本方案介绍了一种评估天然化合物在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导活性氧（ROS）介导的细胞凋亡的方法。
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研究文章
* These authors contributed equally
本方案介绍了一种评估天然化合物在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导活性氧（ROS）介导的细胞凋亡的方法。
本研究探讨了Pileostegia tomentella的抗癌潜力，尤其关注其通过活性氧（ROS）介导的途径在H1299非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导经典凋亡的能力。采用生物活性导向分离方法，鉴定出两种具有活性的化合物——伞形花内酯（umbelliferone, UMB）和表Vogeloside（epi-Vogeloside），它们是该植物主要的细胞毒活性成分。这两种化合物均显著抑制细胞活力，并有效诱导H1299细胞发生凋亡性死亡。机制研究表明，UMB和表Vogeloside处理可显著提高细胞内ROS水平，提示氧化应激在其中起关键介导作用。Western blot分析显示，caspase-3剪切水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，表明线粒体介导的内源性凋亡通路被激活。此外，转录组学分析显示基因表达发生广泛改变，进一步支持细胞稳态受到破坏。这些结果表明，Pileostegia tomentella及其活性成分在肺癌治疗中具有潜在的应用前景。
癌症是一项严峻的全球公共卫生挑战，其特征是每年有大量死亡病例。非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因，约占肺癌病例的85%1。致癌过程本质上是分子与细胞活动之间复杂的相互作用，其中活性氧（ROS）稳态的紊乱起着关键影响。ROS包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢等不稳定的氧化剂，是正常细胞代谢的副产物，在信号传导、增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要功能2。ROS浓度失衡可引发氧化应激，可能激活程序性细胞死亡通路，特别是自噬和凋亡，从而抑制癌细胞的增殖与存活3。因此，ROS在肿瘤学中具有双重作用，既可促进也可抑制肿瘤进展。在过去十年中，NSCLC的治疗策略取得了显著进展，其中开发旨在利用ROS这种双重特性的新型抗癌药物已成为一个尤为活跃的研究领域4。
许多化学合成的抗癌药物，如阿霉素（多柔比星）、顺铂和环磷酰胺，已知可通过促进活性氧（ROS）的产生来诱导癌细胞凋亡5。尽管靶向治疗和免疫治疗抗体已取得进展，基于铂类的化疗仍是非小细胞肺癌（NSCLC）患者治疗的基石。然而，化疗所引发的耐药性及不良副作用，促使人们亟需开发新型抗非小细胞肺癌药物。因此，探索天然来源中的抗癌化合物日益被认为具有重要意义和潜力。近期研究表明，某些植物提取物....
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本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。
1. 化学成分 Pileostegia tomentella 和非小细胞肺癌靶点预测
采用高效液相色谱结合线性离子阱-轨道阱质谱法（HPLC-LTQ/MS）对Pileostegia tomentella的化学成分进行分析。提取物溶解于适当的溶剂中，过滤后进样。色谱分离采用反相色谱柱，并根据化合物类别设计梯度洗脱程序。质谱数据在正离子电喷雾电离模式下采集，质量扫描范围为100–1500 m/z。已鉴定化合物的分子结构使用通用化学绘图软件绘制，并以SDF格式保存。这些结构文件提交至在线靶点预测工具，用于识别潜在的生物靶点，选取前20个预测靶点进行进一步验证。非小细胞肺癌（NSCLC）相关靶点从公开可访问的基因数据库中获取。两组数据集的交集靶点被确定为Pileostegia tomentella的潜在治疗靶点。
2. 成分-靶点网络构建
预测靶点的蛋白质-蛋白质相互作用数据来自一个开放获取的蛋白质相互作用数据库。将相互作用数据导入通用网络可视化软件，以构建化合物-靶点相互作用网络。利用内置分析工具分析网络拓扑特性，包括度中心性、介数....
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关键组分筛选 Pileostegia tomentella 对抗肺癌
实验设计概述如下所示 图1采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS对存在于其中的七种主要生物活性成分进行表征 Pileostegia tomentella (表3随后，使用 SwissTargetPrediction 数据库对这些化合物进行计算机靶点预测。11，将筛选结果限定为相互作用概率超过0.1的条目。该分析共获得260个潜在的基因靶点。同时，从GeneCards数据库中获取与非小细胞肺癌（NSCLC）相关的靶点基因。通过比较分析，发现预测的化合物靶点与NSCLC相关基因之间存在59个重叠基因图2A）。为了直观展示这些关系，利用 Cytoscape 构建了化合物-靶点相互作用网络。该网络旨在阐明潜在的分子作用机制
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非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是一个严峻的全球健康问题，其特征是侵袭性强的生物学行为、快速的临床进展以及高度转移潜能，常导致患者预后不良12。尽管手术切除、放疗和化疗等标准治疗手段在早期疾病中具有一定的治疗效果，但由于药物耐药性的出现和系统性毒性的负担，其在晚期阶段的疗效显著下降13,14。肺癌的潜在发病机制复杂，尚未完全阐明。在中医理论中，非小细胞肺癌 traditionally 被认为与气虚、痰聚和毒邪内生等内在失衡有关15,16。尽管这些概念框架提供了文化层面的理解，但缺乏直接的分子对应关系，因此在本研究的机制解释中未予重点强调。
Pileostegia tomentella一种富含黄酮类、苷类、香豆素、萜类及芳香族化合物等多种植物化学物质的植物，据报道具有显著的抗氧化和抗肿瘤活.......
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作者声明无利益冲突。
本工作得到国家中医药管理局高水平重点学科建设项目——中药学（民族药学，壮药）（编号：zyyzdxk-2023165）及人才培养计划的资助 "青年项目" 广西国际壮医医院项目（编号：2022001）；广西中医药多学科交叉创新团队项目（编号：GZKJ2309）；广西中医药大学高层次人才培育创新团队计划（编号：2022A008）；广西壮族自治区科技厅重点研发计划项目（编号：桂科AB21196057）；广西国际壮医医院2023年高层次人才团队建设三年行动计划项目（编号：GZCX20231203、GZCX20231202）；第三批 "启黄项目" 广西中医药大学高层次人才团队培育项目（编号：202414）
作者贡献：
Wen Zhong、Leimin Jiang 和 Bing Qing 对本研究的贡献相同，并列第一作者。他们主要负责实验设计、数据获取以及结果解释。Xiumei Ma 进行了数据分析，并参与了论文撰写。Shi Xianyi、Deng Qingmei 和 Zhou Guangyun 参与了研究设计、数据收集和文献调研。通讯作者 Jiangcun Wei 负责监督数据分析与结果解释，并在论文的起草与修改过程中发挥了主导作用。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V–PE / 7-AAD 凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556547 | 基于流式细胞术的细胞凋亡检测 |
| 抗体：BAX | Abcam | ab32503 | 促凋亡蛋白的 Western blot 检测 |
| 抗体：Bcl-2 | Abcam | ab182858 | Western blot/免疫荧光检测 |
| 抗体：Cleaved Caspase-3 | Abcam | ab32042 | Western blot / 免疫荧光检测 |
| 抗体：GAPDH | Abcam | ab8245 | Western blot 内参对照 |
| 抗体：PARP1 | Abcam | ab32064 | 凋亡标志物的 Western blot 检测 |
| 抗体：Tubulin | Abcam | ab78078 | Western blot 内参对照 |
| ChemDraw | PerkinElmer Informatics | CCG821391 | 小分子结构绘图 |
| 化学发光成像系统 | Tanon Science & Technology | Tanon 5200 | 用于蛋白条带可视化 |
| Cytoscape | Cytoscape.org | https://cytoscape.org | 网络构建与分析 |
| DAPI 核染色试剂 | Sigma | D9542 | 免疫荧光实验中的蓝色核复染剂 |
| DAVID | NIH | https://david.ncifcrf.gov | 功能注释与 KEGG 通路富集分析 |
| DMSO | Sigma | MFCD00002089 | 用于溶解甲臜晶体 |
| 乙醇（用于提取） | Sigma | MFCD00003568 | 超声辅助提取溶剂 |
| 乙酸乙酯 | Sigma | MFCD00009171 | 用于生物活性组分分离 |
| FITC 标记二抗 | Abcam | ab6785 | 用于免疫荧光实验 |
| 流式细胞仪 | Thermo Scientific | A29001 | 用于细胞凋亡和活性氧检测 |
| 荧光显微镜 | Olympus Corporation | BX53F | 用于免疫荧光切片成像 |
| 冷冻干燥机 | Labconco Corporation | 7670520 | 用于样品冻干与保存 |
| GeneCards | Weizmann Institute | https://www.genecards.org | 与疾病相关性的基因数据库 |
| HPLC-LTQ-Orbitrap 质谱联用系统 | Thermo Scientific | IQLAAEGAAVFACZMAIK | 通过质谱进行化合物鉴定 |
| Illumina NovaSeq 测序平台 | Illumina Inc. | 20012850 | 用于 RNA-seq 分析 |
| LDH 细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0016 | 通过检测 LDH 释放评估细胞毒性 |
| 酶标仪 | Thermo Scientific | VL0000D0 | 用于 MTT 和 LDH 实验中的吸光度测定 |
| MTT 细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C0009S | 用于 MTT 实验评估细胞活力 |
| qPCR 仪 | Thermo Scientific | 4485701 | 用于基因表达分析 |
| R 软件 | R Foundation | https://www.r-project.org | 统计计算与通路图绘制 |
| 逆转录试剂盒（RT 试剂盒） | Vazyme | MR201 | 用于 cDNA 合成 |
| RNA-seq 文库构建试剂盒 | Illumina Inc. | 20020594 | 用于测序的文库制备 |
| SwissTargetPrediction | Swiss Institute | http://www.swisstargetprediction.ch | 化合物靶点预测工具 |
| SYBR Green qPCR 预混液 | Vazyme | Q311-02 | 用于定量 PCR |
| TRIzol 试剂（RNA 提取） | Sigma | T3934 | 用于总 RNA 提取 |
| 超声波清洗机 | Branson | M1800-CPXH | 用于超声辅助提取 |
| Western Blot 装置 | Thermo Scientific | A56727 | 凝胶电泳与蛋白转膜 |
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