利用高通量方法评估叶片对微生物次级代谢产物的响应

摘要

本方案描述了一种高通量方法，可用于同一样本中植物离子渗漏、过氧化物酶活性和胼胝质生成的评估。

摘要

微生物在侵染植物期间会分泌结构多样的次级代谢产物，其中一些产物可被植物细胞识别，从而触发植物的应激反应。本方法可在同一样本的叶片圆片中同时检测离子渗漏、过氧化物酶活性以及胼胝质的积累。首先，将拟南芥或大麦的叶片圆片置于96孔板中进行真空渗透处理。处理4–6小时后测定电导率，24小时后测定过氧化物酶活性和胼胝质沉积。flg22多肽可诱导上述三种反应，是一种经济有效的阳性对照。环脂肽表面活性素（surfactin）和gramillin分别诱导过氧化物酶活性和离子渗漏，而植物毒素T-2单端孢烯则抑制过氧化物酶活性。总体而言，该方法可用于比较不同植物基因型或不同代谢物处理条件下的反应差异。该方法可应用于化学生物学或生物防护研究，以鉴定可调节植物应激反应的化合物，供后续深入研究。在植物遗传学研究中，该方法可用于比较不同植物群体的反应差异，辅助遗传定位分析，从而加深对植物-微生物互作机制的理解。

引言

植物通过响应多种微生物分子来激活细胞应激反应，从而可能产生抗病性。微生物相关分子模式（MAMPs），例如来自细菌鞭毛蛋白的flg22肽，可被植物受体蛋白识别，进而启动一系列细胞信号转导反应。这些反应包括早期响应，如激酶级联反应、活性氧（ROS）的产生、钙离子振荡、膜去极化，以及晚期响应，如胼胝质沉积和过氧化物酶活性的诱导¹。微生物次级代谢产物（MSMs）是一类分子量较小（50–1,500 道尔顿）、结构多样的化合物，虽非微生物生长和发育所必需，但有助于其生存。某些MSM可在植物中诱导细胞应激反应，但引发这些反应的具体机制尚不明确^2,3。目前提出的植物识别MSM的机制包括机械感应、氧化还原诱导的蛋白质修饰或脂质介导的信号通路^4,5。在某些情况下，MSM诱导的应激反应或造成的细胞损伤依赖于其浓度。例如，T-2毒素在1 µM时可诱导胼胝质和ROS的产生，而在10 µM时则导致细胞死亡，通常被描述为一种植物毒素⁴。MSM在某些植物-微生物互作中影响致病过程，可能诱发植物感病性或抗性。例如，gramillin环脂肽可诱导ROS产生、离子渗漏和胼胝质沉积，同时增强大麦对Fusarium graminearum的感病性²。丁香假单胞菌产生的syringomycin和syringopeptin环脂肽可诱导植物产生ROS，并促进对Pseudomonas fluorescens细菌的寄主抗性³。其他MSM，如表面活性素（surfactin）和伊枯草菌素（iturin），由非致病性微生物产生，可通过诱导植物应激反应来增强对后续病原菌侵染的抗性^6,7。这些具有生物保护作用的MSM可诱导包括离子流动、ROS产生、转录变化和胼胝质沉积在内的细胞反应⁸。深入理解MSM与植物之间的相互作用，有助于阐明MSM在抗病性中的作用，并鉴定可用于提升作物抗病能力的寄主基因。

目前评估MSM诱导的植物胁迫响应的方法通常一次仅检测一种胁迫响应⁸。鉴于次级MSM提取较为困难，且可用的代谢物量可能有限，在同一样本中检测多种响应可更可靠地确认MSM对植物细胞具有影响。一种用于评估质外体活性氧（ROS）爆发的高通量方法是检测在辣根过氧化物酶存在下氧化后的鲁米诺所产生的发光信号⁹。然而，基于鲁米诺的发光反应会受到阳离子和某些溶剂的淬灭，限制了该方法在含盐提取物或必须溶于DMSO的非极性分子中的应用，因此需要一种能够耐受这些污染物的检测方法⁹。为解决上述问题，我们对现有方法进行了改进，可在同一样本中高通量地检测三种胁迫响应（离子渗漏、过氧化物酶活性和胼胝质沉积）（图1）^10,11,12。我们的方法包括在96孔板中通过真空渗透法将叶片圆片与MSM处理。处理后4–6小时进行电导率测定以评估离子渗漏，随后在24小时检测过氧化物酶活性和胼胝质沉积。该方法已针对拟南芥和大麦进行了优化，但经实验验证后也可扩展至其他植物物种。例如，该方法无法检测大麦中诱导的过氧化物酶活性，但可检测到有毒化合物对该活性的抑制作用。因此，不同物种间叶片特性或诱导响应的强度存在差异，这在一定程度上限制了该方法在某些植物物种中的适用性。

采用本方法进行实验设计时，应考虑所用微生物相关分子模式（MSM）的对照、重复次数和浓度，以确保获得最佳结果。阴性对照对于识别出与机械损伤效应相比能诱导显著不同应激反应水平的MSM至关重要。理想情况下，阴性对照应包含与MSM相同的溶剂，但不含MSM本身。疏水性MSM常用的溶剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甲醇，这些溶剂在高浓度下可诱导细胞产生如活性氧（ROS）生成等细胞反应^13,14。在本实验中，我们观察到DMSO和甲醇在浓度达到10%或更高时会抑制flg22诱导的过氧化物酶活性（图2）。对于复杂提取物，当目标代谢物未知时，可能难以建立完全不含MSM的阴性对照。此时，可根据分子大小、极性或电荷对提取物进行分级分离，从而实现不同组分间的相对比较，以鉴定出诱导应激最强的组分用于后续分析。此外，建议设置阳性对照（例如1 µM flg22或10 µM T-2毒素），以确保研究人员能够评估实验体系是否正常工作。我们建议每个处理组设置四个技术重复，并在每次实验中若使用多块板时，每块板均需包含阳性和阴性对照。

总体而言，该方法可捕获三种由根际促生菌（MSM）诱导的植物胁迫响应，为研究植物与根际促生菌互作提供了一种简便且经济有效的方法。高通量实验模式使研究人员能够在同一实验单元内检测植物基因型或微生物提取物之间的细微差异。这有助于从系统层面研究植物基因家族，或对植物群体进行遗传作图分析。在微生物方面，该方法可用于筛选潜在的生物保护性化合物，或应用于化学生物学研究，以鉴定能够增强或抑制特定胁迫响应的化合物。

方案

1. 样品制备与处理

注意：应采取所有适当的安全预防措施和处置规范，以尽量降低对实验人员和环境的风险。

1. 植物培养
   1. 将拟南芥种植于康奈尔土壤混合物（300 泥炭藓：630 蛭石：1 缓释肥料：4.2 石灰）中，每盆两株，每托盘24盆，培养至4至5周龄。根据需要从下方浇水，即将水加入托盘中。设置生长室条件为21 ^oC连续培养，光照16小时，黑暗8小时，保持相对湿度约30-50%。使用5-9^th 用于实验和采收的叶片应完全展开，并在早晨进行。
   2. 将大麦种植于75份盆栽土：24份黑土：1份石灰土的混合基质中，直至第一和第二片真叶完全展开。每盘设24个小区，每小区每盆播种一粒种子，根据需要浇水。设置生长室条件为21 ^o在约30–50%湿度条件下，以16小时光照和8小时黑暗的光周期培养。于早晨采集第一片和第二片完全展开的叶片。
2. 每株植物采集三个叶盘，使用直径为4 mm的打孔器，避开主脉。使用锋利的打孔器并以旋转动作操作，避免压碎组织。
3. 立即将叶圆片轻柔地放入96孔板的一个孔中，加入196 µL无菌Milli-Q H₂O₂O. 继续收集圆片，直至收集到所需数量的样品。
4. 将次级代谢产物或溶剂处理以所需浓度加入到各孔中，终体积为 200 µL。
5. 将去盖的96孔板放入带有真空抽气嘴的钟罩内。
6. 将真空管连接至钟罩喷嘴，开启真空压力，直至真空度达到9.8磅/平方英寸（通常需10秒）。重复此过程一次。
7. 将盖子盖在培养皿上，置于光照条件下（13 W，50 µmol∙m⁻²∙s⁻¹），在摇床（55 rpm）中孵育^-2·s^-1置于摇床正上方23 cm处，持续4小时。

2. 离子渗漏测定

1. 将探头在 Milli-Q 水中清洗，并用擦镜纸轻轻蘸干。记录水的电导率读数作为参考。
2. 处理后 4–6 小时，将探头浸入叶片圆片周围的液体中，测定并记录各孔的电导率。将培养板倾斜至 45° 角，以确保探头完全浸入液体中。
3. 每次测定样品之间，将探头浸入 Milli-Q 水中清洗，并用擦镜纸蘸干。偶尔检测水的电导率，以确保探头读数保持稳定。
4. 在培养板上覆盖塑料封口膜，然后置于摇床中过夜孵育。

3. 过氧化物酶活性测定

1. 每天新鲜配制过氧化物酶底物溶液，总体积为 50 mL。取 40 mL 无菌蒸馏水加入烧杯中，放入搅拌子，加热至 70 ^oC，将 50 mg 5-氨基水杨酸（1 mg/mL）溶于加热的水中。加水定容至 50 mL，并用 NaOH 调节 pH 至 6。该溶液对光敏感，需用铝箔包裹或使用棕色试管。
2. 在 50 mL 棕色锥形管中，通过将 1.7 mL 30% H₂O₂ 加入 48.3 mL Milli-Q H₂O 中，配制 1% H₂O₂ 溶液。
3. 在开始检测前立即向每毫升检测所需的 5-氨基水杨酸溶液中加入 10 µL 1% H₂O₂ 溶液，以制备检测反应液，混匀。
4. 采集经处理的叶片圆片样品时，在预定时间点从每个孔中取出 50 µL 样品，转移至透明平底 96 孔板中，加入 50 µL 检测反应液，用移液器吹吸混匀 5 次。
5. 室温孵育反应体系 3 分钟，然后加入 20 µL 2 N NaOH 终止反应，轻轻敲击混匀。
6. 使用酶标仪在 595 nm 波长下测定各孔的吸光度。

4. 胼胝质成像与图像分析

1. 过氧化物酶检测取样后，移除孔中剩余液体，每孔加入100 µL乙酸:乙醇（1:3）溶液，用于固定和脱色。盖上板盖，置于摇床（60 rpm）上，在室温下于通风橱中孵育24小时。
2. 用新鲜的脱色液替换原有的脱色液，在室温下继续孵育24小时。
3. 用移液器吸出脱色液，加入 100 µL 的 150 mM K₂HPO₄ 向每个孔中加入。将培养板置于摇床上，室温孵育30分钟。
4. 去除 K₂HPO₄ 洗涤液并加入 100 µL 的 150 mM K₂HPO₄ 用0.1 mg/mL的苯胺蓝染色。用盖子盖好96孔板，并用铝箔包裹，于摇床中孵育至少2小时（拟南芥）或过夜（大麦）。
   注意：苯胺蓝对光敏感，每次技术重复均应新鲜配制。
5. 移除苯胺蓝溶液，加入50%甘油。用铝箔包裹96孔板，于4 °C保存，待成像时取出。
6. 在干净的载玻片上滴加一滴50%甘油溶液。用镊子轻轻夹取一片叶圆片，将其远轴面朝上放置于载玻片上。盖上一张1.5号盖玻片，尽量避免产生气泡；必要时可补充50%甘油溶液，以充满盖玻片下方空间。
7. 使用20倍干镜在透射白光（明场）下将叶片材料调至焦点。
8. 将激发波长设置为370 nm，发射波长设置为509 nm，用于苯胺蓝成像，并设定曝光时间。优化曝光时间以获得足够信号，同时避免像素过饱和。为进行图像的定量比较，需确保所有生物学重复、处理组及技术重复的激光强度和曝光时间保持一致。
9. 对每个叶圆片，选择三个不同的视野，使用第4.8步中设定的参数分别采集图像。采集图像时，确保植物材料完全充满视野，背景区域（非植物材料）尽可能少。在叶片表面的单个z平面上采集图像。
   注意：背景信号在某些情况下难以完全避免，但可在后续图像定量分析步骤中进行校正。本示例中，图像使用配备汞灯和DAPI滤光立方体（激发光波长360/40 nm，发射光波长460/50 nm）的正置落射荧光显微镜采集。若无汞灯，可使用多波长LED光源替代。
10. 为定量分析图像中的胼胝质斑点，请根据在线指南下载并安装免费的 FIJI 图像处理软件 https://imagej.net/Fiji/Downloads。打开FIJI并导入品红蓝染色图像以进行分析。本分析应使用分辨率不低于300 dpi的.tiff文件。在分析前，使用显微镜软件将图像文件导出为.tiff格式，或直接由FIJI打开这些文件。
    注意：Fiji 可以打开大多数专有文件类型（例如., .czi，.nd2，.lif，.vsi
11. 在图像上设置比例尺（点击 分析 | 设置比例尺），使用显微镜设置中的距离值。
12. 将图像转换为32位灰度图像（点击 图像 | 类型 | 32 位).
13. 调整阈值（点击 图像 | 调整 | 阈值) 仅通过点击包含代表亮蓝染色的荧光信号 自动 然后手动调整阈值曲线上最小值和最大值。确定阈值后，单击 应用 | 转换为蒙版使用电子表格软件，记录每张图像选定的阈值参数。
    注意：由于植物样本本身具有自发荧光且植物组织经过透明化处理，不同样本间的阈值可能存在差异。为了保证实验的可重复性，必须记录每张图像的阈值，并在各样本间一致地调整阈值参数。
14. 使用荧光蓝染色点的数目和大小进行定量分析 分析颗粒 （点击 分析 | 分析颗粒）使用默认设置。要获取图像中所有斑点的平均值，请选择 总结 在弹出的对话框中，然后单击 好的.
15. 将这些结果复制并粘贴自 摘要 将方框中的阈值参数输入电子表格以进行进一步分析。此定量包含的数值包括：计数（苯胺蓝斑点的数量）、总面积（以单位表示的总面积）² 苯胺蓝荧光点数量），平均大小（以单位表示的平均大小）² 苯胺蓝斑点数量），%Area（以单位计的平均覆盖百分比）² 荧光面积比（苯胺蓝荧光面积与总面积之比）、周长（斑点的平均周长）和积分光密度（IntDen，表示苯胺蓝染色的荧光强度）。
16. 重复步骤 4.11–4.15，处理实验中获取的所有图像。在 FIJI 中关闭已设阈值的图像时，选择 不保存 为避免对原始数据图像进行修改而生成阈值掩膜。
17. 如果任何图像包含非植物背景区域，请通过手动勾勒植物组织区域来测量植物组织的面积 多边形 或 徒手 选择工具和测量 面积 （点击 分析 | 测量）。将该值复制到每张图像对应的电子表格中。
18. 在电子表格中，对一个生物学重复的三个视野图像的数值取平均值。如果实验中的某些图像包含非植物区域（参见步骤4.17），则需根据每张图像中植物组织的面积对所有数值进行校正。例如，在绘图和进行统计比较之前，将每个图像的计数值除以该图像中植物组织的面积。

5. 数据分析

1. 通过使用同一块板中的阳性对照与阴性对照进行比较，评估实验质量 t-检测。如果阳性对照未引起应激反应的显著变化，需重新评估实验条件，例如植株的健康状况、处理时间、阴性对照以及MSMs是否可能降解。
2. 显著性检验
   1. 若某一处理的所有技术重复均在同一批次的孔板中进行评估，则使用标准统计方法（如带Tukey检验的单因素方差分析）分析各处理组与阴性对照之间的差异。
   2. 若同一处理的技术重复在多个孔板上进行检测，应将每个样本相对于阴性对照进行归一化，以减少板间误差的影响。将每个数值除以同一块板中阴性对照样本的平均值。对归一化后的数据采用标准统计学方法进行分析。

结果

利用该方法，可以确定某种微生物次级代谢产物（MSM）是否激活植物细胞特定的应激反应。该检测的结果通过定量过氧化物酶活性、离子渗漏和胼胝质积累，来判断该MSM是否相较于阴性对照诱导了差异性反应。若某化合物结果为阳性，则表现为与阴性对照相比存在显著差异，例如离子载体类物质gramillin可诱导离子渗漏和胼胝质积累（图3）²。设置阳性对照（如1 µM flg22，可诱导上述三种反应）有助于确保植物状态正常及实验条件可靠（图3）^11,15。Gramillin和flg22溶于水，而疏水性物质surfactin和T-2毒素则溶于DMSO。配制疏水性分子时，我们首先在DMSO中配制10 mM的母液，再将其稀释至终浓度为10 µM的Milli-Q水溶液中用于叶片处理，此时溶液中DMSO含量为0.1%。Surfactin（10 µM）可诱导过氧化物酶活性和胼胝质积累，而T-2毒素（10 µM）则抑制过氧化物酶活性并诱导胼胝质积累，这可能与细胞死亡有关^2,6,16。在指定处理中，使用水或0.1% DMSO作为阴性对照均是合适的，因为两者产生的结果相似（图2）。

在我们对100种市售MSM的初步筛选中，发现所调查的大多数化合物均能诱导胼胝质的形成>70%），而离子渗漏和过氧化物酶活性则由较少的化合物引发（分别占30%和35%）。这些化合物中的大多数是由 镰刀菌属 物种，包括七种不同的单端孢霉烯族化合物，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和T-2毒素。尽管尚需进一步重复实验以确认这些结果，但其呈现出的趋势与我们的阳性对照组所观察到的结果相似。 (图3) 其中胼胝质在所有处理下均被诱导产生，而离子渗漏或过氧化物酶仅在部分处理下被触发，并非所有处理均能引发。

图 1：评估MSM诱导叶片细胞响应的实验流程概览。 将叶片圆片置于含有待测处理液的96孔板中，并进行真空渗透。每块板包含阴性对照（含溶剂的水）和阳性对照（flg22 或 T-2 毒素）各四个重复。处理 4–6 小时后，测定叶片圆片周围液体的电导率，以量化离子渗漏程度。处理 24 小时后，利用叶片圆片周围的液体通过比色法测定过氧化物酶活性；同时对叶片圆片进行脱色并进行胼胝质定量分析。缩写：MSM = 微生物次级代谢产物。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：溶剂对flg22诱导的离子渗漏或过氧化物酶活性的影响。四组重复的拟南芥样品用1 µM flg22分别与DMSO或甲醇（0、0.01、0.1、1、10%）组合处理。柱状图显示单次实验中处理4小时后的样品平均电导率，或处理24小时后的过氧化物酶活性（OD₆₀₀）（n = 4，SD）。该实验重复进行了两次，结果相似。与水处理对照组的显著差异通过t-检验确定，并用星号表示（p < 0.05）。缩写：DMSO = 二甲基亚砜；MeOH = 甲醇。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：微生物来源分子诱导拟南芥叶片圆片中离子渗漏、过氧化物酶活性或胼胝质沉积。处理包括免疫原性非毒性肽flg22（1 µM）、环状脂肽gramillin和表面活性素（10 µM），以及T-2毒素（10 µM）^2,6。所有数据均以水+0.1% DMSO对照组为基准进行归一化。箱须图显示了单次实验（n = 4–16株植物）中样品在4小时后的电导率、24小时后的过氧化物酶活性（OD₆₀₀）或24小时后的胼胝质沉积数量。箱线图中的“x”表示均值，方框表示处理组的第一四分位数、中位数和第三四分位数。须线表示非离群值中的最高和最低观测值（>1.5倍四分位距，以圆圈标示）。与水对照组的显著差异用星号表示，通过单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验确定（p < 0.05）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

定植于植物的微生物群落会分泌多种微生物源小分子物质（MSMs），以促进生物膜的形成、抑制竞争性微生物，并影响植物宿主¹⁷。某些MSMs对植物无明显影响，而另一些则可诱导植物细胞快速死亡、抑制细胞功能或激活植物抗性¹⁷。部分MSMs会影响植物对该MSM产生微生物的抗性，且可根据植物对MSMs的不敏感性筛选出抗性基因型^2,3,18。其他一些MSMs可诱导系统性抗性，从而提供对病原微生物的保护作用，该特性已在农业中被用于开发生物防护产品以抑制病害⁸。为了制定高效且可持续的作物改良策略，鉴定有益的MSMs以及使植物能够最佳响应MSMs的植物基因至关重要。

由于这些化合物是通过酶促反应生成的，需要多种酶共同作用才能形成最终产物，因此寻找有益的微生物源代谢物（MSM）十分复杂²。这使得在遗传学研究中难以确定应靶向哪个基因以阻断MSM的产生。酶促生物合成会导致同一种MSM出现多种结构变异，可能具有不同的生物活性¹⁹。分离和纯化这些MSM以鉴定其生物活性分子可能耗时漫长，甚至无法实现。在某些情况下，仅能获得低浓度的单个MSM，需经过多轮纯化才能得到足够量²。一旦获得具有生物活性的化合物或提取物，可采用多种方法来解析微生物可能影响植物的作用机制。

以往的研究主要集中在监测甲硫氨酸类似物（MSM）对模式植物转录重编程或生物保护作用的影响²⁰。为了评估模式植物之外的MSM响应，能够捕捉对多种MSM响应且所需MSM用量较少的高通量检测方法可能具有重要价值。最近的研究表明，活性氧（ROS）爆发是植物对多种MSM（包括gramillin、surfactin、syringomycin和syringopeptin）的常见早期响应^2,3,7。基于鲁米诺（luminol）的检测方法可用于检测由过氧化物酶和NADPH氧化酶产生的胞外ROS爆发，且适用于高通量测试²¹。然而，该方法无法检测由MSM（如surfactin）诱导的细胞内ROS⁷。定量检测过氧化物酶活性比基于鲁米诺的检测方法更灵敏，可用于检测胁迫期间ROS生成酶的瞬时激活¹¹。我们观察到surfactin可诱导过氧化物酶活性，这与近期研究结果一致，即在拟南芥中surfactin和beauvericin均可触发过氧化物酶活性（图3）²。此外，我们还发现flg22和离子载体gramillin可诱导离子渗漏，且所有测试化合物（包括flg22、T-2毒素、surfactin和gramillin）均如预期诱导胼胝质沉积（图3）^2,4,7。

通过在同一份样品中评估多种响应，我们能够最大限度地减少分别评估每种性状时的实验变异，并实现性状间的关联分析，从而开展植物应激反应的系统水平研究。在同一实验单元内评估多种处理或基因型，还可实现群体水平的表型分析，用于群体遗传学研究。例如，已有研究采用类似方法鉴定了大麦中调控flg22诱导活性氧（ROS）产生的数量性状位点（QTL）²²。该检测方法还可用于化学遗传学筛选，以发现植物应激反应的调控因子，或从微生物提取物中鉴定潜在的生物保护性微生物信号分子（MSMs）。

为了确保实验方法在目标体系中有效，研究人员应考虑以下因素和局限性：

叶片组织的质量
确保在采收前植物叶片组织未受到胁迫。植物胁迫的表征因物种而异，但通常包括萎蔫、黄化、红化、斑点、过度卷曲或叶片卷边。取样叶片组织会造成损伤，因此避免组织过度研磨可减少因操作引起的背景误差。

植物种类
本实验方案已针对大麦和拟南芥叶片进行了优化。大麦叶片的胼胝质染色时间比拟南芥更长，这可能是由于禾本科植物具有较厚的角质层蜡质，增加了叶片的疏水性，从而限制了处理试剂向叶片内部的扩散²³。这也可能部分解释为何使用本方法未能诱导出明显的过氧化物酶活性，尽管我们能够观察到有毒化合物对过氧化物酶活性的抑制作用，这与我们在拟南芥中所展示的结果类似（图3）。我们曾尝试将每个样品的叶圆片数量增加至5个，调整pH至5、6或7，将真空渗透次数增加至10次，并修改底物浓度或将底物更换为愈创木酚²⁴。虽然增加叶圆片数量和渗透轮次后过氧化物酶活性有所提高，但在不同实验中，阴性对照组与flg22处理组之间的差异仍然较小（flg22处理仅使活性提高10%）或无统计学意义。已知大麦在flg22刺激下会诱导活性氧（ROS）产生、胼胝质积累以及过氧化物酶的表达^25,26。在玉米根部的研究中，蛋白提取物显示出病原相关分子模式（MAMP）诱导的过氧化物酶活性，提示可能需要通过蛋白提取的方式才能检测到该诱导效应，而不是像本实验所采用的方法那样依赖于叶圆片中蛋白活性的渗出²⁴。在本实验中，机械损伤明显诱导了阴性对照样品中的过氧化物酶活性，因为当细胞因毒素暴露而死亡后，该活性即消失。有可能flg22处理诱导的是与机械损伤相同的过氧化物酶，从而导致看似未发生额外诱导的现象。或者，本实验方法的灵敏度可能不足以检测细微的变化，亦或过氧化物酶未能有效扩散至溶液中。

若将本方案应用于其他植物物种，我们建议按照所述方法操作，并同时以拟南芥作为对照，以确保方案的有效性。如果过氧化物酶活性较低，可尝试增加每个样品的叶盘数量、将真空渗透次数增加至5次或10次，或尝试其他处理方式，包括其他微生物相关分子模式（MAMPs）、离子载体或T-2毒素，以获得阳性结果。

阴性对照处理
该方法依赖于有效且适当的阴性对照来进行比较。理想情况下，阴性对照应包含与目标微生物相关分子（MSM）处理相同的背景溶剂，但不含MSM本身。该背景溶剂应为水，或对所测应激指标的影响与水相当。当MSM已纯化并可溶于特定溶剂时，此方法具有可行性。在比较微生物提取物时，阴性对照可能是MSM部分纯化过程中的副产物，其含有相同的背景培养基，但在分级后MSM浓度降低。或者，实验人员可使用用于生成含MSM提取物的培养基作为阴性对照。在这些更复杂的样品中，阴性对照可能含有使电导率测量值升高的盐类，或溶剂可能抑制过氧化物酶活性（图2）。为确定盐类是否影响离子渗漏结果，实验人员可在不加入叶盘的情况下检测阴性对照和样品的电导率，以判断是样品本身还是叶片导致了电导率的变化。为确定溶剂是否影响过氧化物酶反应，实验人员可将flg22加入阴性对照中，并与溶解于水的flg22结果进行比较，以判断是否存在差异。需要注意的是，阴性对照中的溶剂、有色化合物或过量盐类可能会掩盖MSM对所述植物应激反应的影响，因此该方法并非在所有情况下均适用。

取样时间
建议在早晨开始处理，因为可诱导的防御反应遵循昼夜节律，并在清晨时幅度最高²⁷。根据我们的经验，拟南芥对gramillin产生离子渗漏的反应速度比大麦和玉米更快（拟南芥为4小时，大麦和玉米为4–7小时），因此可能需要进行时间进程实验以确定最佳实验参数^2,28。细胞的反应性随时间推移而下降，我们不建议在处理后30小时以上检测应激反应。

浓度
MSM 的浓度可能对诱导植物应激反应产生非线性影响，这一现象称为毒物兴奋效应（hormesis）²⁰。根据 MSM 的可获得性和溶解度，研究者理想情况下应在一系列 MSM 浓度范围内测试植物的应激反应。通常起始浓度范围在 100 nM 至 1,000 µM 之间^2,11,20。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氨基水杨酸	Millipore Sigma	A79809
Barnart 真空泵	Artisan Technology Group	400-3910
COND-905 微型电导探针	Lazar Research Laboratories Inc.
flg22 肽	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
表面活性素	Sigma-Aldrich	S3523
T-2 毒素	Cayman Chemical Company Inc	20433