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研究文章

通过活性氧介导的经典凋亡途径研究Pileostegia tomentella主要成分对非小细胞肺癌细胞的抗癌作用

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DOI:

10.3791/69008

2025年9月19日

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种评估天然化合物在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中诱导活性氧(ROS)介导的细胞凋亡的方法。

摘要

本研究探讨了Pileostegia tomentella的抗癌潜力,尤其关注其通过活性氧(ROS)介导的途径在H1299非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中诱导经典凋亡的能力。采用生物活性导向分离方法,鉴定出两种具有活性的化合物——伞形花内酯(umbelliferone, UMB)和表Vogeloside(epi-Vogeloside),它们是该植物主要的细胞毒活性成分。这两种化合物均显著抑制细胞活力,并有效诱导H1299细胞发生凋亡性死亡。机制研究表明,UMB和表Vogeloside处理可显著提高细胞内ROS水平,提示氧化应激在其中起关键介导作用。Western blot分析显示,caspase-3剪切水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,表明线粒体介导的内源性凋亡通路被激活。此外,转录组学分析显示基因表达发生广泛改变,进一步支持细胞稳态受到破坏。这些结果表明,Pileostegia tomentella及其活性成分在肺癌治疗中具有潜在的应用前景。

引言

癌症是一项严峻的全球公共卫生挑战,其特征是每年有大量死亡病例。非小细胞肺癌(NSCLC)是全球癌症相关死亡的主要原因,约占肺癌病例的85%1。致癌过程本质上是分子与细胞活动之间复杂的相互作用,其中活性氧(ROS)稳态的紊乱起着关键影响。ROS包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢等不稳定的氧化剂,是正常细胞代谢的副产物,在信号传导、增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要功能2。ROS浓度失衡可引发氧化应激,可能激活程序性细胞死亡通路,特别是自噬和凋亡,从而抑制癌细胞的增殖与存活3。因此,ROS在肿瘤学中具有双重作用,既可促进也可抑制肿瘤进展。在过去十年中,NSCLC的治疗策略取得了显著进展,其中开发旨在利用ROS这种双重特性的新型抗癌药物已成为一个尤为活跃的研究领域4

许多化学合成的抗癌药物,如阿霉素(多柔比星)、顺铂和环磷酰胺,已知可通过促进活性氧(ROS)的产生来诱导癌细胞凋亡5。尽管靶向治疗和免疫治疗抗体已取得进展,基于铂类的化疗仍是非小细胞肺癌(NSCLC)患者治疗的基石。然而,化疗所引发的耐药性及不良副作用,促使人们亟需开发新型抗非小细胞肺癌药物。因此,探索天然来源中的抗癌化合物日益被认为具有重要意义和潜力。近期研究表明,某些植物提取物....

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方案

本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。

1. 化学成分 Pileostegia tomentella 和非小细胞肺癌靶点预测

采用高效液相色谱结合线性离子阱-轨道阱质谱法(HPLC-LTQ/MS)对Pileostegia tomentella的化学成分进行分析。提取物溶解于适当的溶剂中,过滤后进样。色谱分离采用反相色谱柱,并根据化合物类别设计梯度洗脱程序。质谱数据在正离子电喷雾电离模式下采集,质量扫描范围为100–1500 m/z。已鉴定化合物的分子结构使用通用化学绘图软件绘制,并以SDF格式保存。这些结构文件提交至在线靶点预测工具,用于识别潜在的生物靶点,选取前20个预测靶点进行进一步验证。非小细胞肺癌(NSCLC)相关靶点从公开可访问的基因数据库中获取。两组数据集的交集靶点被确定为Pileostegia tomentella的潜在治疗靶点。

2. 成分-靶点网络构建

预测靶点的蛋白质-蛋白质相互作用数据来自一个开放获取的蛋白质相互作用数据库。将相互作用数据导入通用网络可视化软件,以构建化合物-靶点相互作用网络。利用内置分析工具分析网络拓扑特性,包括度中心性、介数....

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结果

关键组分筛选 Pileostegia tomentella 对抗肺癌
实验设计概述如下所示 图1采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS对存在于其中的七种主要生物活性成分进行表征 Pileostegia tomentella (表3随后,使用 SwissTargetPrediction 数据库对这些化合物进行计算机靶点预测。11,将筛选结果限定为相互作用概率超过0.1的条目。该分析共获得260个潜在的基因靶点。同时,从GeneCards数据库中获取与非小细胞肺癌(NSCLC)相关的靶点基因。通过比较分析,发现预测的化合物靶点与NSCLC相关基因之间存在59个重叠基因图2A)。为了直观展示这些关系,利用 Cytoscape 构建了化合物-靶点相互作用网络。该网络旨在阐明潜在的分子作用机制

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讨论

非小细胞肺癌(NSCLC)仍然是一个严峻的全球健康问题,其特征是侵袭性强的生物学行为、快速的临床进展以及高度转移潜能,常导致患者预后不良12。尽管手术切除、放疗和化疗等标准治疗手段在早期疾病中具有一定的治疗效果,但由于药物耐药性的出现和系统性毒性的负担,其在晚期阶段的疗效显著下降13,14。肺癌的潜在发病机制复杂,尚未完全阐明。在中医理论中,非小细胞肺癌 traditionally 被认为与气虚、痰聚和毒邪内生等内在失衡有关15,16。尽管这些概念框架提供了文化层面的理解,但缺乏直接的分子对应关系,因此在本研究的机制解释中未予重点强调。

Pileostegia tomentella一种富含黄酮类、苷类、香豆素、萜类及芳香族化合物等多种植物化学物质的植物,据报道具有显著的抗氧化和抗肿瘤活.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家中医药管理局高水平重点学科建设项目——中药学(民族药学,壮药)(编号:zyyzdxk-2023165)及人才培养计划的资助 "青年项目" 广西国际壮医医院项目(编号:2022001);广西中医药多学科交叉创新团队项目(编号:GZKJ2309);广西中医药大学高层次人才培育创新团队计划(编号:2022A008);广西壮族自治区科技厅重点研发计划项目(编号:桂科AB21196057);广西国际壮医医院2023年高层次人才团队建设三年行动计划项目(编号:GZCX20231203、GZCX20231202);第三批 "启黄项目" 广西中医药大学高层次人才团队培育项目(编号:202414)

作者贡献:

Wen Zhong、Leimin Jiang 和 Bing Qing 对本研究的贡献相同,并列第一作者。他们主要负责实验设计、数据获取以及结果解释。Xiumei Ma 进行了数据分析,并参与了论文撰写。Shi Xianyi、Deng Qingmei 和 Zhou Guangyun 参与了研究设计、数据收集和文献调研。通讯作者 Jiangcun Wei 负责监督数据分析与结果解释,并在论文的起草与修改过程中发挥了主导作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Annexin V–PE / 7-AAD 凋亡检测试剂盒BD Biosciences556547基于流式细胞术的细胞凋亡检测
抗体:BAXAbcamab32503促凋亡蛋白的 Western blot 检测
抗体:Bcl-2Abcamab182858Western blot/免疫荧光检测
抗体:Cleaved Caspase-3Abcamab32042Western blot / 免疫荧光检测
抗体:GAPDHAbcamab8245Western blot 内参对照
抗体:PARP1Abcamab32064凋亡标志物的 Western blot 检测
抗体:TubulinAbcamab78078Western blot 内参对照
ChemDrawPerkinElmer InformaticsCCG821391小分子结构绘图
化学发光成像系统Tanon Science & TechnologyTanon 5200用于蛋白条带可视化
CytoscapeCytoscape.orghttps://cytoscape.org网络构建与分析
DAPI 核染色试剂Sigma D9542免疫荧光实验中的蓝色核复染剂
DAVIDNIHhttps://david.ncifcrf.gov功能注释与 KEGG 通路富集分析
DMSOSigma 
MFCD00002089
用于溶解甲臜晶体
乙醇(用于提取)SigmaMFCD00003568超声辅助提取溶剂
乙酸乙酯SigmaMFCD00009171用于生物活性组分分离
FITC 标记二抗Abcamab6785用于免疫荧光实验
流式细胞仪Thermo ScientificA29001用于细胞凋亡和活性氧检测
荧光显微镜Olympus CorporationBX53F用于免疫荧光切片成像
冷冻干燥机Labconco Corporation7670520用于样品冻干与保存
GeneCardsWeizmann Institutehttps://www.genecards.org与疾病相关性的基因数据库
HPLC-LTQ-Orbitrap 质谱联用系统Thermo ScientificIQLAAEGAAVFACZMAIK通过质谱进行化合物鉴定
Illumina NovaSeq 测序平台Illumina Inc.20012850用于 RNA-seq 分析
LDH 细胞毒性检测试剂盒BeyotimeC0016通过检测 LDH 释放评估细胞毒性
酶标仪Thermo ScientificVL0000D0用于 MTT 和 LDH 实验中的吸光度测定
MTT 细胞活力检测试剂盒Beyotime C0009S用于 MTT 实验评估细胞活力
qPCR 仪Thermo Scientific4485701用于基因表达分析
R 软件R Foundationhttps://www.r-project.org统计计算与通路图绘制
逆转录试剂盒(RT 试剂盒)VazymeMR201用于 cDNA 合成
RNA-seq 文库构建试剂盒Illumina Inc.20020594用于测序的文库制备
SwissTargetPredictionSwiss Institutehttp://www.swisstargetprediction.ch化合物靶点预测工具
SYBR Green qPCR 预混液VazymeQ311-02用于定量 PCR
TRIzol 试剂(RNA 提取)Sigma T3934用于总 RNA 提取
超声波清洗机BransonM1800-CPXH用于超声辅助提取
Western Blot 装置Thermo ScientificA56727凝胶电泳与蛋白转膜

参考文献

  1. Fan, D., Yu, S., Yang, Y., Qu, S. Pyoluteorin induces apoptosis and autophagy in NSCLC cells. Biol Pharm Bull. 44 (7), 976-983 (2021).
  2. Cui, Q., et al. Modulating ROS to overcome multidrug resistance in cancer. Drug Resist Updat. 41, 1-25 (2018).
  3. ....

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重印与许可

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ROS介导的细胞凋亡伞形酮表-黄夹苷细胞活力氧化应激线粒体凋亡通路蛋白质印迹