白色念珠菌水溶性提取物诱导川崎病相关冠状动脉炎小鼠模型的建立与评价

川崎病（KD）是皮肤黏膜淋巴结综合征的一种形式，是一种自身免疫性疾病，发生在5岁以下儿童身上，并伴有热性血管炎^1,2,3。研究表明，未经治疗或超过10天的严重川崎病疗程容易诱发严重的心血管并发症，主要包括冠状动脉瘤和冠状动脉狭窄^4,5。冠状动脉瘤破裂可能导致心源性休克甚至猝死，这是儿童获得性心脏病的主要原因 ^6,7。尽管静脉注射免疫球蛋白的应用显着改善了预后，但其病因和发病机制仍不清楚，这限制了靶向治疗策略的发展^8,9。因此，建立能够准确模拟人类疾病特征的动物模型成为当前研究的迫切需求。

目前，川崎病研究的一个主要障碍是缺乏充分概括人类疾病病理学的特征明确的动物模型。在目前开发的各种模型中，干酪乳杆菌细胞壁提取物（LCWE）诱导的血管炎模型是一个比较成熟的系统，该模型可引起冠状动脉炎。它广泛用于研究川崎病样血管炎中免疫失调和特异性细胞因子的机制^10,11。白色念珠菌（CAWS）水溶性提取物诱导的血管炎模型也因其与人类川崎病的病理特征高度相似而备受关注^12,13。经过多个研究团队的系统优化和改进，CARES诱导模型已发展成为川崎病研究的重要工具¹⁴。虽然CAWS可以通过腹腔注射诱发冠状动脉炎症，但其局限性在于不能完全再现人类川崎病血管炎的确切病理过程。例如，在人 KD¹⁵ 的晚期病理中未发现中性粒细胞，但在 CAWS 注射¹⁶ 后长达 16 周，该模型中仍然发生中性粒细胞浸润。此外，目前CAWS引起的血管炎机制尚未完全阐明，这限制了模型⁹的深入理解和应用。本研究旨在通过优化CARS的诱导方案，阐明疾病机制，促进靶向治疗的开发，建立川崎病的标准化动物模型。

本研究利用CAWS建立了更标准化的川崎病动物模型。通过系统的剂量优化实验，确定腹腔注射8mg，每天连续5天是最佳给药方案。该方案可以稳定诱发冠状动脉病变，同时保持动物的高存活率。此外，我们进一步探讨了线粒体功能障碍在川崎病慢性期纤维化形成中的作用，重点关注电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的可能机制，VDAC1是一种调节线粒体细胞凋亡的关键蛋白质，在从炎症到纤维化的转变过程中¹⁷。值得注意的是，通过本研究中的自噬体/溶酶体共定位分析，在该模型中观察到自噬功能异常。该优化模型为系统研究川崎病冠状动脉病变的发病机制和评估新的治疗策略提供了重要工具。

所有涉及动物数据的研究实验均经南京医科大学附属淮安第一人民医院伦理委员会批准（KY-2024-250-01）。所使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. CAWS的准备

1. 根据Duong等人¹⁸的既定方案，在Sabouraud葡萄糖肉汤中接种白色念珠菌。然后，将接种的肉汤在37°C下厌氧培养48小时，在密封的厌氧室中与气体混合物混合。
   注意：为保证培养基的无菌性，必须严格控制37°C的厌氧培养条件，以防止被杂菌污染。
2. 用 C 限制培养基反复冲洗，并在 37°C 下以 4.5 x g 的转速孵育 48 小时。
3. 加入等体积的无水乙醇，在4°C下静置过夜。
4. 在4°C下以4.5× g 离心15分钟，除去上清液，向沉淀物中加入等体积的无水乙醇，并在4°C下放置过夜。
5. 离心后，弃去上清液，向沉淀物中加入50mL丙酮，离心，干燥沉淀物。将沉淀溶解在无菌生理盐水中备用。

2. 构建川崎病小鼠模型

1. 选择80只4-6周龄的SPF级雄性C57BL / 6小鼠，并将它们饲养在受控条件下，并自由获得食物和水。
   注意：为了尽量减少雌激素水平波动对免疫和炎症反应的潜在干扰，在这项初步模型建立和表征研究中仅使用雄性小鼠¹⁹。
2. 通过随机数字表法将小鼠平均分为4组，包括3个不同剂量的CAWS注射组（4mg、8mg、12mg）和1个生理盐水对照组，每组20只小鼠。
3. 使用无菌生理盐水（0.9%NaCl）将CAWS粉末制备成40mg / mL，80mg / mL和120 mg / mL三种浓度。实验第1天至第5天早上给实验组注射0.1mL CAWS，并按相同时间表给予对照组等体积生理盐水。
   注意：使用 1 mL 胰岛素注射器进行腹腔注射。作时，鼠标头部较低，尾部较高，以防止插入注射器时对大肠和小肠等器官造成损害。
4. 每天上午9点使用电子天平同时称量喂食器中剩余的饲料，并计算每个笼子小鼠的24小时食物消耗量。
5. 在最后一次注射后的第3、7、14和28天，在每个时间点从每组中随机选择并处死3只小鼠。
6. 将小鼠置于预先充满室内空气的封闭室中。以每分钟腔室容积的 30% 的流速引入压缩的 CO₂ 。5分钟后，行宫颈脱位确认死亡。
7. 收集并称重心脏标本。通过HE染色观察心脏和血管的炎症性病变。

3、HE染色分级标准

1. 心脏和主动脉弓（约 3 毫米× 3 毫米）被迅速分离。根据所述方法²⁰进行正中胸骨切开术。快速将心脏与主动脉弓分开（约 3 毫米× 3 毫米）。将收集的组织固定在10%中性缓冲福尔马林中24小时。
2. 固定后，通过分级乙醇系列（70%乙醇1小时，80%乙醇1小时，95%乙醇1小时，100%乙醇1小时）脱水组织，在二甲苯中澄清，并包埋在石蜡中。最后，将块切成 5 μm 的连续切片。
3. 对于H&E染色，用苏木精染色切片5分钟，在流水中冲洗10分钟，用曙红复染2分钟，然后进行脱水和封固²¹。
   注：根据血管内膜损伤程度分为3个等级：I.级主要表现为内皮肿胀和中性粒细胞聚集;II.级表现为平滑肌变性、炎症细胞浸润、细胞器损伤;III级表现为严重病变，如内皮坏死和脱落，以及纤维蛋白沉积。

4. 马尾三色染色

1. 固定后，通过分级乙醇系列脱水组织样品，在二甲苯中澄清，并包埋在石蜡中。
2. 脱蜡后，通过分级乙醇系列将切片水合到蒸馏水中，为染色做准备。
3. 用Weigert的苏木精铁染色细胞核5分钟，在流水下彻底冲洗干净，然后用立春红酸品红染色细胞质5分钟。
4. 用1%磷钼酸分化1分钟，然后直接用苯胺蓝染色胶原纤维3分钟。用 1% 冰醋酸快速冲洗。
   注意：严格控制分化步骤的时间，以确保染色特异性。
5. 用乙醇和二甲苯脱水后，变得透明，密封中性膜。
6. 用流水冲洗染色部分以去除多余的染料。
7. 通过分级乙醇系列脱水切片，在二甲苯中透明，并用中性口胶安装。
8. 在光学显微镜下以一致的放大倍率观察切片。胶原纤维应呈蓝色，肌纤维和细胞质呈红色，细胞核应呈深蓝色。

5.免疫荧光染色

1. 固定细胞或组织切片，并用5%BSA封闭1小时以减少非特异性结合。
2. 使用与二抗同源的正常血清，用PBS按1：10的比例稀释，滴在样品上。在室温下密封30分钟。密封后，用PBS轻轻冲洗两次。
3. 将切片与一抗在4°C下孵育过夜。 用PBS洗涤后，加入荧光二抗，避光孵育1小时。
4. 用DAPI对岩心进行染色，用防淬灭封片剂密封，在共聚焦显微镜下观察。

6. 免疫组化

1. 石蜡切片脱蜡水合后，进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶。
2. 抗体孵育和显色：首先用正常血清封闭，然后将一抗和HRP标记的二抗依次孵育，最后进行DAB显色。在显微镜下控制反应程度。
3. 用苏木精重新染色细胞核。脱水透明后，密封板，在显微镜下观察棕黄色正信号。
   注意：实验需要设置对照，严格控制还原和显色的条件。

7. 自溶酶体检测

1. 将RAW264.7巨噬细胞与 白色念珠菌 孢子按适当比例（10：1）共培养，在37°C和5%CO₂ 下孵育4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h和48 h，建立吞噬模型。
2. 用预冷的PBS洗涤三次以去除未吞噬的孢子。
3. 首先，用5%BSA封闭样品30分钟。然后，与针对 LC3 的一抗（1：200 稀释）在室温下依次孵育 1 小时，然后在室温下孵育 Alexa Fluor 488 标记的二抗 30 分钟。
4. 将 Lyso-Tracker Red 溶酶体探针直接添加到细胞中，以可视化溶酶体定位。最后，用DAPI（1μg/mL）复染细胞核5分钟。
   注意：整个作过程应在黑暗中进行，以确保抗体的孵育时间和浓度得到准确控制。

最初，我们系统地评估了不同剂量的CAWS诱导的小鼠心肌病理变化。PBS对照组、4mg CAWS组和8mg CAWS组均未观察到死亡（每组n=20）。相比之下，4 mg组的炎症反应较轻，不符合建模要求。12 mg CAWS组死亡率较高（9/20,45%），注射后第3-10天死亡。这些发现表明，12 mg 的剂量可引起过度的局部炎症损伤和全身毒性。因此，该剂量被排除在后续研究之外。最终选择8mg剂量作为最佳给药方案，因为它可以有效诱发显着的冠状动脉炎，同时保持可接受的生存率和最小的局部不良反应。（图1A）。最终，确定腹腔注射 8 mg CAWS 是最佳建模剂量。实验组HE染色结果显示炎症和纤维化的典型动态过程。第三天，发生局灶性炎症浸润，主要由血管周围中性粒细胞和单核细胞组成。到第7天，炎症范围扩大至心肌间质，并伴有明显的心肌细胞肿胀和间质水肿。第14天，炎症达到高峰，出现心肌纤维排列紊乱和局灶性坏死。第28天，虽然炎症有所缓解，但早期纤维化已经形成（图1B 和 图2A）。相比之下，对照组的心肌结构在所有时间点都保持正常。所有结果均通过双盲评估得到证实，验证了8mg CAWS剂量可以稳定诱导与川崎病特征相符的心肌损伤模型。

随后，采用Masson三色染色法研究CARES诱导的川崎病样血管炎是否会导致冠状动脉（CA）周围持续性纤维化。实验结果表明，在CAWS注射组小鼠中，在发炎的冠状动脉和主动脉壁周围检测到明显的胶原纤维沉积物，且这些纤维化区域与炎症细胞浸润的分布位置高度吻合。相比之下，PBS对照组中的小鼠仅表现出弱的胶原染色，该染色局限于血管壁的正常结构范围内（图2A）。定量分析表明，14天时发生明显的胶原纤维沉积，纤维化程度与对照组有统计学差异（图2C）。

鉴于川崎病的中心病理变化是血管壁的免疫炎症反应，涉及多种免疫细胞的协调作用22,23，接下来我们通过免疫荧光（IF）染色探讨了CAWS模型中免疫微环境的特征变化。在CAWS注射后第14天，对注射CAWS的小鼠心脏组织进行免疫细胞标志物的IF染色。实验结果显示，在CAWS治疗组小鼠造模第14天，与PBS对照组相比，冠状动脉和心肌组织中CD3+ T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD86+ M1型巨噬细胞、F4/80+巨噬细胞和NK1.1+自然杀伤细胞的浸润率显著增加（图2B，D）。通过系统分析这些免疫标志物的表达变化，不仅验证了CAWS模型能够准确模拟人类川崎病的免疫学特征，更重要的是揭示了不同免疫细胞亚群在疾病发生发展中的可能机制，为后续开发靶向免疫干预策略提供了理论依据。

研究确定，线粒体功能障碍是心肌纤维化的关键机制 24,25,26。人们认识到，在炎症应激下，电压依赖性阴离子通道 1 （VDAC1） 是线粒体质量控制的关键蛋白质，当其表达上调时，可触发线粒体通透性过渡孔 （mPTP） 的异常打开。这反过来又诱导细胞死亡并激活成纤维细胞17,27。为了探索这种机制，我们使用免疫组织化学评估了慢性期 VDAC1 的表达。我们的研究结果表明，与PBS对照组相比，CARES治疗组小鼠心肌组织中的VDAC1蛋白表达在建模后28天显着升高（图3）。阳性信号主要位于纤维化区域和血管周围，表明 VDAC1 介导的线粒体功能障碍可能导致川崎病模型中的心肌纤维化。这些数据为CARES诱导的心肌损伤的分子机制提供了实验证据。

此前的研究发现，VDAC1介导的线粒体功能障碍参与川崎病的心肌纤维化过程，但其具体机制尚未明确。鉴于线粒体稳态的维持取决于自噬-溶酶体系统的正常功能。我们推测VDAC1可能通过影响自噬溶酶体的形成或功能来加剧纤维化，导致线粒体异常积累。为了验证这一假设，我们首先建立了巨噬细胞中的 白色念珠菌 孢子感染模型（RAW264.7）（图4），并检测了模型中自噬流和溶酶体活性的动态变化。实验结果表明，自噬溶酶体的形成在早期（细胞感染后2-3 h内）增加，而自噬血流在后期（细胞感染后3-4 h）受阻。自噬流量的变化可以通过自噬体和溶酶体共定位后合并染色的变化来评估。这一结果证实了自噬溶酶体的功能障碍确实会导致细胞清除受损。

图1：心脏和冠状动脉的组织病理学分析。 （A）注射PBS或不同剂量的CAWS（4mg，8mg和12mg;每组n = 20）的小鼠的生存曲线。（B）给出了CAWS治疗组（8 mg）心脏在不同时间点（3 d、7 d、14 d、28 d）的HE染色结果。比例尺：1500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图2：胶原纤维化和免疫细胞浸润的分析。 （A）CAWS 8mg组和对照组的Masson染色结果。胶原纤维呈现特征性的蓝色，肌纤维和细胞质呈红色，细胞核呈深蓝色。箭头表示真菌孢子。比例尺：1500 μm。（B）CAWS 8 mg组和对照组（CD3标记的CD3 + T细胞，CD8标记的CD8 +细胞毒性T细胞，CD86标记的CD86 + M1型巨噬细胞，F4 / 80标记的F4 / 80 +巨噬细胞和NK1.1标记的NK1.1 +自然杀伤细胞）的免疫荧光染色结果。比例尺：200 μm。（C） 评估心脏纤维化的程度。根据800倍放大倍率下视野心脏组织中三色染色面积的百分比评估心脏纤维化程度。具体方法如下：由于胶原纤维用大分子阴离子染料染成鲜绿色，在800倍放大倍率下观察100个视野（所有切片厚度为5μm），通过绿色面积占总面积的百分比来确定心脏纤维化程度。百分比越高，纤维化越严重。（D）根据免疫荧光染色结果统计分析免疫细胞百分比，***p < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。

图3：第28天PBS组和CAWS组VDAC1表达的免疫组化分析。 （A）VDAC1表达的免疫组化分析。比例尺：800 μm。棕黑色颗粒是阳性结果。（B）VDAC1免疫组化阳性细胞百分比的统计分析， p < 0.001。（C）VDAC1免疫组化H评分统计学分析。数据来自多个生物学重复（每组n = 20只小鼠），结果表示为均值±标准差并进行统计分析（***p < 0.001）。 请点击此处查看此图的大图。

图4：小鼠RAW264.7细胞吞噬白色 念珠 菌后自溶酶体的检测。 （A）箭头表示真菌孢子。比例尺：25 μm。自噬流量的变化可以通过自噬体和溶酶体共定位后合并染色的变化来评估。（B）自溶酶体形成速率的时程分析量化了相关参数。结果以均值±标准差表示并进行统计分析（***p < 0.001）。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。