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方法文章

一种优化的LIVE/DEAD染色联合流式细胞术用于定量酵母细胞应激后的存活率

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DOI：

10.3791/69005

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2025年8月29日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

本文内容

摘要

本文介绍了一种定量检测酵母样品在胁迫后存活率的实验方案。该检测方法采用两种荧光染料SYTO 9和碘化丙啶（PI）来评估细胞质膜的完整性，并结合流式细胞术对氧化应激处理后的样品中活细胞、死细胞及受损细胞的比例进行定量且可重复的分析。

摘要

量化存活率是酵母研究中常见且关键的任务。基于细胞质膜完整性的活/死染色法，结合流式细胞术，可快速、高通量地检测酵母存活情况。然而，染色缓冲液、染料浓度、孵育时间以及流式细胞仪设置的差异均可能影响数据质量和可重复性。本方案提供了一种标准化的活/死染色法，用于通过流式细胞术定量酵母在胁迫后的存活率。在用不同剂量的过氧化氢处理机会性酵母病原体Candida glabrata后，对胁迫后的样品使用由SYTO 9和碘化丙啶（PI）组成的双组分活/死染色剂进行染色。利用流式细胞术区分活细胞、受损细胞和死亡细胞群体，并量化各样品中各群体的百分比。基于活细胞百分比 的存活率估计值与同一样品的菌落形成单位（CFU）结果进行了比较。对于对照组和致死剂量（1 M H2O2）处理的样品，两种方法结果一致。在亚致死剂量（100 mM H2O2）处理下，SYTO 9/PI法测得的存活率高于CFU法，反映了两种方法的关键差异：本方案在胁迫结束后立即评估细胞存活状态，而CFU法则量化的是能够恢复并增殖的细胞所占百分比。因此，本方案在细胞死亡过程的更早阶段测量细胞活力。综上所述，本方案为酵母胁迫后存活率的定量提供了一种快速且可扩展的CFU替代方法。其结果通过在更早阶段评估存活情况并区分死亡细胞与受损细胞，为CFU提供了补充信息。

引言

芽殖酵母亚门包含许多重要的生物学和生物技术模型。在酵母研究中，一个常见且关键的任务是量化遗传或环境扰动的影响，后者包括应激或药物处理。例如，在工业发酵过程中，生产者必须监测酵母培养物的活力，以确保发酵过程的效率和质量1,2。在研究致病性酵母物种时，测量其在应激或抗真菌治疗后的存活情况，对于理解与感染相关性状（如抗真菌耐药性）的遗传和机制基础至关重要。在临床环境中，测量导管和表面的酵母存活情况也是一项重要任务3。这些不同的应用场景均需要能够快速而准确地量化药物和应激处理结果的定量方法。

根据所测量的内容，实现上述目标的现有方法可分为三大类。第一类方法测量克隆形成能力（clonogenicity），即单个酵母细胞在应激后形成单菌落的能力。该类方法的代表性技术是菌落形成单位（Colony Forming Unit, CFU）检测。第二类方法测量细胞活力（vitality），其原理依赖于检测活细胞中的酶活性。例如使用化学探针如FUN-1染料4。第三类方法测量 细胞质膜完整性——质膜完整性的不可逆丧失被认为是细胞死亡的"不可逆临界点"5。此类方法的实例包括碘化丙啶（propidium iodide, PI）等荧光染料。

本研究介绍了一种经过优化的活/死细胞染色法，并结合流式细胞术，以实现对酵母在应激处理后存活率的快速、可扩展的定量分析。该基于细胞膜通透性的检测方法比菌落形成单位（CFU）法更快速，染色仅需15–30分钟，而CFU法需要24–48小时的培养时间以形成可见菌落。此外，使用活/死染料染色的样品不仅可通过显微镜检测，还可直接用于流式细胞术分析，后者可在数秒内检测数万个细胞，并可轻松处理96孔板样品，适用于高通量实验。因此，该方法具有快速、定量和可扩展的优点。在本实验方案中，采用由SYTO 9和PI组成的双组分活/死染色剂，以增强分辨能力。SYTO 9可标记所有细胞（无论死活），而PI仅能进入细胞膜受损的细胞6,7。因此，活细胞仅积累SYTO 9，而死细胞则同时积累SYTO 9和PI。由于PI与核酸的亲和力高于SYTO 9，它可在细胞内竞争性地将SYTO 9置换出来8。此外，这两种染料构成一个 Förster 共振能量转移（FRET）配对系统，其中SYTO 9的发射光被PI吸收并作为其激发光。因此，死细胞表现出较弱的绿色荧光和强烈的红色荧光，而活细胞则呈现明亮的绿色荧光8。这种差异使得即使在同一类细胞群体中存在荧光强度的波动，仍能更有效地分辨活细胞与死细胞。

自2004年首次报道其在酵母中的应用以来，SYTO 9/PI在酵母研究中的使用尚不普遍，且主要局限于通过显微镜进行的定性评估7,9,10,11,12,13,14,15酵母存活率定量检测的一项主要局限在于缺乏与广泛使用的方法（如菌落形成单位法，CFU）进行系统性表征和比较。本方案描述了一种标准化的检测方法，包括染色缓冲液、染料浓度、染色时间以及流式细胞术参数设置，这些条件经优化可最大限度减少实验假象，并在应用于酵母样本时获得可重复的结果 C. glabrata 以及另外两种酵母物种16. 由于SYTO 9/PI染色显示了一种中间状态 "受损" 在染色模式上不同于活细胞和死细胞的细胞群体，可通过揭示胁迫处理对酵母细胞影响的更细微信息来补充菌落形成单位（CFU）检测，从而可能拓展新的应用。

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方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 应用过氧化氢胁迫

  1. 至少在实验前一天，接种 过夜培养的 C. glabrata 从新鲜划线平板上的单个菌落中挑取菌体，接种于3 mL合成完全培养基（SC培养基，含1.7 g/L酵母氮源基础培养基、完全氨基酸混合物、2% w/v葡萄糖和水）中，将玻璃试管置于滚筒培养箱内，30 °C培养。或者，也可将玻璃试管以倾斜角度置于轨道摇床中，于200 rpm振荡培养。
    1. 测量光密度（OD600) 次日清晨取过夜培养物，并用新鲜的 SC 培养基稀释至 OD600 约0.2，总体积为10 mL。培养约4小时，使其经历两次倍增，达到对数生长中期（OD600 ~1）相。
      示例：如果过夜培养物的OD600 = 10时，将200 µL该培养物加入9.8 mL SC培养基中。
  2. 在施加胁迫处理前30分钟内，配制过氧化氢胁迫培养基。将30%的过氧化氢储备液（9.798 M）用完全合成培养基（SC）逐级稀释至所需浓度。设置对照处理组（不添加过氧化氢的SC培养基）和致死剂量组（1 M适用于 C. glabrata).
    示例配制100 mM过氧化氢应激培养基：将9.798 M过氧化氢储备液10.3 µL加入1 mL SC培养基中，轻轻吹打混匀。配制10 mM过氧化氢应激培养基：取500 µL 100 mM过氧化氢应激培养基加入4.5 mL SC培养基中稀释。
  3. 测量 OD600 对对数中期培养物进行处理，并将其标准化至例如 OD600 = 1，通过添加SC培养基。
    ​示例：对数中期培养物的OD值为600 1.2. 每1 mL培养物中加入0.2 mL SC培养基。
  4. 将每种测试条件下600 µL对数中期培养物转移至96深孔板中。在3,000 x g条件下离心沉淀细胞 g 室温孵育5分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
  5. 向每个孔中加入600 µL在步骤1.2中制备的模拟处理或过氧化氢应激培养基，并轻轻吹打以重悬细胞。
  6. 在30 °C、300 rpm振荡条件下孵育平板120分钟。
    注意：孵育时间取决于所研究的生物学问题。

2. SYTO 9/PI 染色的应用

  1. 实验前，准备至少 10 mL 无菌的 0.85% 生理盐水缓冲液。
    注：我们发现与去离子水或培养基相比，0.85% 生理盐水缓冲液产生的染色伪影最少，即在模拟处理样本中未染色且呈现类似死亡状态的细胞最少16。
  2. 使用无菌去离子水配制 0.2 mM 的 PI 工作储备液。
    注：该 PI 工作储备液可在 4 °C 下保存最多 6 个月。
  3. 实验开始前立即使用无菌去离子水配制 33.4 µM 的 SYTO 9 工作储备液。
    注：每次实验均需新鲜配制 SYTO 9 工作储备液，不得储存后重复使用。
  4. 轻轻吹打混匀处理板中各孔的细胞。测定每种处理条件下的 OD600，并计算将细胞重悬至 OD600 为 1 所需的缓冲液体积。
    注：可使用多通道移液器进行高效且均匀的混匀。避免过度混匀样本。
  5. 通过在 3,000 × g 下离心 5 分钟收集经模拟或应激处理后的酵母细胞。小心吸除上清液。将细胞用无菌 0.85% 生理盐水缓冲液重悬至 OD600 = 1（根据步骤 2.4 计算得出）。
    注：使用多通道移液器重悬细胞。所有处理后的培养物均需小心操作，避免过度混匀。
  6. 为每种样本保留 50 µL 作为未染色和单染对照。
    注：野生型 C. glabrata 在 SYTO 9 和 PI 两个通道中均表现出最低的自发荧光。然而，仍应始终检查未染色样本的自发荧光，并进行适当的背景扣除或使用低自发荧光的培养基。
  7. 将重悬于 0.85% 生理盐水缓冲液中的 16 µL 处理后样本分装至 50 µL PCR 管中。向细胞悬液中加入 2 µL 的 0.2 mM PI 工作储备液，然后在同一管中加入 2 µL 的 33.4 µM SYTO 9 工作储备液，最终体积为 20 µL。
    1. PI 和 SYTO 9 的终浓度分别为 20 µM 和 3.34 µM。轻轻吹打混匀，避光孵育 30 分钟（可使用黑色盒子），室温下进行。

3. 流式细胞仪的设置与校准

注意：对于每台新仪器，以及SYTO 9/PI染色的新应用（包括不同物种/菌株、新的应激因素或新的培养方案等）均应进行此步骤。以下设置是在Attune NxT流式细胞仪上开发的。请参考所用仪器的用户手册以获取具体操作说明。

  1. 选择合适的 荧光通道/流式细胞仪滤光片：530 nm ± 30 nm 带通滤光片（BL1）和600 nm 长通滤光片> 600 nm，BL3）用于收集绿色（SYTO 9）和红色（PI 与 SYTO 9）通道的信号。两者均使用 488 nm 蓝色激光激发。
  2. 将流速设置为 200 µL/min，并在收集至少 30,000 个事件后停止。
    注意：每个样本的事件数可根据获得稳定百分比估计值的目标进行调整。事件数（细胞数）过少的样本应予以排除。下一步是在初始设置期间调整FSC和SSC通道的电压。
  3. 将16 µL经模拟处理且未染色的样品稀释至200 µL无菌0.85%生理盐水缓冲液中。在流式细胞术检测前轻轻吹打混匀。运行该样品，并调节FSC和SSC通道的电压，使细胞群位于FSC散点图的中心位置 对比.SSC 密度图
    注意：FSC 和 SSC 分别使用 345 mV 和 399 mV 的电压。接下来的步骤是在初始设置期间调整收集通道（BL1 和 BL3）的电压。
  4. 将24 µL的模拟处理样品与24 µL的1000 mM过氧化氢处理或热灭活样品混合。
  5. 将混合的活细胞和死细胞样品均分为三份，每份16 µL，分装至三个离心管中。分别对三管样品进行染色：（1）加入2 µL SYTO 9和2 µL水，避光孵育30分钟；（2）加入2 µL PI和2 µL水，避光孵育30分钟；（3）加入2 µL SYTO 9和2 µL PI，避光孵育30分钟。染色步骤参照前一节所述方案进行。
    1. 孵育后，向每根试管中加入 200 µL 无菌 0.85% 生理盐水缓冲液。样品现可进行流式细胞术分析。
  6. 运行样本管（1）以调节绿色荧光（BL1）通道的电压；然后运行样本管（2）以调节红色荧光（BL3）通道的电压。目标是使每个通道的荧光强度分布模式的峰值位于约10处4-105 以充分利用仪器的全动态范围。
    注意：调整电压时，请遵循您所使用的特定流式细胞仪的说明书。某些流式细胞仪具有固定电压，此步骤可省略。
  7. 运行样本（3）以检查活细胞与死细胞群体是否能够良好分离。如有需要，调整BL1或BL3通道电压。
    注意：Attune NxT 的 BL1 和 BL3 通道均使用 200 mV 的电压。
  8. 在已设定的电压条件下运行经模拟处理且未染色的样本，以确保该样本在目标通道中的自发荧光背景极低（<102).

4. 在流式细胞仪上运行样本

  1. 应用上述已设定的流式细胞仪参数，首先检测未染色样本，确保在BL1和BL3两个通道中自发荧光信号均低于102。
  2. 向每份染色样本中加入200 µL 0.85%生理盐水缓冲液，并上机进行流式细胞仪检测。
    注意：若需检测多个样本，应错开染色步骤，使每份样本染色30分钟后立即上机检测。
  3. 将流式细胞术数据导出为.fcs文件格式（符合FCS 3.0或3.1标准）。

5. 在 R 中进行数据分析

注意：分析脚本示例作为补充文件1提供。示例设门策略见代表性结果部分。

  1. 安装并加载所需的软件包：（1）flowCore （2）ggplot2 （3）ggcyto。
  2. 将 .fcs 文件导入当前的 R 环境中。
  3. 调整文件名并指定处理条件。
  4. 对所有事件在 FSC.H 与 SSC.H 之间绘制二维密度图。使用多边形门控排除非细胞事件，并将此门命名为 "cells"。
    注意：在某些流式细胞仪上，建议使用面积参数而非高度参数。请查阅仪器特定的推荐设置。
  5. 对已门控的 "cells" 群体，在 FSC.H 与 FSC.W 之间绘制二维密度图。通常可见两个聚类，其 FSC.H 范围相似但 FSC.W 不同。FSC.W 平均水平较低的聚类包含单细胞（"singlets"）。绘制多边形门以选择该群体，并将此门命名为 "singlets"。
  6. 对已门控的 "singlets" 群体，在 BL1.H 与 BL3.H 之间绘制二维密度图。根据活细胞与死细胞对照样本，绘制多边形门以区分活细胞、受损细胞和死亡细胞群体。代表性结果部分提供了示例。
  7. 根据各群体的百分比计算存活率，并导出统计数据。

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结果

SYTO 9/PI 染色法根据绿色（500 nm-560 nm）和红色（>600 nm）荧光通道中的荧光信号，区分活酵母细胞与死细胞。活细胞仅摄取 SYTO 9，在绿色通道中产生强烈荧光，红色信号极弱。死细胞则同时摄取 SYTO 9 和 PI，由于 PI 对 SYTO 9 的竞争性排斥以及荧光共振能量转移（FRET）效应，其绿色荧光信号较活细胞弱，而在红色通道中表现出强烈荧光。

上述SYTO 9/PI染色方案应用于氧化应激的C. glabrata细胞。对数中期的C. glabrata细胞分别用0 mM、100 mM和1,000 mM H2O2处理2小时，并用SYTO 9和PI染色。通过激光扫描共聚焦显微镜观察染色模式，图中显示了两个荧光通道信号叠加在明场图像上的结果（图1A，SYTO 9激发波长488 nm，...

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讨论

本方案描述了一种使用两种荧光染料SYTO 9和PI的活/死细胞检测方法，并通过流式细胞术定量酵母在应激后的存活率。尽管这两种染料已在文献中用于评估多种酵母物种的存活情况，并且已有商用试剂盒提供，但制造商说明书和现有文献均未充分提供染色方案或流式细胞术设置的详细信息7。本文介绍了一种经过系统优化的标准化方案，包括最佳染色缓冲液、染料浓度、染色时间以及流式细胞术参数设置。另一项独立研究中所述的附加实验已将该检测方法应用于多种酵母物种及其他类型的应激条件（如抗真菌处理）16。因此，本方案在进一步验证后可能具有更广泛的适用性。

本方案中包含若干关键步骤。其中包括在处理小体积液体时需小心移液，以确保染料浓度的一致性；正确设置流式细胞仪，以便最佳区分信号与背景（两个荧光通道的阳性对照信号应介于103至106之间，阴性对照信号应低于<102）。一旦针对特定菌株和处理条件确定了各通道的电压值，应保持这些参数恒定，以便在不同样本间使...

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致谢

我们感谢 Michael Dailey 博士和卡弗影像中心在显微镜技术方面的培训与支持。我们感谢基因调控实验室的历任及现任成员对本实验方案提供的宝贵反馈意见。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）R35GM137831 项目资助，项目负责人为 BZH。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔深孔板Thermo Fisher278606NUNC 96
配备板式进样器的Attune NxT流式细胞仪Thermo Fisher A24858A24858自动进样器（A42901）
Candida glabrataCG99，源自临床分离株的实验室菌株（Cormack & Falkow, 1999）
FungaLight酵母活/死检测试剂盒Thermo Fisher A24858L34952包含SYTO 9（3.34 mM）和碘化丙啶（20 mM）。这两种组分也可从不同供应商单独购买。
过氧化氢Sigma AldrichH1009
Leica SP8共聚焦显微镜LeicaTCS SP8 X
氯化钠Sigma AldrichS9888用于配制灭菌的0.85% NaCl溶液
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基Sigma AldrichY0626用于配制含2%葡萄糖和氨基酸混合物的完全合成培养基

参考文献

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