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利用NgTET辅助的CRISPR-Cas系统实现精确的噬菌体诱变

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DOI：

10.3791/69022

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2025年10月14日

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1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用NgTET酶减少噬菌体DNA修饰的实验方案，可实现高效且无痕的CRISPR-Cas诱变。该方法有助于对噬菌体进行遗传改造，推动其在生物技术和噬菌体治疗中的应用。

摘要

噬菌体是一类特异性靶向细菌宿主的病毒，在生物技术和医学领域具有重要应用潜力，尤其在应对多重耐药性感染方面。然而，噬菌体感染背后的分子机制在很大程度上仍未被充分研究。对噬菌体进行精确的位点特异性突变是阐明基因功能及噬菌体-宿主相互作用的有力工具。

然而，噬菌体基因组诱变的一个主要挑战是存在会干扰常规基因组编辑工具（如 CRISPR-Cas）的噬菌体 DNA 修饰。

尽管CRISPR-Cas系统已成功用于多种生物的靶向诱变，但其在噬菌体诱变中的有效性常受到DNA修饰（如胞嘧啶糖基化）的限制。为克服这一障碍，我们开发了一种高效方法，可暂时降低噬菌体DNA修饰的丰度，从而实现高效的CRISPR-Cas靶向并精确地将突变引入噬菌体基因组。具体而言，我们采用了源自Naegleria gruberi（NgTET）的Ten Eleven Translocation（TET）甲基胞嘧啶双加氧酶，该酶可在DNA中对甲基化和羟甲基化胞嘧啶进行逐级去修饰。通过氧化噬菌体DNA中的羟甲基化胞嘧啶，NgTET可阻止后续的胞嘧啶修饰（如糖基化），并显著提高Cas介导的DNA切割效率。

综上所述，本文介绍的无痕且精确的基因组编辑方法能够在维持噬菌体基因组天然基因结构的同时，高效地引入点突变。通过保持完整的转录和翻译框架，该方法最大限度地减少了对复杂调控网络的意外干扰。这对于研究必需或具有多种功能的噬菌体蛋白尤为重要。在不引入外源序列的情况下实现靶向遗传修饰的能力，显著拓展了噬菌体生物学的实验工具箱。该策略不仅有助于开展深入的功能研究，还增强了噬菌体在治疗和生物技术应用中进行理性设计与改造的潜力。

引言

噬菌体是一类特异性靶向细菌的病毒。由于其在生物技术和医学领域，特别是在对抗多重耐药细菌方面具有巨大潜力，噬菌体已引起广泛的研究关注1,2,3。尽管如此，噬菌体生物学的研究仍相对不足。要充分挖掘其治疗和生物技术应用潜力，深入理解噬菌体劫持细菌宿主的分子机制至关重要4。为了研究高效噬菌体感染背后的分子机制，并进一步对噬菌体进行工程化改造以用于特定应用，必须具备对噬菌体基因组进行遗传修饰的能力。然而，这仍是噬菌体生物学领域中最重大的挑战之一3,5,6。

噬菌体DNA通常通过嘌呤和嘧啶碱基的特定化学修饰而发生改变，例如胞嘧啶的糖基化和甲基化。这些修饰可保护噬菌体遗传物质不被宿主核酸酶识别和降解6。尽管这些修饰对噬菌体的适应性至关重要，但它们却对依赖DNA靶向系统的噬菌体基因组工程方法构成了重大障碍2,3,7。

现有的诱变策略，包括限制性修饰系统和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白（Cas）技术，在对噬菌体DNA进行修饰时面临重大挑战，原因在于存在如胞嘧啶糖基化等保护性表观遗传修饰8。CRISPR-Cas介导的基因组编辑在细菌和真核细胞中具有高度有效性，其依赖于两个关键步骤：首先由Cas核酸酶在基因组靶位点精确切割DNA，随后通过与携带目标突变的供体DNA进行同源重组实现DNA修复1。然而，在噬菌体中，DNA修饰通常会阻碍Cas核酸酶有效结合或切割基因组。此外，噬菌体复制过程快速且短暂，也可能进一步限制同源重组的效率。这些障碍使得将靶向DNA的CRISPR-Cas技术应用于噬菌体诱变尤为困难。已有研究证实，噬菌体DNA修饰可在体外（in vitro）和体内（in vivo）显著削弱CRISPR-Cas对噬菌体DNA的靶向能力6,7。

为应对噬菌体中保护性DNA修饰带来的挑战，我们提出一种基因组诱变策略，该策略利用十一种易位（ten-eleven translocation, TET）甲基胞嘧啶双加氧酶（特别是NgTET）的活性。在真核生物中，TET酶通过逐级氧化反应催化甲基化胞嘧啶的转化：甲基胞嘧啶（5mdC）首先被转化为羟甲基胞嘧啶（5hmdC），然后转化为甲酰基胞嘧啶（5fdC），最终转化为羧基胞嘧啶（5cadC）（图1）。

在我们的噬菌体诱变方法中，NgTET 用于暂时降低保护性 DNA 修饰的丰度，从而增强噬菌体 DNA 对基因组编辑工具（如 Cas 酶）的可及性9。选择 NgTET 来调控噬菌体基因组，是基于先前报道其在异源细菌宿主（尤其是 E. coli）中能够成功表达为有活性的可溶性蛋白。这一特性至关重要，因为 NgTET 必须在噬菌体感染过程中保持活性10。

TET双加氧酶介导的真核生物dC代谢；脱羧过程；化学结构示意图。
图1：TET双加氧酶对5-甲基胞嘧啶的逐步氧化1。 TET双加氧酶催化5-甲基-2′-脱氧胞苷（5mdC）依次氧化为5-羟甲基-2′-脱氧胞苷（5hmdC）、5-甲酰基-2′-脱氧胞苷（5fdC），最终生成5-羧基-2′-脱氧胞苷（5cadC）。终产物5cadC可通过非酶促或酶促途径回复为未修饰的胞苷（dC），从而参与动态的表观遗传调控。该多步反应过程在真核生物主动DNA去甲基化中起核心作用。请点击此处查看该图的放大版本。

由于甲基胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶是噬菌体DNA超修饰（包括糖基化等大体积保护性结构）的常见前体，因此可利用TET双加氧酶的氧化活性来阻止这些DNA超修饰的形成9。在基于TET的基因组诱变方法中，我们在E. coli中异源表达重组NgTET，以在噬菌体感染过程中氧化噬菌体基因组中的羟甲基胞嘧啶，从而阻止大体积糖基化的形成。通过降低这些大体积DNA修饰的丰度，该方法可提高噬菌体DNA对CRISPR-Cas核酸酶的可及性。这种增强的可及性有助于实现高效靶标识别、精确DNA切割，并在噬菌体基因组中引入无痕点突变，从而区别于依赖基因缺失、报告基因插入或人工连接子整合以进行基于PCR的突变体筛选的传统噬菌体诱变方法1,11。迄今为止，这些传统策略是噬菌体基因组靶向诱变唯一可用的工具，因此为本文所介绍的方法提供了重要基础。然而，单个噬菌体蛋白可能具有多种功能。删除编码目标蛋白的整个基因会破坏其所有相关功能。相比之下，靶向引入点突变可选择性地失活特定功能，从而实现对其作用的详细分析。目前，许多噬菌体蛋白的功能仍基本未被表征；因此，我们可能忽略了与特定基因相关的其他活性。因此，优先选择一种简约的方法，即仅去除单一功能，同时对整体蛋白造成最小程度的改变12,13。本文所述方法可在不破坏整体基因组结构或功能的前提下实现精确的遗传修饰。以往噬菌体诱变方法的另一主要挑战是效率低下，通常突变率仅为约0.1%1,11。通过本技术，我们提出了首个能够引入单密码子改变的诱变策略，实现了显著的七倍靶向效率提升。结合基于ONT的高通量筛选方法，点突变的检测得以简化，无需筛选大量噬菌体群体即可分离出单个突变体。本文所述的基于TET的诱变策略解决了该领域长期存在的局限性，实现了更可靠的基因组编辑14。

总体而言，该方法不仅可用于深入理解噬菌体感染机制，而且在合成生物学领域也具有重要意义。通过实现对噬菌体基因组的精确高效改造，该方法为定制化设计噬菌体以满足特定应用需求铺平了道路，从而增强了其在生物技术和医学应用中的潜力。

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方案

展示NgTET处理的T4噬菌体生成过程的示意图如图所示 图2.

使用LC-MS、CRISPR检测和纳米孔测序分析NgTET处理的T4噬菌体工作流程示意图。
图2：T4噬菌体诱变及突变体筛选工作流程的示意图。 该工作流程包括利用NgTET生成低修饰T4噬菌体，其有效性可通过LC-MS分析或CRISPR-Cas切割实验进行验证。随后，通过CRISPR-Cas介导的定点诱变将目标突变引入噬菌体基因组，并通过反向筛选进行鉴定。所需突变的存在可通过纳米孔测序进一步确认。验证后，可扩增突变噬菌体以恢复DNA的高修饰状态。这使得工程化噬菌体可用于后续应用，包括通过裂解实验和爆发量测定分析感染表型。图中每一步均以括号标注相应的实验方案编号，以便将实验步骤与图中对应部分关联。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 使用 NgTET 预处理减少噬菌体 DNA 修饰（约 2 天）

注意：此步骤对于在诱变过程中通过减少噬菌体DNA修饰的丰度来实现高效的Cas核酸酶靶向至关重要。

  1. 将含有 pET28a_NgTET 质粒的 E. coli BL21 (DE3) 菌株从甘油保存液中取出，接种至 10 mL 添加了 30 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中。在 37 °C、160 rpm 振荡条件下过夜培养。
  2. 次日，取过夜培养物接种主培养液，初始 OD600 调至 0.1，培养体系为 50 mL 含 30 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基。当 OD600 达到 0.4 时，加入 50 µM IPTG 诱导表达。
  3. 在 37 °C、160 rpm 振荡条件下继续培养，直至 OD600 达到 0.8。
  4. 以感染复数（MOI）为 0.1 的比例加入目标噬菌体，在室温下以 120 rpm 振荡培养 4 小时。
  5. 在 4 °C 条件下，以 4000 × g 离心 20 分钟收集菌体。
  6. 将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤，获得 DNA 低修饰的 NgTET 处理噬菌体。将过滤后的噬菌体置于 4 °C 保存以备后续使用。
    注：（暂停点）过滤后的噬菌体在 4 °C 下可稳定保存数月，应储存在玻璃瓶中的 LB 培养基内。

2. 验证

注意：此步骤的目的是实验验证噬菌体DNA修饰的丰度降低。

  1. 通过液相色谱-质谱法进行处理验证（约 2 天）
    1. 通过蔗糖梯度纯化噬菌体
      1. 为去除裂解液中的残留核酸，向 500 µL 噬菌体悬液（>1010 PFU/mL）中加入 20 U DNase I 和 2 µL RNase A/T1 混合液（含 4 µg RNase A 和 10 U RNase T1）。
      2. 在 37 °C 下孵育混合物 30 分钟。
      3. 在 TM 缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 7.5）中制备 0–45% 的蔗糖梯度。可使用梯度混合器或手动制备。
        注：手动制备时，先用移液器将 5 mL TM 缓冲液加入梯度管中。然后使用钝端套管从管底缓慢加入 5 mL 45% 蔗糖溶液，使 0% 溶液逐渐上升。
      4. 将 500 µL 处理后的噬菌体溶液加至梯度顶部。
      5. 在 4 °C 下以 70,000 × g 离心 20 分钟。
      6. 从底部照亮离心管，可观察到噬菌体在梯度中呈现浑浊条带。使用钝端套管小心吸取含噬菌体的组分。
      7. 将提取的噬菌体组分转移至新的超速离心管中。
      8. 加入 30 mL 冰冷的 TM 缓冲液，并在 4 °C 下以 100,000 × g 离心 1 小时。
      9. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL TM 缓冲液中。
      10. 将重悬的噬菌体于 4 °C 在玻璃小瓶中过夜保存。
    2. 噬菌体 DNA 提取
      1. 向重悬的噬菌体中加入 1 µg 蛋白酶 K。
      2. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。
      3. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/I）混合液。通过倒置混匀。在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 1 分钟以分离相层。将水相转移至新的反应管中。重复提取三次。
        警告：苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/I）具有高度毒性、腐蚀性和挥发性。务必在通风橱内操作，并穿戴适当的防护装备，包括实验服、护目镜和双层腈手套。避免接触皮肤和眼睛，并将试剂储存在密封容器中，置于指定的化学品柜内。废液应通过批准的危险废物通道处理。如发生接触，应立即用水冲洗并寻求医疗帮助。
      4. 为去除残留苯酚，使用等体积氯仿进行三次反向氯仿提取。
      5. 在 -20 °C 下，加入 0.1 倍体积的 3 M NaOAc（pH 5.5）和 2.5 倍体积的乙醇，过夜沉淀 DNA。
      6. 次日，在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 1 小时，收集 DNA 沉淀。
      7. 用 200 µL 70% 乙醇轻轻振荡洗涤 DNA 沉淀两次，每次在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 15 分钟，并小心弃去上清液。
      8. 将纯化的 DNA 重悬于超纯水中。
      9. 将 DNA 储存于 -20 °C，以备后续使用。
        注：（暂停点）沉淀的 DNA 可在 -20 °C 下保存数月。
    3. 为液相色谱-质谱分析准备噬菌体 DNA
      1. 使用核苷消化混合液将纯化的 DNA 消化为单个核苷。
      2. 通过液相色谱-质谱法分析 DNA 组成。
        注：此步骤可用于验证 NgTET 处理的有效性。该方案可根据实验室现有的设备和色谱柱进行调整，也可根据可用资源和条件进行优化。
      3. 使用从纯化噬菌体中提取的消化后 DNA（步骤 2.1.10）。
      4. 检测时应包括以下市售标准品：dA、dT、dG、dC、5hmdC、5fdC、5cadC。如有条件，应加入噬菌体 DNA 上存在的胞嘧啶超修饰标准品。
      5. 使用配备 C18 色谱柱（150 × 2.1 mm，100 Å，3 µm）和 20 × 2.1 mm 保护柱的高效液相色谱系统。
      6. 设置柱温为 40 °C，流动相流速为 0.2 mL/min。
      7. 按如下方式配制流动相：
        流动相 A：10 mM 醋酸铵水溶液（pH 4.5）。
        流动相 B：含 0.1% 甲酸的甲醇。
        ​警告：含 0.1% 甲酸的甲醇具有可燃性，可能刺激皮肤、眼睛和呼吸道。务必在通风良好区域或通风橱中使用。穿戴适当的防护装备，包括实验服、护目镜和腈手套。远离热源、火花和明火。储存于易燃品专用柜中。废液应通过批准的危险废物处理程序处置。
      8. 采用以下流动相程序：0–1 分钟：保持 5% B；1–5 分钟：从 5% B 梯度升至 90% B；5–7 分钟：保持 90% B；7–7.1 分钟：从 90% B 梯度降至 5% B；7.1–12 分钟：保持 5% B。
      9. 使用配备高温电喷雾电离（H-ESI）源的质谱仪，在负离子和正离子模式下分别进样，设置条件如下：
        H-ESI 喷雾电压：3400 V（+），2400 V（-）；鞘气：35 任意单位；辅助气：7 任意单位；吹扫气：0 任意单位；离子传输管温度：300 °C；汽化器温度：275 °C；检测模式：使用 Orbitrap 质量分析器进行全扫描；质量分辨率：120,000；质量范围：200–450（m/z）。
      10. 使用 Tracefinder 软件提取 [M-H]-（dA、dT、dC、5hmdC、5fdC、5cadC）和 [M+H]+（5ghmdC）形式的离子色谱图。
      11. 以 dG 峰面积作为样品特异性内标，将各修饰峰面积归一化至 dG 峰面积，计算每种修饰的相对丰度。
  2. 通过 CRISPR-Cas 切割实验进行验证（约 2.5 天）
    注：此步骤可用于表型评估 NgTET 处理的成功程度及其对 CRISPR-Cas 切割的影响。若 NgTET 具有活性，则处理后的噬菌体 DNA 不应形成噬菌斑，或噬菌体滴度应降低，因为保护性 DNA 修饰的去除使基因组对 CRISPR-Cas12 或 Cas9 切割敏感。相反，若噬菌体 DNA 未经处理，则形成的噬菌斑数量将对应于噬菌体滴度，表明超修饰的 T4 噬菌体基因组对 CRISPR-Cas12 或 Cas9 切割具有抗性。
    1. 接种过夜培养的 E. coli BL21 (DE3) 菌株，该菌株同时转化了 pET28a_NgTET 质粒和 Cas12 或 Cas9 表达质粒（例如 DS-spCas 或无间隔序列的 pCpf1）。所有质粒及其附加信息见表 1。
      1. 在含适当抗生素的 LB 培养基中，从 OD600 为 0.1 开始，于 3 °C 摇床培养。当菌液 OD600 达到约 0.4 时，加入 0.05 mM IPTG 诱导 NgTET 表达，并在 3 °C 继续孵育 2 小时。
      2. 作为对照，比较有无 NgTET 过表达的 E. coli BL21 (DE3) 菌株。在缺乏 NgTET 活性的情况下，预期噬菌斑形成单位数量更高，表明由于噬菌体 DNA 中存在糖基化 5ghmdC，CRISPR-Cas 的切割效率降低。
    2. 将 300 µL E. coli 培养物转移至无菌试管中。
    3. 以 MOI 0.01 感染 T4 WT 或经 NgTET 处理的噬菌体。本实验采用低 MOI，以确保细菌每次仅被一个噬菌体感染。这可最大化 CRISPR-Cas 切割筛选的效率，并简化结果解读。轻轻混匀以确保噬菌体均匀分布。
    4. 将细菌-噬菌体悬液在 37 °C 下孵育 7 分钟。
    5. 将细菌-噬菌体混合物加入 4 mL 含抗生素的 LB 软琼脂（0.75%）中。充分但轻柔地混匀，避免产生气泡。
    6. 将软琼脂混合物倒入预热的 LB 琼脂平板上。
    7. 在室温下短暂静置使平板凝固，随后在 37 °C 下过夜培养。
    8. 次日计数形成的噬菌斑，以确定噬菌斑形成单位（PFU）。

3. CRISPR-Cas 诱变（约 1 周）

注意：CRISPR-Cas 诱变的原理是在噬菌体感染过程中，Cas 核酸酶靶向噬菌体基因组中的特定位点，导致双链断裂。该断裂通过同源重组进行修复，修复所需的供体 DNA 由存在于感染宿主菌株中的第二个质粒提供。携带供体 DNA 的质粒还编码 NgTET，如前所述，NgTET 对于维持噬菌体 DNA 对 Cas 核酸酶的可及性至关重要，其作用是减少修饰胞嘧啶的丰度。在此步骤中，当 NgTET 处理的 T4 噬菌体感染 E. coli15 时，目标突变被引入 T4 噬菌体基因组。为确保 T4 基因组中 DNA 修饰水平持续保持在较低状态，在整个诱变过程中通过添加 50 µM IPTG（类似于步骤 1.2）来诱导表达 NgTET 双加氧酶。

  1. 通过黄金门克隆技术构建pET28a_NgTET_供体DNA质粒15
    1. 为构建供体DNA，可订购所需序列作为完整基因，或从基因组（例如噬菌体基因组）中扩增，并引入所需的突变。
      注意：设计供体DNA时，应在靶位点两侧包含同源区域（点突变时每侧约200 bp；较大插入片段则需要更长的同源臂）。线性供体片段应携带BsaI识别位点，使其在切割后产生与质粒兼容的黏性末端。建议进行in silico（计算机模拟）克隆以验证构建设计。在代表性结果中，将通过一个示例展示供体DNA的所有关键组分。
    2. 使用黄金门组装方法，将供体DNA片段插入pET28a_NgTET骨架中NgTET编码序列及其终止子的下游。
      1. 准备连接反应体系：将70 fmol的pET28a_NgTET质粒、140 fmol的供体DNA插入片段、1 µL BsaI（20 U/µL）、5 U T4 DNA连接酶和2 µL 10×连接酶缓冲液混合，并用无核酸酶水补足至终体积20 µL。
      2. 在PCR仪中运行25个循环，程序设置如下：1）限制性酶切，37 °C孵育1.5分钟；2）连接反应，16 °C孵育3分钟；3）最终酶切，37 °C孵育5分钟；4）变性，60 °C孵育10分钟。
    3. 取6 µL上述反应混合物（来自步骤3.1.2），加入100 µL化学感受态E. coli DH5α中，冰上孵育10分钟，42 °C热激45秒。立即放回冰上1分钟，然后加入750 µL LB培养基。37 °C、500 rpm振荡培养1小时进行复苏。涂布于含卡那霉素（30 µg/mL）的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
    4. 挑取单菌落接种至20 mL含卡那霉素（30 µg/mL）的LB培养基中，37 °C、160 rpm振荡过夜培养。
    5. 取5 mL过夜培养物，离心收集菌体，采用标准质粒提取方法提取质粒DNA。用40 µL无核酸酶水洗脱质粒。
    6. 通过Sanger测序对质粒的插入位点进行测序，以确认克隆正确。
  2. 含间隔序列的CRISPR-Cas质粒构建（以pCpf1-sp为例）15
    注意：本章节所述质粒可通过在噬菌体基因组中引入特异性双链断裂，实现突变的第一步。虽然本实验以CRISPR-Cas12系统（pCpfl-sp质粒）为例进行演示，但也可使用其他核酸酶，如CRISPR-Cas9（DS-spCas质粒）15。
    1. 设计一段20 nt的间隔序列以靶向突变位点（PAM序列为TTTV）。使用生物信息学工具识别并设计合适的原间隔序列及其对应的间隔序列。
    2. 合成两条5′端磷酸化的寡核苷酸。确保每条包含10 nt的目标间隔序列（两条合起来形成完整的20 nt间隔序列），并额外包含10 nt与pCpf1-sp质粒插入位点互补的区域。
    3. 使用步骤2中的引物，通过PCR扩增将设计好的CRISPR-Cas间隔序列插入pCpf1-sp质粒。反应体系如下（终体积50 µL）：5 µL 10× GC缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL正向引物（10 µM）、1 µL反向引物（10 µM）、2.5 µL DMSO、对应2 fmol的质粒模板、1 µL Phusion DNA聚合酶（2 U/µL），并用无核酸酶水补足至50 µL。
    4. 将反应管放入热循环仪，运行以下程序：98 °C预变性30秒；25个循环（98 °C变性10秒，退火温度X °C保持30秒，72 °C延伸6分钟）；72 °C最终延伸10分钟。完成后将样品置于4 °C保存，待后续处理。
    5. 取5 µL PCR产物与DNA上样缓冲液（10×）混合，加载至1%琼脂糖凝胶。130 V电泳20分钟，通过紫外透射成像观察DNA条带。若扩增成功，使用合适的纯化试剂盒纯化PCR产物，并用20 µL无核酸酶水洗脱。
    6. 将100 ng扩增产物与1× T4 DNA连接酶缓冲液及60 U T4 DNA连接酶混合，总体积15 µL，室温孵育1小时以完成质粒环化。将连接产物转化至100 µL化学感受态E. coli，操作参照步骤3.1.3。涂布于含50 µg/mL链霉素的LB琼脂平板，37 °C过夜培养。
    7. 从平板上挑取单菌落接种至20 mL含50 µg/mL链霉素的LB培养基中，37 °C、160 rpm振荡过夜培养。取5 mL过夜培养物，离心收集菌体，采用任意质粒提取方法提取质粒DNA。用40 µL无核酸酶水洗脱质粒。
    8. 通过Sanger测序对插入位点进行测序，以确认克隆成功。
  3. 噬菌体突变
    1. 将两种质粒共转化至E. coli BL21 (DE3)细胞中：pET28a_NgTET_供体-DNA和pCpf1-sp（Cas12）/DS-SPcas（Cas9）间隔序列（分别由步骤3.1和3.2构建）。将每种质粒各1 µL与100 µL化学感受态E. coli BL21 (DE3)混合，按步骤3.1.3所述方法操作。将转化后的细胞涂布于含50 µg/mL链霉素和30 µg/mL卡那霉素的琼脂平板上，37 °C过夜培养。
    2. 将转化后的E. coli菌株（E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_供体-DNA 和 pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_间隔序列）接种至10 mL含30 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL链霉素的LB培养基中，37 °C、160 rpm振荡过夜培养。
    3. 次日，将过夜培养物用含30 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL链霉素的LB培养基稀释至初始OD600为0.1，总体积50 mL。
    4. 37 °C、160 rpm振荡培养，直至OD600达到0.8。随后将温度降至室温（RT），摇床转速降至130 rpm。
      1. 为增强噬菌体吸附及DNA注入，加入MgCl2和CaCl2，使其终浓度均为1 mM，这些二价阳离子有助于高效的噬菌体-宿主相互作用。
      2. 以MOI为0.1的NgTET预处理T4噬菌体感染培养物，同时以未用NgTET处理的T4噬菌体作为阴性对照。继续在室温下孵育4小时。
    5. 孵育结束后，将培养物转移至50 mL锥形管中，4 °C、4000 × g离心20分钟以收集菌体。将上清液通过0.45 µm滤膜过滤，以去除残留的细菌细胞。将滤过的上清液用于噬斑实验（见步骤2.2）测定噬菌体浓度，或进行反向筛选。

4. 突变体鉴定

注意：反向筛选的目的是降低在诱变后群体中残留的野生型噬菌体比例。为此，将来自诱变步骤（步骤 3.3）获得的噬菌体用于感染携带相同 CRISPR-Cas13 系统的大肠杆菌（E. coli），该系统由另一个质粒 pBA560 编码（详见表 1），并含有在诱变过程中使用的相同间隔序列。在此体系中，Cas 核酸酶可特异性识别并切割野生型噬菌体 DNA，而携带目标突变的噬菌体则不受影响。这种选择性压力抑制了野生型噬菌体的复制，从而富集了突变型噬菌体群体14。

  1. 利用Cas13进行反向筛选
    1. 感染 E. coli Cas13a间隔序列（质粒pBA560）与噬菌体共同用于反向筛选。该步骤通过降解未发生预期突变的噬菌体RNA，实现反向筛选。
    2. 在与诱变过程中相同的条件下进行反向筛选（参见步骤 3.3.1–3.3.5）。使用 E. coli 表达非靶向性Cas13a间隔序列作为阴性对照，以确认噬斑减少具有间隔序列特异性。
    3. 孵育后，将含有反向筛选噬菌体的上清液通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细菌碎片。
      注意：（暂停点）过滤后的噬菌体在4 °C下保存于玻璃瓶中的LB培养基中，可保持数月稳定。
    4. 使用经反向筛选和过滤的噬菌体在琼脂平板上进行噬斑实验 E. coli B型菌株以分离单个噬菌斑用于后续验证。
  2. 下一代测序（约 1 周）
    注意：高度多重测序方法包含两步PCR流程，用于生成适用于长读长二代测序的多重扩增子DNA16.
    1. 通过步骤2.2中所述的涂布方法将噬菌体与诱变产物分离。设置适当的对照，使用在表达NgTET和不表达NgTET条件下进行诱变所获得的噬菌体。作为对照，CRISPR-Cas9和Cas12在无NgTET存在时的靶向作用不应导致点突变的引入；相反，共表达NgTET应能够实现有效的编辑，从而获得更高的诱变效率。
    2. 为分离单个噬菌体，从平板上挑取单个噬斑，转移至含有100 µL Pi-Mg缓冲液（26 mM Na2PHO4，68 mM NaCl，22 mM KH2PO4，1 mM MgSO₄4，pH 7.5）和 1 µL CHCl3.
      警告：氯仿具有毒性、易挥发，且可能具有致癌性，即使少量使用也需谨慎。仅可在通风橱中操作，并穿戴全套防护装备，包括实验服、护目镜和丁腈手套。避免吸入和皮肤接触。氯仿应储存于密闭容器中，并置于通风良好的易燃化学品柜内。氯仿废液须通过危险废物收集系统进行处理。
    3. 使用1 µL溶于Pi-Mg缓冲液中的T4噬菌体作为筛选模板。
    4. 使用0.125 µM的每种引物（位于插入位点附近）和1×高保真聚合酶预混液配制反应体系，将扩增反应总体积调整至10 µL。进行30个循环的PCR扩增反应。
    5. 进行第二次PCR以连接条形码。因此，使用1 µL第一次PCR产物的1:10稀释液作为模板。
    6. 在总体积为 7 µL 的反应体系中加入 0.3 µM 条形码引物和高保真热启动聚合酶混合液。进行 20 个循环的 PCR 扩增。
      注意：（暂停点）PCR产物可在-20 °C保存数周。
    7. 将所有带条形码的PCR产物混合，并根据下一代测序文库构建的标准操作流程，使用磁珠法进行纯化。
    8. 使用磁珠捕获DNA，用80%乙醇洗涤两次，然后在100 µL洗脱缓冲液（5 mM Tris-HCl，pH 8.5）中洗脱。
    9. 使用分光光度法和荧光法测定DNA浓度，根据需要选择宽范围或高灵敏度检测方法。
      注意：（暂停点）DNA 可在 -20 °C 下保存数周。
    10. 根据制造商说明书，使用基于连接的方案，从1 µg输入DNA开始构建测序文库。

5. 突变体扩增以回收DNA修饰并进行验证

注意：一旦鉴定出所需噬菌体突变体，便在野生型 E. coli 中进行扩增，以恢复与野生型噬菌体相似的DNA修饰水平。这可确保除引入的突变外，突变噬菌体在后续生物学实验中的使用不受任何影响。

  1. 制备10 mL培养液 E. coli B型菌株在LB培养基中培养，37 °C、160 rpm振荡过夜培养。
  2. 次日，取过夜培养物接种于50 mL新鲜LB培养基中，使初始OD600 0.1 的
  3. 在37 °C、160 rpm振荡培养至OD值达到规定范围600 0.8
  4. 加入50 µL突变噬菌体储备液（4.2.2）至培养物中。小心移除相层，避免转移CHCl3.
  5. 在室温下以120 rpm的转速轻轻振荡培养感染的细胞过夜。
  6. 孵育后，将培养物在4000 × g 去除细菌细胞。将上清液通过0.45 µm滤膜过滤，以收集噬菌体。
  7. 将过滤后的突变噬菌体转移至玻璃容器中，4 °C 保存备用。
    注意：（暂停点）过滤后的噬菌体在4 °C下保存于玻璃瓶中的LB培养基中，可保持数月稳定。
  8. 作为DNA修饰（特别是糖基化胞嘧啶）再生的可选验证方法，按照步骤2.1所述进行LC-MS分析。
    1. 为此，按照步骤 2.1.1 所述纯化回收的子代噬菌体 DNA，按步骤 2.1.2 进行分离，随后按照步骤 2.1.3 所述制备用于 LC-MS 分析的样品。
    2. 分析离子色谱图，通过将各样品中各信号峰面积相对于该样品内的dG峰面积进行归一化，计算每种修饰的相对丰度，以dG作为样品特异性的内标，具体操作如步骤2.1.3所述。
      注意：建议包括T4野生型噬菌体、经NgTET处理的T4噬菌体以及经无活性NgTET D234A变体处理的T4噬菌体作为对照，以直接验证并比较5ghmdC的丰度10.

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结果

梯度中噬菌体条带的鉴定。
梯度中噬菌体条带的可见性取决于加载到梯度上初始样品中的噬菌体浓度。当噬菌体浓度足够高时（~>1 × 1011 PFU/mL），可通过从底部用光源照射梯度来清晰观察到条带（见图3）。

然而，在噬菌体浓度较低时，条带可能不易观察。在此情况下，我们建议通过在暗处从试管底部照射光源，重新尝试观察，这有助于检测噬菌体的存在。

如果噬菌体条带仍然不可见，需使用钝头套管小心地从上层开始逐层收集梯度液，每份收集1.5 mL。随后可通过噬菌斑实验分析这些组分，以确定噬菌体浓度。应将噬菌体浓度最高的两份组分合并，用于后续的DNA提取。

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讨论

本研究提出了一种高效且可适应的策略，用于在噬菌体基因组中引入精确的点突变，包括单核苷酸改变。该实验流程的核心是在每个阶段整合严格的验证步骤，这对于确保基因组编辑的准确性和效率至关重要。鉴于该流程具有多步骤特性，以及噬菌体与其细菌宿主之间存在动态相互作用，这些因素引入了大量可能直接影响噬菌体诱变成功率的变量，因此验证尤为关键。这些因素包括但不限于：I）靶标DNA区域的可及性，II）CRISPR相关核酸酶的活性，III）在大肠杆菌（E. coli）宿主菌株中进行CRISPR-Cas介导诱变时供体DNA的稳定性，IV）由于自然选择或进化导致所需突变的丢失，以及V）噬菌体感染周期短暂所带来的时间限制。这些参数最终可能影响所述基因组编辑方法的整体效率。

下文将讨论这些潜在的影响因素，强调工作流程中的关键步骤，并提出可能的解决方案以应对这些挑战。

首个关键的验证步骤是立即验证 NgTET 处理后 DNA 去修饰的效果，可通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）或 CRISPR-Cas 切割实验实现。该步骤对于确认酶活性以及推...

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披露

KH 和 NP 已为“噬菌体工程”提交欧洲专利申请，欧洲专利申请号为 23 175 257.7。其他作者声明无竞争利益。

致谢

该项目获得了德国研究基金会（DFG；SPP 2330 项目编号 464500427，RTG 2355 项目 11，以及 RTG 2937（项目编号 505997786））和马克斯·普朗克学会（授予 K.H. 的马克斯·普朗克研究组组长资助）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 反应管Sarstedt72.690.001
15 mL 标准管Sarstedt62.554.502
15 mL 开口薄壁聚丙烯管Beckman Coulter Life Sciences36170616 mm x 95 mm（用于超速离心）
50 mL 标准管Sarstedt62.547.254
5x GC 缓冲液Thermo Fisher Scientific F519L
6x TriTrack DNA 上样染料 Thermo Fisher Scientific R1161
琼脂糖Meridian BIOSCIENCEBIO-41025分子级
Avanti J-30I 离心机Beckman Coulter Life Sciences无目录 编号序列号 JKY14M01，https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
硼酸 Merck10043-35-3
BsaI-HF v2NEBR3733S
六水合氯化钙ACROS ORGANICS7774-34-797%，特纯 
细胞密度计Harvard Biochrom 80211630
ChemiDoc MP Biorad12003154
氯仿VWR650498
比色皿Sarstedt67.742
二甲基亚砜（DMSO） Sigma AldrichD4540
磷酸氢二钠neoFroxx GmbH7558-79-4药用级
一次性玻璃巴斯德吸管VWR612-1702230 mm
DNase I Roche471672800110 U/µL
dNTP 混合液（每种 dNTP 10 mM） Sigma-Aldrich72004
DS_SPcas_ModA内部产品。https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps包含 CRISPR-Cas12/ModA sgRNA 的质粒构建体
DS-spCas（CRISPR-Cas9 系统）Addgene 48645（Addgene 附属编号）用于构建含间隔序列的 CRISPR-Cas 质粒（CRISPR-Cas9 系统）以进行噬菌体诱变（步骤 3.2）
用于 T4 感染的大肠杆菌 B 菌株DSMZ无目录 编号大肠杆菌（Migula 1895）Castellani 和 Chalmers 1919（DSM 613，ATCC 11303）
大肠杆菌 BL21 (DE3) 表达菌株，感受态细胞InvitrogenC600003表达菌株，感受态细胞。
大肠杆菌 DH5α 克隆菌株，感受态细胞Invitrogen18265017克隆菌株，感受态细胞。 
EDTARoth8043.2
乙醇（无水） VWR200-578-6
Flongle 流动池Oxford Nanopore Technologies无目录 编号R10.4.1. 化学体系，https://nanoporetech.com/document/flongle
Gene JET 质粒小提试剂盒 Thermo Fisher Scientific 10242490
GeneRuler 1 kb Plus DNA 标准品Thermo Fisher Scientific SM1331
GeneRuler ULR DNA 标准品 Thermo Fisher Scientific SM1213
Gradient Master 108BIOCOMP无目录 编号https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Heraeus Pico 17 离心机Thermo Scientific75002410
Infors HT Minitron 摇床培养箱Infors AG无目录 编号https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Sigma-Aldrich367-93-1
卡那霉素Carl RothT832.1
LB-琼脂Carl-RothX969.1
LB 培养基（Luria/Miller） Carl-RothX968.1
六水合氯化镁 Sigma-Aldrich7791-18-6
硫酸镁 Sigma-Aldrich7487-88-9
MinION 设备 Oxfrod Nanopore Technologies无目录 编号https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		用于引入 ModA E165A 点突变并产生黏性末端以进行 Golden Gate 克隆的正向引物（步骤 3.1）
ModA E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		用于引入 ModA E165A 点突变并产生黏性末端以进行 Golden Gate 克隆的反向引物（步骤 3.1）
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		用于生成 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 系统间隔序列以进行噬菌体诱变和反向筛选的正向引物（步骤 3.2 和步骤 4.1）
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		用于生成 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 系统间隔序列以进行噬菌体诱变和反向筛选的反向引物（步骤 3.2 和步骤 4.1）
NanoDrop ND-1000 分光光度计 Thermo Fisher ScientificAZY2019944
NucleoMag 试剂盒 Machery NagelREF 744970.50
核苷消化混合液 New England BiolabsM0649S
pBA560（CRISPR-Cas13 系统）Addgene186236（Addgene 附属编号）编码用于反向筛选的 CRISPR-Cas13 系统的质粒（步骤 4.1）
pCpfl-sp 质粒（CRISPR-Cas12 系统）Addgene122186
pCpfl-sp 质粒（CRISPR-Cas12 系统）Addgene122186（Addgene 附属编号）用于构建含间隔序列的 CRISPR-Cas 质粒（CRISPR-Cas12 系统）以进行噬菌体诱变（步骤 3.2）
PCR 反应管Sarstedt72.991.002
PeqGREENVWR732-3196
pET28a_NgTET 内部产品。无目录 编号质粒可应要求提供，质粒图谱见 https://zenodo.org/records/10615143 
pET28a_NgTET 内部产品。无目录 编号用于通过 Golden Gate 克隆构建 pET28a_NgTET_供体 DNA 的质粒（步骤 3.1），质粒 可应要求提供，质粒图谱见 https://zenodo.org/records/10615143 
培养皿Sarstedt82.1473.00192 x 16 mm，带卡扣
Phusion DNA 聚合酶 Thermo Fisher Scientific F-530XL2 U/µL
磷酸钾Sigma Aldrich7778-77-0一碱式
PowerPac 通用电源Bio Rad1645070
蛋白酶 K Carl Roth 7528.1100 mg/mL
QIAquick PCR 纯化试剂盒 QIAGEN28506
Quantus 荧光计，QuantiFluor dsDNA 系统PromegaE2670
RNase A/T1 Thermo Fisher ScientificEN0551混合液：2 mg/mL RNase A 与 5000 U/mL RNase T1 
用于 DNA 提取的 Roti-Aqua P/C/I Carl RothX985.1
乙酸钠 Sigma-Aldrich127-09-3
氯化钠 Sigma-Aldrich7647-14-5
SQK-LSK109 连接测序试剂盒Oxford Nanopore Technologies无目录 编号https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
0.22 µm 孔径 Steritop 滤器MilliporeS2GPT05RE250 mL 和 500 mL
链霉素 50 mg/LCarl RothHP66.1
蔗糖NeoFroxx GmbH57-50-1分子生物学级 
摆动式铝制转子 Beckman Coulter Life SciencesJS[1]24.15
T4 DNA 连接酶 5 U/µLThermo Fisher Scientific EL0011
T4 DNA 连接酶缓冲液Thermo Fisher Scientific B69
试管，厚壁，无边Karl Hecht GmbH42775054100 mm x 18 mm
热循环仪，T100Biorad1861096
Thermomixer comfort Eppendorf5382000015
Trizma BaseSigma Aldrich77-86-1
水浴锅，VWB2 VWR462-055712 L 容量

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NgTET DNA T4

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