可视化血脑屏障守门人：基于伊文思蓝染料的成年斑马鱼血脑屏障通透性评估

摘要

本方案介绍了一种利用伊文思蓝染料评估成年斑马鱼（Danio rerio）模型中血脑屏障（BBB）完整性的可靠方法，可实现对神经血管屏障破坏的定性与定量分析。

摘要

血脑屏障（BBB）是一种半透性界面，通过调控物质进出大脑来维持中枢神经系统（CNS）的稳态，从而保护神经组织免受潜在有害物质的侵害。BBB的破坏是多种神经退行性疾病（包括帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD））的明确特征，在这些疾病中，通透性增加会促进并加剧疾病的进展。尽管成年斑马鱼（Danio rerio）作为研究神经退行性疾病的模型正日益受到重视，但针对该物种的BBB完整性评估标准化方法仍较为有限。本实验方案描述了一种简单、可重复且成本效益高的方法，通过分析伊文思蓝（EB）染料从神经血管渗出至脑组织的情况，来评估成年斑马鱼的BBB通透性。该方法结合了EB分布的定性可视化与定量图像分析，以检测BBB的破坏情况。关键步骤包括EB染料的正确腹腔注射、系统性染料循环的确认、精细的脑组织解剖，以及一致的成像和灰度强度测量。实验中设置了阳性和阴性对照，以验证染料渗透的有效性，并支持准确的结果解读。代表性结果表明，与注射生理盐水的对照组相比，帕金森病模型斑马鱼脑组织中EB的渗出量更高，提示BBB通透性增加。该技术所需专用设备极少，适用于资源有限的实验室。总体而言，本方案为研究成年斑马鱼模型中的BBB完整性提供了一种实用工具，且可适用于多种应用场景，包括疾病机制研究以及针对神经血管功能的治疗干预评估。

引言

血脑屏障（BBB）是一种具有选择性、半通透性的生理界面，主要由特化的脑微血管内皮细胞构成，并受到周细胞和星形胶质细胞的支持，可调控血液与脑组织间质之间的分子交换，从而维持中枢神经系统（CNS）的微环境稳定。其结构完整性对于维持中枢神经系统的稳态以及保护神经组织免受有害或毒性物质侵害至关重要¹。BBB的破坏是多种神经退行性疾病中公认的病理特征，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病以及肌萎缩侧索硬化症^2,3。当BBB功能受损时，通透性增加，导致神经毒性物质和炎症介质侵入脑组织，从而加剧疾病进展⁴。因此，评估BBB的完整性对于深入理解这些疾病的神经血管和炎症机制具有重要意义。

尽管啮齿类动物的体内模型和体外模型仍是血脑屏障（BBB）研究的金标准⁵，斑马鱼（Danio rerio）由于其基因可操作性强、成本低、操作简便，且在神经解剖结构和血脑屏障特性方面与哺乳动物高度保守，已成为神经科学领域有价值的脊椎动物模型⁶。尽管斑马鱼在神经退行性疾病研究中的应用日益广泛，目前仍缺乏评估成年斑马鱼血脑屏障完整性的有效方法

方案

本方案已获马来西亚国际伊斯兰大学（IIUM）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，参考动物伦理批准编号为：IIUM/504/14/2/IACUC。

1. 准备伊文思蓝染料储备液

1. 将0.1 g EB染料溶解于10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制1%（w/v）的储存液。充分混匀，直至染料完全溶解。
   注意：EB属于1B类致癌物。避免与皮肤和眼睛直接接触。使用防护服、手套、护目镜和防尘口罩。避免吸入粉尘，并遵循制造商提供的操作说明。不得将伊文思蓝染料（固体或溶液）倒入水槽。应将废弃物保存在贴有标签的原装容器中，并根据国家和地方危险废物管理规定进行处置。
2. 使用0.45 µm针头滤器过滤溶液，将滤液收集至无菌的15 mL离心管中。用铝箔包裹试管，并于4 °C保存。
   备注：也可使用更小孔径的滤器（如0.2 µm）。该储存液在4 °C下可保存最多两周，或在-20 °C下保存最多一个月；建议分装保存，以减少冷冻储存时反复冻融的次数。

2. 向成年斑马鱼施用伊文思蓝染料

1. 麻醉斑马鱼 通过 通过将水温从12 °C逐渐降低至7 °C，使鱼类不再对触觉刺激产生反应，从而实现低温休克。
   注意：可通过在数分钟内缓慢向水中加入少量碎冰来实现温....

结果

该方案已在帕金森病斑马鱼模型上进行测试。血脑屏障的受损在帕金森病患者中是一种有充分文献记载的现象。^16,17,18 以及在多种帕金森病动物模型中^19,20,21为研究成年斑马鱼帕金森病模型中血脑屏障（BBB）的完整性，比较了生理盐水注射（对照组）与帕金森病斑马鱼脑组织中伊文思蓝（EB）染料的外渗情况。成年斑马鱼帕金森病模型的建立方法如下： 通过 24小时前行血脑屏障评估前，按先前发表的方法腹腔注射一次MPTP（200 µg/g）¹⁴与此同时，生理盐水注射组经腹腔注射给予生理盐水（NS）。在正常生理条件下，伊文思蓝染料（EB）无法透过完整的血脑屏障（BBB）。¹¹

讨论

评估血脑屏障（BBB）的完整性对于理解脑部相关疾病的病理生理机制至关重要，因为受损的血脑屏障既可导致疾病发生，也可加剧疾病进展⁴。尽管成年斑马鱼已成为研究神经退行性疾病的有效模型，但针对该物种的血脑屏障完整性评估方法仍不完善⁸。本文所介绍的实验方案提供了一种简单且经济的方法，通过分析伊文思蓝（EB）染料从神经血管渗漏至脑组织的情况，来评估成年斑马鱼血脑屏障的通透性。该方法技术门槛低，仅需使用常规且廉价的实验材料，相较于依赖昂贵荧光示踪剂的其他方法更具优势。此外，该方法可提供定性与定量双重检测指标，使研究人员能够可靠地检测并表征斑马鱼疾病模型中的血脑屏障破坏情况。因此，该方法特别适用于资源有限但希望获得有意义血脑屏障数据的实验室。

正确进行腹腔注射EB染料对于确保染色的一致性和有效性至关重要；注射不准确可能导致结果出现差异。需要注意的是，雄性和雌性斑马鱼体型略有不同²²，雄鱼腹部较纤细，而雌鱼腹部更圆润，因此在进入腹腔的最佳注射位点上存在轻微.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖粉末	Vivantis	PC0701
伊文思蓝染料	Sigma-Aldrich	E2129
Fiji ImageJ	美国国立卫生研究院		下载链接: https://imagej.net/software/fiji/downloads
显微镜相机	深圳海亚电子有限公司	HY-500M
多聚甲醛（PFA）粉末	Sigma-Aldrich	158127
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4417
氯化钠（NaCl）	HmbG Chemicals	7647-14-5
体视显微镜	奥林巴斯公司	SZ40
注射器滤器单元，0.45µm	默克密理博	SLHV004SL