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优化的热酚法提取分枝杆菌RNA：一种用于可靠基因表达分析的稳健方法

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2026年9月11日

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1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

本文内容

摘要

本研究优化了一种基于热酚法的RNA提取方法 分枝杆菌属，获得的高质量RNA适用于转录组学分析。在相同条件下与TRIzol和RNeasy进行比较时，该方法具有更高的得率、相当的完整性以及更优的成本效益，为大规模基因表达研究提供了实用的替代方案。

摘要

Mycobacterium tuberculosis（Mtb）仍然是全球主要的健康威胁，凸显了开展可靠的转录组学研究以深入了解其生物学特性及耐药机制的必要性。此类分析依赖于获取高质量、高得率的RNA。尽管已有多种RNA提取方法，但许多方法需要昂贵的试剂、大量培养物或专用设备，限制了其在大规模研究中的适用性，尤其是在资源有限的环境中。本文介绍了一种针对分枝杆菌优化的基于热酚法的RNA提取方法。该方法仅需少量培养物，并使用常规试剂，即可稳定获得适用于高通量转录组学应用的高质量RNA。通过凝胶电泳和RNA完整性分析（RIN）评估RNA的数量和完整性，并通过qPCR和Qubit 4验证其在下游应用中的适用性。为评估优化后方法的性能，我们在相同实验条件下平行开展了TRIzol与RNeasy试剂盒的RNA提取，包括使用相同的Mycobacterium物种、培养物体积、生长阶段（对数期和稳定期）以及裂解条件。这使得在得率、质量、可行性及成本方面实现了直接比较。优化后的热酚法在RNA得率和质量上表现出与对照方法相当甚至更优的结果，同时显著降低了试剂成本和对专用设备的依赖。由于其高效性、可重复性和经济性，本方案为Mtb及其他分枝杆菌物种的大规模基因表达和转录组学研究提供了一种切实可行的替代方法。

引言

M. tuberculosis（Mtb）是结核病（TB）的致病菌，至今仍是单一传染性病原体导致死亡的首要原因，其致死人数超过艾滋病/艾滋病病毒（HIV/AIDS）。2024年，全球结核病导致约130万人死亡1。此外，耐多药（MDR）和广泛耐药（XDR）菌株的流行率不断上升，进一步加重了这一疾病负担。因此，迫切需要深入了解结核病发病机制的分子基础，并发现新的治疗靶点2。

结核分枝杆菌（Mtb）的转录谱分析已成为阐明宿主-病原体相互作用3、环境应激适应4以及药物耐药机制5中相关功能元件的重要工具。实时PCR、微阵列和RNA测序（RNA-seq）等先进方法显著提升了分析分枝杆菌转录组的能力6。然而，这些方法的成功高度依赖于高质量RNA的获取，而后者又取决于提取过程中高效的细胞裂解。Mtb复杂的由分枝菌酸–阿拉伯半乳聚糖–肽聚糖构成的细胞壁使得RNA提取尤为困难7。现有的裂解技术，包括酶解8、超声处理9和珠磨法10，通常需要昂贵的设备和大量培养物，限制了其在许多生物安全三级（BSL-3）实验室中的实用性。此外，Mtb生长缓慢，需要较长的培养时间才能获得足够的生物量11。

为了克服这些局限性，开发了一种基于热酚法的优化RNA提取方法，该方法快速且经济。仅使用3 mL对数中期培养物，即可获得45–60 µg高质量RNA，适用于后续转录组学分析。细胞裂解采用紧凑型手持式组织研磨器和 readily available 试剂完成，无需昂贵仪器。尽管热酚法此前已有报道11,12，但优化后的热酚法在便捷性、成本效益和RNA得率方面均有提升。该方法以M. smegmatis mc2155（Msmeg）进行优化，并成功在中国台湾H37Rv菌株中得到验证。

方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 培养 分枝杆菌属

  1. 将分枝杆菌（Msmeg 或 Mtb）的甘油菌种 1 mL 接种于 10 mL 添加了 0.2% 甘油、0.05% 吐温 80 和 10% ADC 的 Middlebrook 7H9 培养基中，在 37 °C、150 rpm 振荡培养，直至 OD 值达到 1–1.5。
  2. 取 1% 的初级培养物接种至 10 mL 7H9 培养基中，继续培养至对数中期，使 OD600nm = 0.6–0.7。
  3. 将菌液分装为每份 3 mL，于室温（23–25 °C）下以 2000 × g 离心 5 分钟。
  4. 将菌体沉淀储存于 -80 °C，待进行 RNA 提取。
    注意：对于结核分枝杆菌（Mtb）培养物，须遵循相应的 BSL3 操作规范，并在 95 °C 加热灭活沉淀 20–25 分钟。
    说明：图 1 展示了采用热酚法提取 RNA 时所遵循的基本步骤流程图。

热酚法RNA提取示意图；流程显示离心、相分离、RNA完整性分析。
图1： 热酚法及分析流程的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. RNA 提取

  1. 热酚法（HP法）
    1. 添加 200 µL 加入 TES 缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；5 mM EDTA，pH 8.0；0.1 M NaCl；% SDS；1% β-巯基乙醇）至细胞沉淀中，通过涡旋振荡重悬沉淀。
    2. 加入约 0.1 g 的 0.1 mm 玻璃珠至样品中。使用手持式组织研磨器在冰上研磨 10–15 秒，直至沉淀完全解冻。重复此步骤 2 个循环，每次重复后均在液氮中快速冷冻。
    3. 或 使用高速台式珠磨破碎仪，在室温下以速度5（5.0 m/s）处理1分钟。重复该步骤共3个循环，每次循环后将样品置于冰上孵育，以防止过热。
      注意：使用手持式组织研磨器或珠击破碎仪对结核分枝杆菌细胞进行裂解，重复6–8个循环（每个循环1分钟），每完成一个循环后将样品置于冰上间歇冷却。RNA提取所需的所有缓冲液和试剂均应使用经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理的水配制。
    4. 添加一个额外的 200 µL TES缓冲液（预热至 65 °C) 加入各样品中，补足体积至 400 µL向每个样品中加入 200 µL 酸性苯酚（用100 mM柠檬酸缓冲液平衡，pH 4.5） 200 µL 氯仿（在加入样品前，将酸性酚与氯仿等比例混合）。
    5. 将样品在指定条件下孵育 65 °C 在900 rpm振荡条件下于加热模块上孵育30分钟，随后以12000 x g 室温下孵育15分钟。离心后应确保充分的相分离（可见清晰的上层水相含有RNA，明显的中间相含有DNA，以及下层有机相含有蛋白质和脂质）。
    6. 移除上层水相，转移至新的1.5 mL微量离心管中。再次加入等体积酸性酚:氯仿。在12,000 x g 室温下孵育15分钟。确保充分的相分离。
    7. 移除上层水相至新的1.5 mL微量离心管中，然后加入 30 µL 3 M 醋酸钠缓冲液，pH 5.3，以及 240 µL 冰冷异丙醇。在 −80 °C 30分钟至1小时。
      注意：微量离心管可在 -80 °C 此步骤中，用多层封口膜密封微量离心管，以防止其开启 65 °C 孵育期间
      注意： 苯和氯仿为危险化学品，因此应遵循适当的个人防护装备（PPE）使用规范、工程控制措施（如通风橱）以及特定的废弃物处理程序。
    8. 在 12,000 × g 条件下离心 g 室温孵育1 h。确保形成沉淀，小心移除上清液，避免扰动沉淀。
    9. 将沉淀重悬于1 mL 75%乙醇中，于12,000 x g 室温下孵育1 min。重复此步骤两次，然后将沉淀物风干。
    10. 将沉淀重悬于 50 µL 无核酸酶水。
      注意：溶解RNA时，将其在室温下于无RNase的水中孵育10–30分钟。
  2. TRIzol 法
    1. 添加 200 µL 加入TRIzol试剂至细胞沉淀中。
      警告： TRIzol 是一种危险化学品；因此，应遵循适当的个人防护装备（PPE）使用规范、工程控制措施（如通风橱）以及特定的废弃物处理程序。
    2. 按照步骤 2.1.2 - 2.1.3 中的细胞裂解方法进行操作。
    3. 添加一个额外的 200 µL TRIzol试剂，随后 200 µL 加入氯仿，涡旋1分钟。在13,400 x g 15 分钟 4 °C确保离心后正确分相。
    4. 小心地将水相转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    5. 通过加入沉淀RNA 500 µL 加入异丙醇至水相，并在−80 °C下孵育80 °C 30分钟至1小时。
    6. 通过离心沉淀RNA，离心条件为15,000 x g g 20 分钟 4 °C小心观察沉淀，移除上清液时避免扰动沉淀。
    7. 用1 mL 75%乙醇重悬沉淀，于13,400 x g 1 分钟 4 °C重复此步骤两次，室温下将沉淀晾干30分钟，然后重悬于 50 µL 无核酸酶水。
  3. 市售RNA提取试剂盒方法
    1. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 重悬缓冲液（试剂盒中提供）。
    2. 按照步骤 2.1.2 - 2.1.3 中的细胞裂解方法进行操作。
    3. 按照制造商的说明进行后续实验。

3. DNase 处理、定量与可视化

  1. 为去除基因组DNA污染，向每个RNA样本中加入1 µL DNase I（10 units）和5 µL RDD缓冲液（1x），室温孵育30分钟。
  2. 使用Nanodrop分光光度法测定RNA样本浓度，并使用Qubit4检测RNA完整性。RIN值在7.5–10之间为可接受范围。A260/A280和A260/A230的可接受值范围分别为1.8–2.0和2.0–2.2。
  3. 使用1X RNA上样染料在1%琼脂糖凝胶上进行RNA电泳可视化。

4. cDNA 合成与定量实时 PCR

  1. 按照制造商说明，在热循环仪中使用cDNA反转录试剂盒和1 µg RNA配制20 µL的cDNA合成反应体系。
  2. 根据制造商说明，使用50 ng cDNA、每种引物0.4 µM以及SYBR配制10 µL的实时PCR反应体系，并在实时荧光定量PCR仪上运行样品。
    注意：qPCR分析使用以下引物：
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3'，Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3'，Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3'，Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3'，Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3'，Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3'，Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. 统计学分析

  1. 进行学生t检验 t检验 使用 Graph Pad Prism 对所有生物学重复进行分析， P ≤ 0.05 被认为具有统计学显著性。误差线表示至少三次生物学重复的标准误差。

结果

RNA 质量与得率

RNA 的质量和数量通过琼脂糖凝胶电泳进行评估（图2). 所有提取方法均观察到对应于23S和16S rRNA的清晰锐利条带，证实总RNA成功分离。热酚法和TRIzol法显示出三条清晰条带，分别代表23S（~2900 bp）、16S（~1500 bp）和5S rRNA（~120 bp），表明RNA完整且质量较高。相比之下，基于柱纯化的试剂盒方法仅显示23S和16S条带，5S rRNA条带缺失或低于检测限，可能由于柱纯化过程中小分子RNA优先丢失所致。在产量方面，热酚法获得的RNA量分别为TRIzol和RNeasy的1.5–2倍。图2A, C）。平均产量约为 ~60 µg 热酚法，约45 µg TRIzol用，以及~30 µg 对于RNeasy，后者的产量比热酚法低约50%。尽管产量存在差异，但各方法获得的RNA完整性和纯度相当（图 2D，E).

为了评估裂解方法的效率，还使用珠磨破碎仪提取了RNA。所获得的产量、质量和完整性相当，表明使用简单的手持式组织研磨器即可实现有效的裂解，而无需依赖珠磨破碎仪等专用设备（图2B，F–H）。

由于结核分枝杆菌（Mtb）比耻垢分枝杆菌（Msmeg）更难裂解，我们进一步使用结核分枝杆菌H37Rv菌株验证了优化后的热酚法。使用组织研磨器和珠击破碎仪进行细胞裂解均获得了产量高、质量好且完整性佳的RNA（图3A–D），证实了该方法的可靠性。尽管使用手持式组织研磨器提取RNA的产量（约35–45 µg/3 mL培养物）低于珠击破碎仪（50–60 µg/3 mL），但差异无统计学意义，且产量仍在大规模基因表达研究可接受的范围内。所有RNA提取实验均重复多次，并展示了所有独立的生物学重复结果。对凝胶图像进行了密度测定分析，进一步验证了不同方法间RNA产量的统计学差异，其中热酚法的RNA产量最高（补充 图1A–D）。

RNA 纯度与完整性

所有方法获得的RNA其A260/A280比值均在2.0左右，表明蛋白质污染极少（图2D）。RNA完整性（RIN）在所有方法间具有可比性，其值范围为7.5至10（图2D–H，补充部分 图2, 下图显示样品质量良好、完整性高且降解极少。

用于检测RNA质量的定量PCR分析

为评估各方法提取的RNA在下游基因表达研究中的适用性，进行了qRT-PCR检测。我们检测了Msmeg持家基因的基因表达水平。 mysA （MSMEG 2758）以及两个转录调控因子， sigE （MSMEG 5072）和 sigH （MSMEG 1914），使用等量的输入RNA。所获得的Ct（循环阈值）值反映了各样本中完整且可扩增RNA的相对丰度。如图所示（图 2I），使用热酚法和TRIzol提取的RNA在Ct值上表现出可比性，范围约为22–25，反映出较高的RNA完整性以及对逆转录和扩增的良好兼容性。而试剂盒方法的Ct值略高（约27–30），表明可检测到的转录本水平较低。熔解曲线分析显示特异性扩增 mysA, sigE, 和 sigH 基因，显示qPCR的特异性和效率（补充图2，上图）。使用结核分枝杆菌（Mtb）基因进行的qPCR分析也显示出可接受的Ct值（约20–25），证实其适用于后续基因表达研究（图3E).

RNA提取方法比较；凝胶电泳（28S、18S、5S）及产量、Ct值、纯度的柱状图。
图2：RNA提取方法的比较 分枝杆菌. (A琼脂糖凝胶电泳显示采用热酚法、TRIzol法和RNeasy法提取的总RNA。所有样品中均可见清晰的23S和16S rRNA条带，表明RNA完整。B热酚法提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果 通过 不同的裂解方法，即珠磨破碎仪和手持式组织研磨器。C总RNA得率，以热酚法得率最高，其次为TRIzol法和试剂盒法。DRNA 纯度通过 A260/A280 比值进行评估，所有方法获得的比值均约为 2.0，表明蛋白质污染极少。ERNA完整性指数（RIN）显示完整性相当。F–H) 使用手持式组织研磨器和Bead Ruptor裂解样本并采用热酚法提取RNA后，比较RNA得率、260/280比值及RNA完整性。I) 针对看家基因（例如， mysA）和转录因子（sigE 和 sigH误差线表示三次生物学重复实验的标准误（n = 3）。 P使用学生氏 t 检验计算得出的 p 值 t检验. 请点击此处以查看此图的放大版本。

结核分枝杆菌RNA提取比较、凝胶电泳以及产量和纯度分析的柱状图。
图3：采用热酚法从结核分枝杆菌（Mtb）中分离RNA。（A）琼脂糖凝胶电泳显示使用珠磨破碎仪和手持式组织研磨器，结合优化的热酚法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中提取的总RNA。（B–D）在RNA产量、260/280比值及RNA完整性（RIN）评估方面对所提取RNA的比较结果。（E）针对sigA、16S rRNA和hsp70基因的qRT-PCR的Ct值。误差线表示三次生物学重复（n = 3）的标准误差。P值采用Student's t检验计算。请点击此处查看该图的放大版本。

热酚法Trizol法RNeasy试剂盒
得率60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
耗时2.5-3 小时2-2.5 小时30-45分钟
单次反应成本$0.10 – $0.20$1.500 – $2.00$7.00 – $10.00
局限性耗时较长，使用强变性剂（苯酚/SDS）耗时较长，使用Trizol等高毒性试剂，需要低温离心机，成本为热酚法的15倍成本高（为热酚法的72倍），得率较低，易发生柱子堵塞
优势少量样品即可获得较高得率，成本低，无需珠磨法进行细胞裂解，无需低温离心得率和成本适中，需低温离心得率中等，成本非常高
主要成本驱动因素常规实验室试剂（TES缓冲液组分、酸性苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇）商业化的TRI Reagent®、氯仿或氯仿:异戊醇、异丙醇、乙醇Qiagen专有的离心柱和缓冲液
RIN值8-10 RIN7.5-10 RIN9-10 RIN

表1： 三种不同RNA提取方法（热酚法、TRIzol法和RNeasy法）在成本、时间和局限性方面的比较。

补充图1：RNA提取的优化。（A）使用热酚法提取RNA，并用手持式组织研磨器进行裂解。（B）使用TRIzol法提取RNA。（C）使用RNeasy方法提取RNA。（D）采用不同方法从耻垢分枝杆菌（Msmeg）提取RNA的凝胶图像的密度分析。误差线表示使用GraphPad Prism计算的标准误（n = 8）。（E）使用热酚法从结核分枝杆菌（Mtb）菌株中提取RNA。所有凝胶图像均为独立的生物学重复实验。请点击此处下载该文件。

补充图2：（上图）熔解曲线分析 mysA sigE, 和 sigH 来自 M. smeg，n = 3；（下图）RNA 完整性分析. 请点击此处下载该文件。

讨论

为了建立一种简单且可靠的Mycobacterium RNA提取方法，本研究对热酚法进行了优化。随后，将提取的RNA与两种广泛应用的方法——TRIzol法和基于离心柱的试剂盒法——进行了比较12,13。这些技术根据RNA得率、纯度、完整性、成本和处理时间进行评估，以判断其在下游分子应用中的实用性。尽管热酚法和TRIzol法相较于试剂盒法相对耗时，但两者均能获得完整且高质量的RNA。三种方法所得RNA在纯度和完整性方面相当；然而，热酚法始终提供更高的RNA得率。此外，使用热酚法和TRIzol法提取的RNA获得的Ct值相似。然而，热酚法与RNeasy法之间的Ct值存在统计学显著差异。由于实验中使用的RNA量相等，预期所有方法的Ct值应相近。RNeasy法中观察到的差异可能归因于RNA提取化学原理的不同。热酚法和TRIzol法属于有机溶剂法，通常对难溶转录本（如编码内在膜蛋白的转录本或高GC含量的转录本）具有更强的溶解能力。相比之下，RNeasy法基于二氧化硅离心柱，某些转录本可能因与膜结合效率低或在洗涤步骤中丢失而导致回收率较低，不如基于酚的方法有效（图2）。重要的是，使用手持式组织研磨器或珠击破碎仪进行细胞裂解均可获得相当的RNA得率，从而在细胞裂解操作上提供了灵活性。此外，该提取方法已优化为适用于低体积培养物，且无需冷离心步骤。这一简化显著提高了样品处理的整体便捷性和效率。

选择RNA提取方法时，一个重要因素是平衡成本、时间与产出质量（表1）。尽管热酚法略耗时，但由于使用常见的实验室试剂，且仅需3 mL的低培养体积即可获得高产量的RNA（每3 mL对数中期培养体积可得Msmeg RNA 60–70 µg，Mtb RNA 35–45 µg），无需依赖高端珠磨破碎设备（此前大多数已发表方法均需此类设备），因此具有很高的成本效益。这使其在资源有限的实验室环境中尤为有利。此前发表的基于热酚法的RNA提取方法在多个关键方面存在差异。例如，Mangan等使用热酚法从M. bovis中提取RNA，报道每109个细胞可获得约20 µg RNA，但关键参数如培养体积和提取温度并未明确说明。此外，该方法在机械裂解细胞前需使用Divolab-1进行去污剂洗涤，而该试剂不易获得，随后还需使用氯仿与异戊醇进行提取11。在另一种热酚法中，从Mtb细胞中提取RNA，总RNA产量约为39 µg，与本文所述优化方法相当，但该方法需要相对较高的培养体积（25 mL），增加了处理时间，并需使用更大容量的离心机。此外，该方法使用氯仿–异戊醇混合液进行提取，且未报告提取温度12,14。TRIzol也广泛用于以中等成本获得良好的RNA产量和质量15，但其产量相对较低。RNeasy试剂盒在操作便捷性和速度方面表现优异，适用于对时间敏感的实验流程或经验较少的操作者，但其成本显著高于其他两种方法，且RNA产量明显偏低。综上所述，本文所述方法在分枝杆菌细胞裂解及后续RNA提取过程中提供了操作灵活性，使用户可根据自身需求（如成本与产量优先，或处理时间优先）选择最合适的方法，同时在三种方法中均能保持相当的RNA质量和完整性。

披露

作者之间不存在利益冲突。所有作者均已批准投稿。

致谢

谨此感谢印度生物技术部（DBT）、印度医学研究理事会（ICMR）以及科学与工程研究委员会（SERB）提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 mm 二氧化硅珠MP BiomedicalsMP116911050
2-丙醇Sigma278475
Bead Ruptor 4 revvity
氯仿Sigma288306
低温离心机ThermoScientific42541217
DNase I qiagen79254
EDTAsigmaE02SS
HClSRL62889
加热块MIULABMU-E02-1049
High-Capacity cDNA Reverse Transcription 试剂盒 Thermo Fischer Scientific4368814
电动组织研磨器 G10CoronG22616008
NaClsigmaS5886
Nanophotometer N50 IMPLEMT51601
用 0.1 M 柠檬酸缓冲液（pH 4.5）平衡的苯酚SigmaP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
Qubit 4 荧光仪 Invitrogen2.32262E+12
实时荧光定量 PCR 仪Analytik Jena AG844-00503-2
RNA easy 试剂盒Qiagen74104
SDSSigmaS9888
乙酸钠SigmaS2889
PCR 仪 Biorad621BR29739
TRI ReagentSigmaT9424
Tris 碱HimediaMB029
β-巯基乙醇Sigma516732

参考文献

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