本方案介绍了一种评估天然化合物在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导活性氧（ROS）介导的细胞凋亡的方法。
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研究文章
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本方案介绍了一种评估天然化合物在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导活性氧（ROS）介导的细胞凋亡的方法。
本研究探讨了Pileostegia tomentella的抗癌潜力，尤其关注其通过活性氧（ROS）介导的途径在H1299非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导经典凋亡的能力。采用生物活性导向分离方法，鉴定出两种具有活性的化合物——伞形花内酯（umbelliferone, UMB）和表Vogeloside（epi-Vogeloside），它们是该植物主要的细胞毒活性成分。这两种化合物均显著抑制细胞活力，并有效诱导H1299细胞发生凋亡性死亡。机制研究表明，UMB和表Vogeloside处理可显著提高细胞内ROS水平，提示氧化应激在其中起关键介导作用。Western blot分析显示，caspase-3剪切水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，表明线粒体介导的内源性凋亡通路被激活。此外，转录组学分析显示基因表达发生广泛改变，进一步支持细胞稳态受到破坏。这些结果表明，Pileostegia tomentella及其活性成分在肺癌治疗中具有潜在的应用前景。
癌症是一项严峻的全球公共卫生挑战，其特征是每年有大量死亡病例。非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因，约占肺癌病例的85%1。致癌过程本质上是分子与细胞活动之间复杂的相互作用，其中活性氧（ROS）稳态的紊乱起着关键影响。ROS包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢等不稳定的氧化剂，是正常细胞代谢的副产物，在信号传导、增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要功能2。ROS浓度失衡可引发氧化应激，可能激活程序性细胞死亡通路，特别是自噬和凋亡，从而抑制癌细胞的增殖与存活3。因此，ROS在肿瘤学中具有双重作用，既可促进也可抑制肿瘤进展。在过去十年中，NSCLC的治疗策略取得了显著进展，其中开发旨在利用ROS这种双重特性的新型抗癌药物已成为一个尤为活跃的研究领域4。
许多化学合成的抗癌药物，如阿霉素（多柔比星）、顺铂和环磷酰胺，已知可通过促进活性氧（ROS）的产生来诱导癌细胞凋亡5。尽管靶向治疗和免疫治疗抗体已取得进展，基于铂类的化疗仍是非小细胞肺癌（NSCLC）患者治疗的基石。然而，化疗所引发的耐药性及不良副作用，促使人们亟需开发新型抗非小细胞肺癌药物。因此，探索天然来源中的抗癌化合物日益被认为具有重要意义和潜力。近期研究表明，某些植物提取物及其活性成分表现出强大的抗癌特性，其特点为毒性低、特异性高，并能作用于多个信号通路6。值得注意的是，其中一些天然化合物可调节活性氧水平及其信号传导7，从而诱导癌细胞发生自噬或凋亡，发挥治疗作用8,9。
Pileostegia tomentella Hand. Zucc 是毛茛科铁线莲属的一种多年生草本植物，主要分布于日本、朝鲜和中国等地区。该植物的根、茎、叶、花等不同部位均具有药用价值，具有清热、解毒、消肿、止痛以及抗菌、抗炎等功效。近年来的研究揭示了霍氏爬山虎提取物或其活性成分具有抗癌活性，对胶质瘤、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌等多种癌症均表现出抑瘤作用10。然而，Pileostegia tomentella 的具体抗癌机制，尤其是其通过调控活性氧（ROS）诱导癌细胞自噬或凋亡的潜在作用，目前仍缺乏深入研究。
尽管天然化合物在癌症治疗中的研究日益受到关注，但Pileostegia tomentella中关键成分在肺癌中促凋亡的作用机制仍尚未被探索。本研究首次鉴定出伞形花内酯和表-黄瑞香素为在非小细胞肺癌中具有选择性的依赖活性氧的凋亡诱导剂，并对其作用机制进行了深入解析。
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本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。
1. 化学成分 Pileostegia tomentella 和非小细胞肺癌靶点预测
采用高效液相色谱结合线性离子阱-轨道阱质谱法（HPLC-LTQ/MS）对Pileostegia tomentella的化学成分进行分析。提取物溶解于适当的溶剂中，过滤后进样。色谱分离采用反相色谱柱，并根据化合物类别设计梯度洗脱程序。质谱数据在正离子电喷雾电离模式下采集，质量扫描范围为100–1500 m/z。已鉴定化合物的分子结构使用通用化学绘图软件绘制，并以SDF格式保存。这些结构文件提交至在线靶点预测工具，用于识别潜在的生物靶点，选取前20个预测靶点进行进一步验证。非小细胞肺癌（NSCLC）相关靶点从公开可访问的基因数据库中获取。两组数据集的交集靶点被确定为Pileostegia tomentella的潜在治疗靶点。
2. 成分-靶点网络构建
预测靶点的蛋白质-蛋白质相互作用数据来自一个开放获取的蛋白质相互作用数据库。将相互作用数据导入通用网络可视化软件，以构建化合物-靶点相互作用网络。利用内置分析工具分析网络拓扑特性，包括度中心性、介数和接近度，以识别关键调控节点。
3. KEGG通路富集分析
使用 KEGG 通路分析对预测的靶蛋白进行功能富集分析 通过 公开可用的富集分析工具和统计软件。校正后 p 值小于 0.05 的通路被视为具有显著性。将显著性通路与化合物-靶点数据整合，构建 "化合物-靶点-通路" 使用通用网络可视化软件构建相互作用网络。网络拓扑学分析揭示了关键的生物学调控枢纽，阐明了其多组分、多靶点的作用机制 Pileostegia tomentella.
4. 提取毛萼楼梯草（Pileostegia tomentella）成分
Corydalis spinosa 的干燥藤茎被研磨成细粉。将粉末材料用70%乙醇在室温下超声处理一定时间进行提取。粗提物经滤过并在减压条件下浓缩。采用极性递增的溶剂进行液-液萃取分离，包括石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。在初步实验中显示最高生物活性的乙酸乙酯部分被收集、浓缩、冷冻干燥，并于-20 °C保存，以备后续使用。
5. 细胞系及处理条件
人肺癌细胞系 H1299 在含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养，培养条件为 37 °C、含 5% CO2 的湿润 atmosphere。细胞以适当密度接种，过夜贴壁后进行处理。细胞暴露于两种测试化合物 UMB 和 epi-Vogeloside 的不同浓度（500 µg/mL、750 µg/mL 和 1,000 µg/mL）下，具体浓度见表 1。在标准培养条件下孵育 24 小时后，收集细胞进行后续分析，以评估这些化合物的生物学效应。
6. 细胞活力的 MTT 检测
采用比色法MTT实验评估化合物的细胞毒性。将H1299细胞以特定密度接种于96孔板中，在标准培养条件下贴壁过夜。随后，在标准培养条件下用待测化合物处理细胞72小时。处理结束后，向每孔加入MTT溶液，孵育使活细胞将MTT还原为不溶性的紫色甲臜结晶。孵育完成后，移除培养基，并用二甲基亚砜（DMSO）溶解甲臜结晶。使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。吸光度值反映细胞活力，从而对化合物的细胞毒性进行定量评估。
7. 细胞膜完整性的评估 通过 LDH 释放
通过检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放量来评估细胞膜完整性，以此作为细胞毒性的指标。H1299细胞用待测化合物处理24小时、48小时或72小时。在每个时间点收集培养上清液，并根据试剂盒制造商的说明书进行LDH活性检测。由于LDH仅从细胞膜受损的细胞中释放，因此所测得的吸光度值反映了化合物随时间诱导细胞膜损伤的程度。
8. 凋亡的流式细胞术分析
采用Annexin V和7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色法，通过流式细胞术检测细胞凋亡的诱导情况。经测试化合物处理后，收集H1299细胞，离心，用冷的磷酸盐缓冲液洗涤，并重悬于结合缓冲液中。随后根据染色方案，将细胞与偶联荧光染料的Annexin V以及7-AAD共同孵育。样品立即进行流式细胞术分析。该方法可区分活细胞（未染色）、早期凋亡细胞（Annexin V阳性、7-AAD阴性）以及晚期凋亡或坏死细胞（两种染料均阳性）。
9. 细胞内活性氧定量
使用基于荧光的检测方法测定细胞内活性氧（ROS）水平。将H1299细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于12孔板中，培养至汇合度约80%。随后用指定化合物处理细胞72小时。处理结束后，将细胞与1 µM的ROS敏感性荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）在37 °C避光孵育30分钟。孵育完成后收集细胞，使用荧光酶标仪在发射波长525 nm处测定荧光强度。荧光强度反映细胞内ROS水平。
10. 实时定量 PCR（RT-qPCR）
将H1299细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，培养至汇合度约80%。随后用指定化合物处理细胞72小时。采用常用的酚-氯仿法提取总RNA。根据制造商说明书，使用逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）。使用实时荧光定量PCR系统，采用特异性引物（见表2）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。采用比较Ct法计算相对基因表达水平，以内参基因作为内部对照。
11. 蛋白质表达的免疫印迹
对培养并处理的 H1299 细胞进行 Western blot 分析。使用适当的裂解缓冲液提取总蛋白，裂解物在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟以澄清。采用分光光度法测定蛋白浓度。各样品中等量的蛋白质经 SDS-PAGE 分离后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室温下用 5% 脱脂奶粉封闭 2 小时，随后在 4 °C 下与针对 Bcl-2、caspase-3、PARP1、BAX、GAPDH 和 Tubulin 的一抗孵育过夜，抗体稀释比例已优化。洗涤后，膜在室温下与适当的二抗孵育 2 小时。使用化学发光底物对蛋白条带进行显影和成像。采用图像分析软件进行密度分析，条带强度以 GAPDH 和 Tubulin 作为上样对照进行归一化处理。
12. Caspase-3 的免疫荧光显微镜检测
通过免疫荧光染色评估了关键凋亡蛋白caspase-3的表达及其亚细胞定位。处理后，H1299细胞用多聚甲醛固定，经温和去污剂溶液通透化，随后与抗caspase-3的一抗孵育。然后加入荧光标记的二抗以检测一抗信号。细胞核使用DNA结合型荧光染料进行复染。染色后的细胞在荧光显微镜下观察。荧光信号的强度和细胞内分布提供了关于caspase-3活化的定性与空间信息，支持其参与化合物诱导的凋亡反应。
13. 转录组测序
为了分析细胞对测试化合物的转录响应，从经处理的H1299细胞中提取总RNA，并采用标准的质量控制方法评估其完整性。按照既定方案构建测序文库，并利用新一代测序平台进行高通量测序。原始测序数据通过常规生物信息学流程进行处理，包括质量控制过滤、比对至参考基因组以及转录本丰度的定量。通过差异基因表达分析，鉴定出在处理后表达发生统计学显著变化的基因。对差异表达基因进行富集分析和通路分析，以阐明受化合物影响的关键生物学过程，从而全面揭示其分子效应的转录组学特征。
14. 统计分析
所有数据均表示为至少三次独立实验的均值 ± 标准差（SD）。组间统计学差异采用标准方法确定，包括适当的 Student t检验 或单因素方差分析（one-way ANOVA）。当P值小于0.05时，认为差异具有统计学意义。
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关键组分筛选 Pileostegia tomentella 对抗肺癌
实验设计概述如下所示 图1采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS对存在于其中的七种主要生物活性成分进行表征 Pileostegia tomentella (表3随后，使用 SwissTargetPrediction 数据库对这些化合物进行计算机靶点预测。11，将筛选结果限定为相互作用概率超过0.1的条目。该分析共获得260个潜在的基因靶点。同时，从GeneCards数据库中获取与非小细胞肺癌（NSCLC）相关的靶点基因。通过比较分析，发现预测的化合物靶点与NSCLC相关基因之间存在59个重叠基因图2A）。为了直观展示这些关系，利用 Cytoscape 构建了化合物-靶点相互作用网络。该网络旨在阐明潜在的分子作用机制
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非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是一个严峻的全球健康问题，其特征是侵袭性强的生物学行为、快速的临床进展以及高度转移潜能，常导致患者预后不良12。尽管手术切除、放疗和化疗等标准治疗手段在早期疾病中具有一定的治疗效果，但由于药物耐药性的出现和系统性毒性的负担，其在晚期阶段的疗效显著下降13,14。肺癌的潜在发病机制复杂，尚未完全阐明。在中医理论中，非小细胞肺癌 traditionally 被认为与气虚、痰聚和毒邪内生等内在失衡有关15,16。尽管这些概念框架提供了文化层面的理解，但缺乏直接的分子对应关系，因此在本研究的机制解释中未予重点强调。
Pileostegia tomentella一种富含黄酮类、苷类、香豆素、萜类及芳香族化合物等多种植物化学物质的植物，据报道具有显著的抗氧化和抗肿瘤活...
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作者声明无利益冲突。
本工作得到国家中医药管理局高水平重点学科建设项目——中药学（民族药学，壮药）（编号：zyyzdxk-2023165）及人才培养计划的资助 "青年项目" 广西国际壮医医院项目（编号：2022001）；广西中医药多学科交叉创新团队项目（编号：GZKJ2309）；广西中医药大学高层次人才培育创新团队计划（编号：2022A008）；广西壮族自治区科技厅重点研发计划项目（编号：桂科AB21196057）；广西国际壮医医院2023年高层次人才团队建设三年行动计划项目（编号：GZCX20231203、GZCX20231202）；第三批 "启黄项目" 广西中医药大学高层次人才团队培育项目（编号：202414）
作者贡献：
Wen Zhong、Leimin Jiang 和 Bing Qing 对本研究的贡献相同，并列第一作者。他们主要负责实验设计、数据获取以及结果解释。Xiumei Ma 进行了数据分析，并参与了论文撰写。Shi Xianyi、Deng Qingmei 和 Zhou Guangyun 参与了研究设计、数据收集和文献调研。通讯作者 Jiangcun Wei 负责监督数据分析与结果解释，并在论文的起草与修改过程中发挥了主导作用。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V–PE / 7-AAD 凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556547 | 基于流式细胞术的细胞凋亡检测 |
| 抗体：BAX | Abcam | ab32503 | 促凋亡蛋白的 Western blot 检测 |
| 抗体：Bcl-2 | Abcam | ab182858 | Western blot/免疫荧光检测 |
| 抗体：Cleaved Caspase-3 | Abcam | ab32042 | Western blot / 免疫荧光检测 |
| 抗体：GAPDH | Abcam | ab8245 | Western blot 内参对照 |
| 抗体：PARP1 | Abcam | ab32064 | 凋亡标志物的 Western blot 检测 |
| 抗体：Tubulin | Abcam | ab78078 | Western blot 内参对照 |
| ChemDraw | PerkinElmer Informatics | CCG821391 | 小分子结构绘图 |
| 化学发光成像系统 | Tanon Science & Technology | Tanon 5200 | 用于蛋白条带可视化 |
| Cytoscape | Cytoscape.org | https://cytoscape.org | 网络构建与分析 |
| DAPI 核染色试剂 | Sigma | D9542 | 免疫荧光实验中的蓝色核复染剂 |
| DAVID | NIH | https://david.ncifcrf.gov | 功能注释与 KEGG 通路富集分析 |
| DMSO | Sigma | MFCD00002089 | 用于溶解甲臜晶体 |
| 乙醇（用于提取） | Sigma | MFCD00003568 | 超声辅助提取溶剂 |
| 乙酸乙酯 | Sigma | MFCD00009171 | 用于生物活性组分分离 |
| FITC 标记二抗 | Abcam | ab6785 | 用于免疫荧光实验 |
| 流式细胞仪 | Thermo Scientific | A29001 | 用于细胞凋亡和活性氧检测 |
| 荧光显微镜 | Olympus Corporation | BX53F | 用于免疫荧光切片成像 |
| 冷冻干燥机 | Labconco Corporation | 7670520 | 用于样品冻干与保存 |
| GeneCards | Weizmann Institute | https://www.genecards.org | 与疾病相关性的基因数据库 |
| HPLC-LTQ-Orbitrap 质谱联用系统 | Thermo Scientific | IQLAAEGAAVFACZMAIK | 通过质谱进行化合物鉴定 |
| Illumina NovaSeq 测序平台 | Illumina Inc. | 20012850 | 用于 RNA-seq 分析 |
| LDH 细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0016 | 通过检测 LDH 释放评估细胞毒性 |
| 酶标仪 | Thermo Scientific | VL0000D0 | 用于 MTT 和 LDH 实验中的吸光度测定 |
| MTT 细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C0009S | 用于 MTT 实验评估细胞活力 |
| qPCR 仪 | Thermo Scientific | 4485701 | 用于基因表达分析 |
| R 软件 | R Foundation | https://www.r-project.org | 统计计算与通路图绘制 |
| 逆转录试剂盒（RT 试剂盒） | Vazyme | MR201 | 用于 cDNA 合成 |
| RNA-seq 文库构建试剂盒 | Illumina Inc. | 20020594 | 用于测序的文库制备 |
| SwissTargetPrediction | Swiss Institute | http://www.swisstargetprediction.ch | 化合物靶点预测工具 |
| SYBR Green qPCR 预混液 | Vazyme | Q311-02 | 用于定量 PCR |
| TRIzol 试剂（RNA 提取） | Sigma | T3934 | 用于总 RNA 提取 |
| 超声波清洗机 | Branson | M1800-CPXH | 用于超声辅助提取 |
| Western Blot 装置 | Thermo Scientific | A56727 | 凝胶电泳与蛋白转膜 |
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