上，建议使用“面积”参数而不是“高度”。检查特定于仪器的建议。
5. 对于“细胞”门控群体，在 FSC 上制作 2D 密度图。H 与 FSC.W. 通常，两个簇在相似的 FSC 范围内是可见的。H 但不同的 FSC.W.具有较低平均 FSC 的聚类。W 级别包含单个单元格（“单线态”）。绘制一个多边形门以选择它们，并将门命名为“单身”。
6. 对于“单线形”门控种群，在 BL1 上制作 2D 密度图。H 与 BL3.H. 根据活细胞和死细胞对照绘制活细胞、受损细胞和死细胞群的多边形门。“代表性结果”部分提供了一个示例。
7. 使用每个总体的百分比确定存活率并导出统计数据。

结果

SYTO 9/PI 染色剂根据其在绿色 （500 nm-560 nm） 和红色 （>600 nm） 通道中的荧光信号来区分活酵母细胞和死细胞。仅积累 SYTO 9 的活细胞在绿色通道中发出强烈荧光，红色信号极少。死细胞同时积累 SYTO 9 和 PI，并且由于 PI 和 FRET 竞争性排除 SYTO 9，预计在红色通道中发出强烈荧光，与活细胞相比，绿色荧光信号较低。

将上述SYTO 9 / PI染色方案应用于氧化应激的光头梭菌细胞。用 0 mM、100 mM 和 1,000 mM H₂O₂ 处理中对数期 C. glabrata 细胞 2 小时，并用 SYTO 9 和 PI 染色。通过激光扫描共聚焦显微镜目视检查染色图案，显示为明场顶部两个荧光通道的叠加（图1A，4...

讨论

该协议描述了使用两种荧光染料 SYTO 9 和 PI 的 LIVE/DEAD 测定，并使用流式细胞术量化酵母中的应激后存活率。虽然这两种染色剂已在文献中用于评估各种酵母物种的存活率，并且可作为商业试剂盒使用，但制造商手册和文献都没有提供有关染色方案或流式细胞^术设置的足够详细信息7。在这里，我们提出了一个标准化方案，该方案由测定的系统表征得出，包括最佳染色缓冲液，染料浓度，染色时间和流式细胞术设置。另一项研究中描述的其他实验将该测定应用于不同的酵母物种和其他类型的胁迫，例如抗真菌处理¹⁶。因此，此处描述的协议在进一步验证后可能更普遍有用。

所提出的协议中有几个关键步骤。这些措施包括在处理小体积时小心移液以确保染料浓度一致，正确设置流式细胞仪以最好地区分信号与背景（阳性对照在 10³ 和 10⁶ 之间，阴性对照在 <10² 之间）两个荧光通道上）。一旦确定了针...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96井深井板	赛莫飞舍尔	278606	NUNC 96
带板读器的Attune NxT流式细胞仪	赛莫飞舍尔 A24858	A24858	自动采样器（A42901）
< em>格拉布拉特念珠菌			CG99，临床分离株（Cormack &Falkow，1999年）
FungaLight酵母活/死套装	赛莫飞舍尔 A24858	L34952	含有SYTO 9（3.34 mM）和碘化丙（20 mM）。这两种组件也可以从不同供应商单独购买。
过氧化氢	西格玛·奥尔德里奇	H1009
徕卡 Confocal SP8 显微镜	徕卡	TCS SP8 X
氯化钠	西格玛·奥尔德里奇	S9888	用于制备灭菌的0.85% NaCl溶液
无氨基酸的酵母氮碱	西格玛·奥尔德里奇	Y0626	用于制作含有2%葡萄糖和氨基酸混合物的合成完全培养基