本方案介绍了一种利用伊文思蓝染料评估成年斑马鱼（Danio rerio）模型中血脑屏障（BBB）完整性的可靠方法，可实现对神经血管屏障破坏的定性与定量分析。
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摘要
摘要
血脑屏障（BBB）是一种半透性界面，通过调控物质进出大脑来维持中枢神经系统（CNS）的稳态，从而保护神经组织免受潜在有害物质的侵害。BBB的破坏是多种神经退行性疾病（包括帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD））的明确特征，在这些疾病中，通透性增加会促进并加剧疾病的进展。尽管成年斑马鱼（Danio rerio）作为研究神经退行性疾病的模型正日益受到重视，但针对该物种的BBB完整性评估标准化方法仍较为有限。本实验方案描述了一种简单、可重复且成本效益高的方法，通过分析伊文思蓝（EB）染料从神经血管渗出至脑组织的情况，来评估成年斑马鱼的BBB通透性。该方法结合了EB分布的定性可视化与定量图像分析，以检测BBB的破坏情况。关键步骤包括EB染料的正确腹腔注射、系统性染料循环的确认、精细的脑组织解剖，以及一致的成像和灰度强度测量。实验中设置了阳性和阴性对照，以验证染料渗透的有效性，并支持准确的结果解读。代表性结果表明，与注射生理盐水的对照组相比，帕金森病模型斑马鱼脑组织中EB的渗出量更高，提示BBB通透性增加。该技术所需专用设备极少，适用于资源有限的实验室。总体而言，本方案为研究成年斑马鱼模型中的BBB完整性提供了一种实用工具，且可适用于多种应用场景，包括疾病机制研究以及针对神经血管功能的治疗干预评估。
引言
血脑屏障（BBB）是一种具有选择性、半通透性的生理界面，主要由特化的脑微血管内皮细胞构成，并受到周细胞和星形胶质细胞的支持，可调控血液与脑组织间质之间的分子交换，从而维持中枢神经系统（CNS）的微环境稳定。其结构完整性对于维持中枢神经系统的稳态以及保护神经组织免受有害或毒性物质侵害至关重要1。BBB的破坏是多种神经退行性疾病中公认的病理特征，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病以及肌萎缩侧索硬化症2,3。当BBB功能受损时，通透性增加，导致神经毒性物质和炎症介质侵入脑组织，从而加剧疾病进展4。因此，评估BBB的完整性对于深入理解这些疾病的神经血管和炎症机制具有重要意义。
尽管啮齿类动物的体内模型和体外模型仍是血脑屏障（BBB）研究的金标准5，斑马鱼（Danio rerio）由于其基因可操作性强、成本低、操作简便，且在神经解剖结构和血脑屏障特性方面与哺乳动物高度保守，已成为神经科学领域有价值的脊椎动物模型6。尽管斑马鱼在神经退行性疾病研究中的应用日益广泛，目前仍缺乏评估成年斑马鱼血脑屏障完整性的有效方法7,8。荧光示踪剂注射或转基因报告系统等技术已在幼鱼中广泛应用9,10，但由于成鱼存在色素沉着和透明度下降等问题，在成年个体中的应用面临显著挑战。因此，本研究旨在建立一种简单、可重复且可视化程度高的实验方案，通过伊文思蓝（Evan's Blue, EB）染料外渗法评估成年斑马鱼的血脑屏障通透性。该方法结合了对脑组织中染料渗漏的定性观察与定量测定，为在病理条件下评价神经血管完整性提供了一种实用工具。
伊文思蓝染料可与血清白蛋白结合，在正常情况下无法穿过完整的血脑屏障11，因此为评估屏障破坏提供了一种可行的替代方法12。伊文思蓝外渗已被广泛应用于啮齿类动物模型中，以检测创伤性脑损伤、中风和神经炎症等状况下的血脑屏障渗漏13。然而，该方法在成年斑马鱼中的应用仍基本未被探索。本研究提出了一种针对成年斑马鱼优化的伊文思蓝染料技术的新方案，可实现对血脑屏障通透性的可靠定性和定量评估。该方法成本低廉，所需专用设备极少，并可轻松扩展用于多个个体，相较于通常用于幼鱼的更复杂的基于成像的方法具有实际优势。
利用本方案，我们评估了健康成年斑马鱼和帕金森病模型成年斑马鱼的血脑屏障（BBB）完整性。为在斑马鱼中诱导帕金森病表型，采用腹腔注射神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP），操作依据先前报道的方法14。结果显示，帕金森病斑马鱼脑组织中伊文思蓝（EB）的外渗显著增加，与帕金森病（PD）中已有充分记录的血脑屏障破坏现象一致。这些结果验证了该方法的灵敏性和可靠性，支持其在关联血管病理与分子及行为学结局中的应用价值。因此，该技术为研究神经血管因素在神经退行性疾病中作用的研究人员提供了一种有价值的工具，可应用于基因修饰型和毒素诱导型斑马鱼模型。
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方案
本方案已获马来西亚国际伊斯兰大学（IIUM）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，参考动物伦理批准编号为：IIUM/504/14/2/IACUC。
1. 准备伊文思蓝染料储备液
- 将0.1 g EB染料溶解于10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制1%（w/v）的储存液。充分混匀，直至染料完全溶解。
注意：EB属于1B类致癌物。避免与皮肤和眼睛直接接触。使用防护服、手套、护目镜和防尘口罩。避免吸入粉尘，并遵循制造商提供的操作说明。不得将伊文思蓝染料（固体或溶液）倒入水槽。应将废弃物保存在贴有标签的原装容器中，并根据国家和地方危险废物管理规定进行处置。 - 使用0.45 µm针头滤器过滤溶液，将滤液收集至无菌的15 mL离心管中。用铝箔包裹试管，并于4 °C保存。
备注：也可使用更小孔径的滤器（如0.2 µm）。该储存液在4 °C下可保存最多两周，或在-20 °C下保存最多一个月；建议分装保存，以减少冷冻储存时反复冻融的次数。
2. 向成年斑马鱼施用伊文思蓝染料
- 麻醉斑马鱼 通过 通过将水温从12 °C逐渐降低至7 °C，使鱼类不再对触觉刺激产生反应，从而实现低温休克。
注意：可通过在数分钟内缓慢向水中加入少量碎冰来实现温度的逐步降低，使温度逐渐下降。浸入三卡因也是一种合适的麻醉替代方法。 - 使用31 G胰岛素注射器向腹腔（IP）内注射20 µL 1% EB染料。注射后在注射部位施加轻柔压力10秒，以防止回流。
注意：斑马鱼的腹膜腔位于盆骨带后方。为提高EB给药的成功率，注射前应将斑马鱼禁食24小时。此举可排空腹腔，从而更便于进入并准确定位腹膜腔。 - 将鱼转移至恢复缸中，恢复30分钟。观察是否有损伤、死亡或行为异常。
注意：为帮助斑马鱼恢复，恢复箱中的水温应略低（20–24 °C），以提供轻微的麻醉效果，并减轻注射后可能的不适。注射后的鱼体会呈现蓝色，表明染料循环成功图1). - 30分钟后，处死斑马鱼 通过 在1°C至3°C下进行低温休克处理，随后使用无菌刀片或手术剪刀将鱼体断头。
注意：为便于后续脑组织解剖，断头时应在头部后方保留较多的肌肉组织。 - 用1× PBS（鱼与PBS体积比为1:20）冲洗头部两次，以去除多余的血液和EB染料。
注意：洗涤不充分可能导致假阳性结果，影响分析的准确性。为避免此问题，需用1×PBS对脑组织彻底洗涤至少两次，确保去除所有可见血液和游离染料。若仍有残留染料，强烈建议进行第三次洗涤。 - 将头部置于4%多聚甲醛（PFA）中，4 °C过夜固定（鱼样与固定液体积比为1:20）。固定过程中无需振荡，因斑马鱼头部体积较小且固定液充足，静态条件下即可实现有效的渗透。
警告：若误吞、吸入或皮肤接触，多聚甲醛（PFA）有害。配制PFA溶液时应在通风橱中进行。使用适当的个人防护装备，避免吸入粉尘。遵循制造商提供的所有安全指南。将PFA作为危险废物处理，禁止排入下水道。将废液收集于密封容器中并贴上标签，按照当地和国家法规进行处置。 - 解剖斑马鱼大脑
- 将固定好的头部置于洁净的培养皿中，并按照先前所述方法解剖脑组织15使用尖头镊子进行操作。解剖过程中需持续逐滴加入1×PBS，以保持组织湿润，防止干燥。
- 通过将1 g琼脂糖溶解于100 mL蒸馏水中制备琼脂糖平板。微波加热至完全融化后，倒入培养皿中，静置使其凝固。
- 将解剖得到的脑组织在两份独立的1×PBS溶液中各清洗一次。随后，将组织置于1%琼脂糖板上，以保持湿润并防止收缩。
注意：洗涤不充分可能导致假阳性结果，影响分析的准确性。为避免此问题，需用1× PBS对脑组织彻底洗涤至少两次，确保去除所有可见血液和游离染料。若仍有残留染料，强烈建议进行第三次洗涤。
图1：正常斑马鱼与EB染色注射斑马鱼皮肤着色的比较。（A）显示典型棕褐色皮肤色调的正常斑马鱼。（B）表现出明显蓝色调的EB注射斑马鱼，表明染料已成功进入全身循环。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 建立阳性对照 通过 刺伤损伤（SWI）
注意：穿刺损伤会破坏血脑屏障（BBB），并使伊文思蓝（EB）在损伤部位外渗。
- 使用低温休克法对鱼类进行麻醉（参见步骤 2.1）。麻醉后，注射 20 µL 的 1% 伊文思蓝染料（EB 染料），并按照步骤 2.2 和 2.3 所述，让鱼类恢复 30 分钟。
- 经过 30 分钟恢复期后，准备一支连接在胰岛素注射器上的无菌 31 G 针头，并按以下步骤进行刺伤损伤操作：
- 再次对鱼类进行麻醉。
- 将鱼类垂直放置在平坦的低温表面上（例如冰袋）。将针头以 90° 角插入端脑的一侧，深度不超过 1.5 mm（图 2）。
注意：为防止鱼类皮肤直接接触冰袋造成潜在损伤，应在鱼类与低温表面之间放置一层纱布或纸巾（图 2）。或者，可将鱼类置于放置在冰袋上的浅层培养皿中，以实现降温而不发生直接接触。在针头上标记 1.5 mm 刻度，以防止插入过深。 - 将鱼类转移至恢复缸中，恢复 30 分钟。
- 按照步骤 2.4 至 2.7 所述，实施安乐死、断头、固定并解剖脑组织。
- 作为阴性对照，使用 20 µL 的 1x PBS 替代 EB 染料，重复步骤 2.1 至 2.7。
图2：用于阳性对照的刺伤损伤。（A）将31G针头短暂插入端脑（红圈），以促进伊文思蓝染料进入脑组织；未损伤脑组织与刺伤后脑组织的并列比较，（B）刺伤部位的背侧视图（红圈），（C）刺伤部位的侧视图。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
4. EB渗漏的定性分析
- 在体视显微镜下观察解剖后的脑组织。优化图像设置（放大倍数、白平衡、曝光、对比度等），以确保一致性。
- 使用显微镜连接的相机拍摄图像，并以 .TIFF 格式保存。
注意：所有样本应使用相同的成像设置，以确保可比性。
5. EB渗漏的定量分析
- 下载并安装 Fiji（软件下载链接见材料表）。在 Fiji 中打开图像。
- 执行颜色解卷积：点击 图像 > 颜色 > 颜色解卷积 > RGB，生成代表红色、绿色和蓝色色调的三幅独立图像。
注意：此步骤将蓝色与其他颜色成分分离，确保仅测量蓝色染料的强度。 - 点击蓝色通道图像（通常标记为“Color_3”）以激活该通道。通过点击 图像 > 类型 > 8位，将其转换为8位灰度图像。
注意：灰度转换可最大限度减少颜色伪影，并增强基于强度的分析。 - 测量8位图像的灰度强度。
- 设置测量参数：选择 分析 > 设置测量项，勾选“面积”和“平均灰度值”。
- 使用矩形选区工具，在所有样本中绘制大小一致的兴趣区域（ROI），然后选择 分析 > 测量 或按 Ctrl + M 进行灰度强度测量。
注意：所有样本必须使用相同大小的 ROI。ROI 的绝对尺寸可根据所获取图像的放大倍数和分辨率进行调整，研究人员应在数据集中标准化 ROI 大小以确保可比性。8位灰度图像中的每个像素具有 0 到 255 的强度值，其中 0 表示纯黑，255 表示纯白，中间值表示不同深浅的灰色。 - 为减少偏差，在所有样本的解剖位置一致的脑区内部绘制三至五个 ROI。避免选择存在伪影或染色不均的区域。
注意：可通过参考解剖标志物并确保实验组间 ROI 位置对称，实现定位的一致性。 - 对每幅图像中多个 ROI 的平均灰度值取平均，得到每个脑组织的单一强度值。使用该平均值进行组间统计比较。
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结果
该方案已在帕金森病斑马鱼模型上进行测试。血脑屏障的受损在帕金森病患者中是一种有充分文献记载的现象。16,17,18 以及在多种帕金森病动物模型中19,20,21为研究成年斑马鱼帕金森病模型中血脑屏障（BBB）的完整性，比较了生理盐水注射（对照组）与帕金森病斑马鱼脑组织中伊文思蓝（EB）染料的外渗情况。成年斑马鱼帕金森病模型的建立方法如下： 通过 24小时前行血脑屏障评估前，按先前发表的方法腹腔注射一次MPTP（200 µg/g）14与此同时，生理盐水注射组经腹腔注射给予生理盐水（NS）。在正常生理条件下，伊文思蓝染料（EB）无法透过完整的血脑屏障（BBB）。11
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讨论
评估血脑屏障（BBB）的完整性对于理解脑部相关疾病的病理生理机制至关重要，因为受损的血脑屏障既可导致疾病发生，也可加剧疾病进展4。尽管成年斑马鱼已成为研究神经退行性疾病的有效模型，但针对该物种的血脑屏障完整性评估方法仍不完善8。本文所介绍的实验方案提供了一种简单且经济的方法，通过分析伊文思蓝（EB）染料从神经血管渗漏至脑组织的情况，来评估成年斑马鱼血脑屏障的通透性。该方法技术门槛低，仅需使用常规且廉价的实验材料，相较于依赖昂贵荧光示踪剂的其他方法更具优势。此外，该方法可提供定性与定量双重检测指标，使研究人员能够可靠地检测并表征斑马鱼疾病模型中的血脑屏障破坏情况。因此，该方法特别适用于资源有限但希望获得有意义血脑屏障数据的实验室。
正确进行腹腔注射EB染料对于确保染色的一致性和有效性至关重要；注射不准确可能导致结果出现差异。需要注意的是，雄性和雌性斑马鱼体型略有不同22，雄鱼腹部较纤细，而雌鱼腹部更圆润，因此在进入腹腔的最佳注射位点上存在轻微...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由马来西亚高等教育 Ministry（MoHE）在基础研究拨款计划（FRGS）下资助，资助编号为 FRGS19-125-0734。本研究的出版援助由马来西亚国民大学（UKM）医学院提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖粉末 | Vivantis | PC0701 | |
| 伊文思蓝染料 | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| Fiji ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 下载链接: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| 显微镜相机 | 深圳海亚电子有限公司 | HY-500M | |
| 多聚甲醛（PFA）粉末 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 氯化钠（NaCl） | HmbG Chemicals | 7647-14-5 | |
| 体视显微镜 | 奥林巴斯公司 | SZ40 | |
| 注射器滤器单元，0.45µm | 默克密理博 | SLHV004SL |
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