本文介绍了一种利用NgTET酶减少噬菌体DNA修饰的实验方案，可实现高效且无痕的CRISPR-Cas诱变。该方法有助于对噬菌体进行遗传改造，推动其在生物技术和噬菌体治疗中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
噬菌体是一类特异性靶向细菌宿主的病毒，在生物技术和医学领域具有重要应用潜力，尤其在应对多重耐药性感染方面。然而，噬菌体感染背后的分子机制在很大程度上仍未被充分研究。对噬菌体进行精确的位点特异性突变是阐明基因功能及噬菌体-宿主相互作用的有力工具。
然而，噬菌体基因组诱变的一个主要挑战是存在会干扰常规基因组编辑工具（如 CRISPR-Cas）的噬菌体 DNA 修饰。
尽管CRISPR-Cas系统已成功用于多种生物的靶向诱变，但其在噬菌体诱变中的有效性常受到DNA修饰（如胞嘧啶糖基化）的限制。为克服这一障碍，我们开发了一种高效方法，可暂时降低噬菌体DNA修饰的丰度，从而实现高效的CRISPR-Cas靶向并精确地将突变引入噬菌体基因组。具体而言，我们采用了源自Naegleria gruberi（NgTET）的Ten Eleven Translocation（TET）甲基胞嘧啶双加氧酶，该酶可在DNA中对甲基化和羟甲基化胞嘧啶进行逐级去修饰。通过氧化噬菌体DNA中的羟甲基化胞嘧啶，NgTET可阻止后续的胞嘧啶修饰（如糖基化），并显著提高Cas介导的DNA切割效率。
综上所述，本文介绍的无痕且精确的基因组编辑方法能够在维持噬菌体基因组天然基因结构的同时，高效地引入点突变。通过保持完整的转录和翻译框架，该方法最大限度地减少了对复杂调控网络的意外干扰。这对于研究必需或具有多种功能的噬菌体蛋白尤为重要。在不引入外源序列的情况下实现靶向遗传修饰的能力，显著拓展了噬菌体生物学的实验工具箱。该策略不仅有助于开展深入的功能研究，还增强了噬菌体在治疗和生物技术应用中进行理性设计与改造的潜力。
引言
噬菌体是一类特异性靶向细菌的病毒。由于其在生物技术和医学领域，特别是在对抗多重耐药细菌方面具有巨大潜力，噬菌体已引起广泛的研究关注1,2,3。尽管如此，噬菌体生物学的研究仍相对不足。要充分挖掘其治疗和生物技术应用潜力，深入理解噬菌体劫持细菌宿主的分子机制至关重要4。为了研究高效噬菌体感染背后的分子机制，并进一步对噬菌体进行工程化改造以用于特定应用，必须具备对噬菌体基因组进行遗传修饰的能力。然而，这仍是噬菌体生物学领域中最重大的挑战之一3,5,6。
噬菌体DNA通常通过嘌呤和嘧啶碱基的特定化学修饰而发生改变，例如胞嘧啶的糖基化和甲基化。这些修饰可保护噬菌体遗传物质不被宿主核酸酶识别和降解6。尽管这些修饰对噬菌体的适应性至关重要，但它们却对依赖DNA靶向系统的噬菌体基因组工程方法构成了重大障碍2,3<....
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方案
展示NgTET处理的T4噬菌体生成过程的示意图如图所示 图2.
图2：T4噬菌体诱变及突变体筛选工作流程的示意图。 该工作流程包括利用NgTET生成低修饰T4噬菌体，其有效性可通过LC-MS分析或CRISPR-Cas切割实验进行验证。随后，通过CRISPR-Cas介导的定点诱变将目标突变引入噬菌体基因组，并通过反向筛选进行鉴定。所需突变的存在可通过纳米孔测序进一步确认。验证后，可扩增突变噬菌体以恢复DNA的高修饰状态。这使得工程化噬菌体可用于后续应用，包括通过裂解实验和爆发量测定分析感染表型。图中每一步均以括号标注相应的实验方案编号，以便将实验步骤与图中对应部分关联。
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结果
梯度中噬菌体条带的鉴定。
梯度中噬菌体条带的可见性取决于加载到梯度上初始样品中的噬菌体浓度。当噬菌体浓度足够高时（~>1 × 1011 PFU/mL），可通过从底部用光源照射梯度来清晰观察到条带（见图3）。
然而，在噬菌体浓度较低时，条带可能不易观察。在此情况下，我们建议通过在暗处从试管底部照射光源，重新尝试观察，这有助于检测噬菌体的存在。
如果噬菌体条带仍然不可见，需使用钝头套管小心地从上层开始逐层收集梯度液，每份收集1.5 mL。随后可通过噬菌斑实验分析这些组分，以确定噬菌体浓度。应将噬菌体浓度最高的两份组分合并，用于后续的DNA提取。
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讨论
本研究提出了一种高效且可适应的策略，用于在噬菌体基因组中引入精确的点突变，包括单核苷酸改变。该实验流程的核心是在每个阶段整合严格的验证步骤，这对于确保基因组编辑的准确性和效率至关重要。鉴于该流程具有多步骤特性，以及噬菌体与其细菌宿主之间存在动态相互作用，这些因素引入了大量可能直接影响噬菌体诱变成功率的变量，因此验证尤为关键。这些因素包括但不限于：I）靶标DNA区域的可及性，II）CRISPR相关核酸酶的活性，III）在大肠杆菌（E. coli）宿主菌株中进行CRISPR-Cas介导诱变时供体DNA的稳定性，IV）由于自然选择或进化导致所需突变的丢失，以及V）噬菌体感染周期短暂所带来的时间限制。这些参数最终可能影响所述基因组编辑方法的整体效率。
下文将讨论这些潜在的影响因素，强调工作流程中的关键步骤，并提出可能的解决方案以应对这些挑战。
首个关键的验证步骤是立即验证 NgTET 处理后 DNA 去修饰的效果，可通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）或 CRISPR-Cas 切割实验实现。该步骤对于确认酶活性以及推.......
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披露
KH 和 NP 已为“噬菌体工程”提交欧洲专利申请，欧洲专利申请号为 23 175 257.7。其他作者声明无竞争利益。
致谢
该项目获得了德国研究基金会（DFG；SPP 2330 项目编号 464500427，RTG 2355 项目 11，以及 RTG 2937（项目编号 505997786））和马克斯·普朗克学会（授予 K.H. 的马克斯·普朗克研究组组长资助）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 反应管 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL 标准管 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 15 mL 开口薄壁聚丙烯管 | Beckman Coulter Life Sciences | 361706 | 16 mm x 95 mm（用于超速离心） |
| 50 mL 标准管 | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 5x GC 缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | F519L | |
| 6x TriTrack DNA 上样染料 | Thermo Fisher Scientific | R1161 | |
| 琼脂糖 | Meridian BIOSCIENCE | BIO-41025 | 分子级 |
| Avanti J-30I 离心机 | Beckman Coulter Life Sciences | 无目录 编号 | 序列号 JKY14M01，https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe |
| 硼酸 | Merck | 10043-35-3 | |
| BsaI-HF v2 | NEB | R3733S | |
| 六水合氯化钙 | ACROS ORGANICS | 7774-34-7 | 97%，特纯 |
| 细胞密度计 | Harvard Biochrom | 80211630 | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 12003154 | |
| 氯仿 | VWR | 650498 | |
| 比色皿 | Sarstedt | 67.742 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma Aldrich | D4540 | |
| 磷酸氢二钠 | neoFroxx GmbH | 7558-79-4 | 药用级 |
| 一次性玻璃巴斯德吸管 | VWR | 612-1702 | 230 mm |
| DNase I | Roche | 4716728001 | 10 U/µL |
| dNTP 混合液（每种 dNTP 10 mM） | Sigma-Aldrich | 72004 | |
| DS_SPcas_ModA | 内部产品。 | https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps | 包含 CRISPR-Cas12/ModA sgRNA 的质粒构建体 |
| DS-spCas（CRISPR-Cas9 系统） | Addgene | 48645（Addgene 附属编号） | 用于构建含间隔序列的 CRISPR-Cas 质粒（CRISPR-Cas9 系统）以进行噬菌体诱变（步骤 3.2） |
| 用于 T4 感染的大肠杆菌 B 菌株 | DSMZ | 无目录 编号 | 大肠杆菌（Migula 1895）Castellani 和 Chalmers 1919（DSM 613，ATCC 11303） |
| 大肠杆菌 BL21 (DE3) 表达菌株，感受态细胞 | Invitrogen | C600003 | 表达菌株，感受态细胞。 |
| 大肠杆菌 DH5α 克隆菌株，感受态细胞 | Invitrogen | 18265017 | 克隆菌株，感受态细胞。 |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| 乙醇（无水） | VWR | 200-578-6 | |
| Flongle 流动池 | Oxford Nanopore Technologies | 无目录 编号 | R10.4.1. 化学体系，https://nanoporetech.com/document/flongle |
| Gene JET 质粒小提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 10242490 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA 标准品 | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
| GeneRuler ULR DNA 标准品 | Thermo Fisher Scientific | SM1213 | |
| Gradient Master 108 | BIOCOMP | 无目录 编号 | https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming |
| Heraeus Pico 17 离心机 | Thermo Scientific | 75002410 | |
| Infors HT Minitron 摇床培养箱 | Infors AG | 无目录 编号 | https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Sigma-Aldrich | 367-93-1 | |
| 卡那霉素 | Carl Roth | T832.1 | |
| LB-琼脂 | Carl-Roth | X969.1 | |
| LB 培养基（Luria/Miller） | Carl-Roth | X968.1 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| MinION 设备 | Oxfrod Nanopore Technologies | 无目录 编号 | https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html |
| ModA E165A_fw | IDT | GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT | 用于引入 ModA E165A 点突变并产生黏性末端以进行 Golden Gate 克隆的正向引物（步骤 3.1） |
| ModA E165A_rev | IDT | CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC | 用于引入 ModA E165A 点突变并产生黏性末端以进行 Golden Gate 克隆的反向引物（步骤 3.1） |
| ModA_sgRNA_Cas12_fw | IDT | TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG | 用于生成 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 系统间隔序列以进行噬菌体诱变和反向筛选的正向引物（步骤 3.2 和步骤 4.1） |
| ModA_sgRNA_Cas12_rev | IDT | AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC | 用于生成 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 系统间隔序列以进行噬菌体诱变和反向筛选的反向引物（步骤 3.2 和步骤 4.1） |
| NanoDrop ND-1000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | AZY2019944 | |
| NucleoMag 试剂盒 | Machery Nagel | REF 744970.50 | |
| 核苷消化混合液 | New England Biolabs | M0649S | |
| pBA560（CRISPR-Cas13 系统） | Addgene | 186236（Addgene 附属编号） | 编码用于反向筛选的 CRISPR-Cas13 系统的质粒（步骤 4.1） |
| pCpfl-sp 质粒（CRISPR-Cas12 系统） | Addgene | 122186 | |
| pCpfl-sp 质粒（CRISPR-Cas12 系统） | Addgene | 122186（Addgene 附属编号） | 用于构建含间隔序列的 CRISPR-Cas 质粒（CRISPR-Cas12 系统）以进行噬菌体诱变（步骤 3.2） |
| PCR 反应管 | Sarstedt | 72.991.002 | |
| PeqGREEN | VWR | 732-3196 | |
| pET28a_NgTET | 内部产品。 | 无目录 编号 | 质粒可应要求提供，质粒图谱见 https://zenodo.org/records/10615143 |
| pET28a_NgTET | 内部产品。 | 无目录 编号 | 用于通过 Golden Gate 克隆构建 pET28a_NgTET_供体 DNA 的质粒（步骤 3.1），质粒 可应要求提供，质粒图谱见 https://zenodo.org/records/10615143 |
| 培养皿 | Sarstedt | 82.1473.001 | 92 x 16 mm，带卡扣 |
| Phusion DNA 聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F-530XL | 2 U/µL |
| 磷酸钾 | Sigma Aldrich | 7778-77-0 | 一碱式 |
| PowerPac 通用电源 | Bio Rad | 1645070 | |
| 蛋白酶 K | Carl Roth | 7528.1 | 100 mg/mL |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | QIAGEN | 28506 | |
| Quantus 荧光计，QuantiFluor dsDNA 系统 | Promega | E2670 | |
| RNase A/T1 | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | 混合液：2 mg/mL RNase A 与 5000 U/mL RNase T1 |
| 用于 DNA 提取的 Roti-Aqua P/C/I | Carl Roth | X985.1 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| SQK-LSK109 连接测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | 无目录 编号 | https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109 |
| 0.22 µm 孔径 Steritop 滤器 | Millipore | S2GPT05RE | 250 mL 和 500 mL |
| 链霉素 50 mg/L | Carl Roth | HP66.1 | |
| 蔗糖 | NeoFroxx GmbH | 57-50-1 | 分子生物学级 |
| 摆动式铝制转子 | Beckman Coulter Life Sciences | JS[1]24.15 | |
| T4 DNA 连接酶 5 U/µL | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 DNA 连接酶缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | B69 | |
| 试管，厚壁，无边 | Karl Hecht GmbH | 42775054 | 100 mm x 18 mm |
| 热循环仪，T100 | Biorad | 1861096 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | 77-86-1 | |
| 水浴锅，VWB2 | VWR | 462-0557 | 12 L 容量 |
参考文献
- Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
- Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R.
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