建立与评估一个 白色念珠菌 水溶性提取物诱导的小鼠川崎病相关冠状动脉炎模型

摘要

CAWS诱导的小鼠模型能够有效模拟川崎病从急性炎症到慢性纤维化的进展过程，揭示其关键的病理学和免疫病理学特征，并可能促进川崎病靶向治疗策略的开发。

摘要

川崎病（KD）是一种主要影响儿童的全身性血管炎，其最严重的并发症是冠状动脉病变。在本研究中，采用水溶性提取物建立了优化的小鼠川崎病模型。 白色念珠菌 （CAWS）。采用苏木精-伊红染色和马松三色染色评估心肌炎症及相关病理改变。通过免疫荧光技术检测心脏组织中免疫细胞的浸润情况。采用免疫组化法检测心肌组织中VDAC1蛋白的表达与定位。 体外，通过将RAW264.7巨噬细胞与 白色念珠菌 孢子，以及自噬溶酶体的形成与功能通过LC3免疫荧光染色和Lyso-Tracker Red探针进行评估。通过剂量筛选确定，8 mg为诱导冠状动脉炎症的最佳建模剂量，该剂量下小鼠死亡率适中。HE染色显示，CAWS注射可稳定诱导小鼠冠状动脉病变，其特征与人类川崎病一致。Masson染色证实，CAWS组小鼠冠状动脉及主动脉周围存在显著的胶原纤维沉积，且沉积区域与炎症区域高度重合，在注射后14天与对照组相比差异具有统计学意义（p < 0.05）。 < 0.001）。免疫荧光结果显示，在造模第14天，CAWS组小鼠心肌组织中多种免疫细胞的浸润显著增加（p < 0.001）。免疫组化结果显示，在造模第28天，CAWS组小鼠心肌组织中VDAC1蛋白的表达显著上调（p < 0.001). 体外 实验表明，在感染了的巨噬细胞中 白色念珠菌 孢子在早期阶段自噬溶酶体的形成增加，而后期自噬流受阻，提示存在功能紊乱。

引言

川崎病（KD）是一种黏膜皮肤淋巴结综合征，是一种发生于5岁以下儿童的自身免疫性疾病，伴有发热性血管炎^1,2,3。研究表明，未经治疗或严重川崎病治疗疗程超过10天者，易引发严重的心血管并发症，主要包括冠状动脉瘤和冠状动脉狭窄^4,5。冠状动脉瘤破裂可能导致心源性休克甚至猝死，是儿童获得性心脏病的主要病因^6,7。尽管静脉注射免疫球蛋白的应用已显著改善预后，但其病因和发病机制仍不明确，限制了靶向治疗策略的发展^8,9。因此，建立能够准确模拟人类疾病特征的动物模型已成为当前研究的迫切需求。

目前，川崎病研究面临的主要障碍之一是缺乏能够充分模拟人类疾病病理特征的、经过充分表征的动物模型。在已建立的多种模型中，由干酪乳杆菌细胞壁提取物（LCWE）诱导的血管炎模型是一种相对成熟的体系，该模型可引发冠状动脉炎，被广泛用于研究免疫失调及特定细胞因子在类似川崎病的血管炎中的作用机制。^10,11由水溶性提取物诱导的血管炎模型 白色念珠菌 (CAWS) 也因其与人类川崎病病理特征的高度相似性而受到广泛关注^12,13经过多个研究团队的系统性优化与改进，CAWS诱导模型已发展成为川崎病研究的重要工具¹⁴尽管CAWS可诱导冠状动脉炎症 通过 腹腔注射无法完全再现人类川崎病血管炎的精确病理过程，因此存在局限性。例如，在人类川崎病的晚期病理中未发现中性粒细胞¹⁵，但在此模型中，中性粒细胞浸润在CAWS注射后长达16周内仍然发生¹⁶此外，CAWS 引起血管炎的机制目前尚未完全阐明，这限制了对该模型的深入理解与应用⁹本研究旨在通过优化CAWS诱导方案，建立标准化的川崎病动物模型，阐明疾病机制，并推动靶向治疗的发展。

本研究利用CAWS建立更为标准化的川崎病动物模型。通过系统的剂量优化实验，确定每日腹腔注射8 mg、连续5天为最佳给药方案。该方案可稳定诱导冠状动脉病变，同时保持动物较高的存活率。此外，我们进一步探讨了线粒体功能障碍在川崎病慢性期纤维化形成中的作用，重点关注电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）——一种调控线粒体凋亡的关键蛋白——在炎症向纤维化转变过程中的可能机制¹⁷。值得注意的是，本研究通过自噬体/溶酶体共定位分析，在该模型中观察到自噬功能异常。这一优化后的模型为系统研究川崎病冠状动脉病变的发病机制及评估新的治疗策略提供了重要工具。

方案

所有涉及动物数据的研究实验均经南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会批准（批准号：KY-2024-250-01）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. CAWS 的制备

1. 根据 Duong 等人建立的方案¹⁸，将白色念珠菌（Candida albicans）接种于沙氏葡萄糖液体培养基中。然后，将接种后的培养液置于密闭厌氧培养箱中，在37 °C下以混合气体环境厌氧培养48小时。
   ​注意：为确保培养基的无菌状态，必须严格控制37 °C的厌氧培养条件，防止杂菌污染。
2. 用限碳培养基反复冲洗，并在37 °C、4.5 x g 转速条件下培养48小时。
3. 加入等体积无水乙醇，于4 °C静置过夜。
4. 在4 °C、4.5 x g 条件下离心15分钟，弃去上清液，向沉淀中加入等体积无水乙醇，4 °C下静置过夜。
5. 再次离心后，弃去上清液，向沉淀中加入50 mL丙酮，离心并干燥沉淀。将沉淀溶解于无菌生理盐水中，备用。

2. 构建川崎病小鼠模型

1. 选取80只4至6周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠，在标准饲养条件下饲养，自由摄食和饮水。
   注意：为减少雌激素水平波动对免疫和炎症反应的潜在干扰，本初步模型建立与表征研究仅使用雄性小鼠¹⁹。
2. 采用随机数字表法将小鼠均分为4组，包括3个不同剂量的CAWS注射组（4 mg、8 mg、12 mg）和1个生理盐水对照组，每组20只小鼠。
3. 用无菌生理盐水（0.9% NaCl）将CAWS粉末配制成40 mg/mL、80 mg/mL和120 mg/mL三种浓度。实验组在实验第1至第5天每天上午注射0.1 mL CAWS，对照组在相同时间表下给予等体积的生理盐水。
   注意：腹腔注射使用1 mL胰岛素注射器。操作时将小鼠头部朝下、尾部朝上固定，以防止注射器插入时损伤大肠和小肠等器官。
4. 每天上午9点使用电子天平同步称量饲料盒中剩余饲料的重量，并计算每笼小鼠24小时内的摄食量。
5. 在末次注射后的第3、7、14和28天，每个时间点随机选取并处死每组3只小鼠。
6. 将小鼠置于预先充满空气的密闭室中，以每分钟30%腔体体积的流速通入压缩CO₂。5分钟后实施颈椎脱位以确认死亡。
7. 采集心脏组织并称重。通过HE染色观察心脏及血管的炎症病变。

3. HE 染色及分级标准

1. 迅速分离心脏和主动脉弓（约 3 mm × 3 mm）。按照所述方法进行胸骨正中切开术²⁰。快速将心脏与主动脉弓（约 3 mm × 3 mm）分离。收集的组织用10%中性缓冲甲醛固定24小时。
2. 固定后，依次通过梯度乙醇脱水（70%乙醇1小时，80%乙醇1小时，95%乙醇1小时，100%乙醇1小时），二甲苯透明，石蜡包埋。最后将组织块切成5 µm的连续切片。
3. 进行H&E染色时，将切片用苏木精染色5分钟，流水冲洗10分钟，伊红复染2分钟，然后进行脱水和封片²¹。
   注意：根据血管内膜损伤程度，分为三个等级：Ⅰ级主要表现为内皮细胞肿胀和中性粒细胞聚集；Ⅱ级表现为平滑肌变性、炎性细胞浸润和细胞器损伤；Ⅲ级表现为内皮细胞坏死脱落、纤维蛋白沉积等严重病变。

4. 马松三色染色

1. 固定后，将组织样本依次通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后浸入石蜡包埋。
2. 脱蜡后，将切片依次通过梯度乙醇水化至蒸馏水，为染色做准备。
3. 用Weigert铁苏木精染细胞核5分钟，流水充分冲洗，然后用丽春红酸性品红染细胞质5分钟。
4. 用1%磷钼酸分化1分钟，随后直接用苯胺蓝染胶原纤维3分钟。用1%冰醋酸快速冲洗。
   注意：严格控制分化步骤的时间，以确保染色特异性。
5. 经乙醇和二甲苯脱水透明后，封固中性树胶。
6. 将染色后的切片用流水冲洗，以去除多余的染料。
7. 将切片依次通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后用中性树胶封片。
8. 在光学显微镜下以一致的放大倍数观察切片。胶原纤维呈蓝色，肌纤维和细胞质呈红色，细胞核呈深蓝色。

5. 免疫荧光染色

1. 固定细胞或组织切片，并用 5% BSA 封闭 1 小时，以减少非特异性结合。
2. 使用与二抗同一种属来源的正常血清，按 1:10 的比例用 PBS 稀释后滴加到样本上，室温封闭 30 分钟。封闭后用 PBS 轻柔冲洗两次。
3. 将切片与一抗在 4 °C 下孵育过夜。用 PBS 洗涤后，加入荧光标记的二抗，避光孵育 1 小时。
4. 用 DAPI 对细胞核进行染色，使用抗淬灭封片剂封片，并在共聚焦显微镜下观察。

6. 免疫组织化学

1. 脱蜡并水化石蜡切片后，进行抗原修复，并阻断内源性过氧化物酶。
2. 抗体孵育与显色：首先用正常血清封闭，然后依次孵育一抗和HRP标记的二抗，最后进行DAB显色。在显微镜下控制反应程度。
3. 用苏木精对细胞核进行复染。经脱水和透明处理后封片，在显微镜下观察棕黄色的阳性信号。
   注意：实验需设置对照，并严格控制抗原修复和显色的条件。

7. 自噬溶酶体检测

1. 以适当比例（10:1）将 RAW264.7 巨噬细胞与白色念珠菌（Candida albicans）孢子共培养，在 37 °C、5% CO₂ 条件下分别孵育 4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h 和 48 h，建立吞噬模型。
2. 用预冷的 PBS 洗涤三次，以去除未被吞噬的孢子。
3. 首先用 5% BSA 封闭样本 30 分钟；然后在室温下依次孵育抗 LC3 一抗（1:200 稀释）1 小时，再孵育 Alexa Fluor 488 标记的二抗 30 分钟。
4. 直接向细胞中加入 Lyso-Tracker Red 溶酶体探针以显示溶酶体定位。最后用 DAPI（1 µg/mL）复染细胞核 5 分钟。
   注意：整个操作过程应在避光条件下进行，以确保抗体孵育时间和浓度的准确控制。

结果

首先，我们系统评估了不同剂量CAWS在小鼠中诱导的心肌病理改变。在PBS对照组、4 mg CAWS组和8 mg CAWS组中均未观察到死亡（每组n=20）。相比之下，4 mg组的炎症反应较轻，未达到建模要求。12 mg CAWS组的死亡率较高（9/20，45%），死亡发生在注射后第3至第10天。这些结果表明，12 mg剂量可引起过度的局部炎症损伤和全身毒性，因此该剂量被排除在后续研究之外。最终选择8 mg剂量作为最佳给药方案，因其可有效诱导显著的冠状动脉炎，同时维持可接受的存活率和最少的局部不良反应。（图1A）最终确定腹腔注射8 mg CAWS为最佳建模剂量。实验组的HE染色结果显示了炎症与纤维化典型的动态过程：第3天出现以血管周围中性粒细胞和单核细胞为主的局灶性炎性浸润；第7天炎症范围扩展至心肌间质，伴有明显的心肌细胞肿胀和间质水肿；第14天炎症达到高峰，出现心肌纤维排列紊乱和局灶性坏死；第28天尽管炎症有所缓解，但已形成早期纤维化（图1B 和

讨论

川崎病（KD）中的冠状动脉瘤（CAA）和心肌纤维化是导致长期心血管事件的主要原因。尽管在急性期治疗方面已取得进展，但仍有约5%的患者会发展为持续性冠状动脉瘤^28,29。这种延迟性病理改变的机制尚不明确，迫切需要建立动物模型以揭示其动态过程³⁰。由于人类川崎病患者的心脏组织样本极为有限，且临床研究难以对冠状动脉和心肌的长期变化进行动态追踪，因此迫切需要一种能够模拟从急性血管炎到慢性纤维化整个过程的动物模型，以阐明其潜在机制并探索干预策略^16,30。

本研究采用CAWS诱导的小鼠血管炎模型，系统模拟了川崎病（KD）急性炎症期和慢性纤维化期的动态演变过程。该模型的建立为研究川崎病的免疫病理机制提供了新的视角。通过免疫荧光染色，我们观察到在CAWS诱导的模型中，冠状动脉及心肌组织中多种免疫细胞的浸润显著增加，这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一种山羊来源的兔IgG Alexa Fluor 488二抗	abcam	ab15081	一种山羊来源的兔IgG Alexa Fluor 488二抗
厌氧培养箱	Thermo Scientific	Thermo Scientific	厌氧培养箱
苯胺蓝	Solarbio	G3668	苯胺蓝
anti-LC3	abcam	ab192890	LC3一抗
生物安全柜	Thermo Scientific	1500	生物安全柜
BSA	Solarbio	A8020	BSA
白色念珠菌（菌株）	NBRC	1385	白色念珠菌（菌株）
CD3e	BD Bioscience	561827	FITC仓鼠抗小鼠CD3e(145-2C11)
CD86	BD Bioscience	105013	CD86
CD8a	BD Bioscience	100713	CD8a
细胞培养箱	Thermo Scientific	311	细胞培养箱
离心机	Thermo Scientific	ST4R Plus	离心机
共聚焦显微镜	Olympus	IX73	共聚焦显微镜
DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131-25ml	DAPI
DMEM	Gibco	11965126	DMEM
包埋机	P.S.J MEDICAL	BM450A	包埋机
伊红	Solarbio	G1100	伊红
F4/80	BD Bioscience	123109	F4/80
FBS	Gibco	16000044	FBS
甲醛	Solarbio	P1110	甲醛
全自动组织脱水机	Leica Biosystems	ASP3005	全自动组织脱水机
玻璃载玻片	Citotest	250124A1	玻璃载玻片
H&E染液	Beyotime Biotechnology	C0105M	H&E染液
IHC试剂盒	Absin Biotechnology	abs996-5ml	IHC试剂盒
LC3探针	Beyotime Biotechnology	C3018M	LC3探针
低剖面切片刀	Thermo Fisher	3052835	低剖面切片刀
溶酶体探针	Beyotime Biotechnology	C1046	溶酶体探针
标记笔	Deli	SK109	标记笔
Masson染液	Beyotime Biotechnology	C0189M	Masson染液
切片机	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	切片机
中性树胶	Solarbi	G8590	中性树胶
NK1.1	BD Bioscience	561117	NK1.1
光学显微镜	Nikon	Nikon	光学显微镜
石蜡	Solarbio	YA0012	石蜡
石蜡	Solarbio	YA0012	石蜡
PBS	Solarbio	P1020	PBS
磷钼酸	Solarbio	G3472	磷钼酸
VDAC1	Abcam	ab34726	抗VDAC1抗体