建立与评估一个 白色念珠菌 水溶性提取物诱导的小鼠川崎病相关冠状动脉炎模型

摘要

CAWS诱导的小鼠模型能够有效模拟川崎病从急性炎症到慢性纤维化的进展过程，揭示其关键的病理学和免疫病理学特征，并可能促进川崎病靶向治疗策略的开发。

摘要

川崎病（KD）是一种主要影响儿童的全身性血管炎，其最严重的并发症是冠状动脉病变。在本研究中，采用水溶性提取物建立了优化的小鼠川崎病模型。 白色念珠菌 （CAWS）。采用苏木精-伊红染色和马松三色染色评估心肌炎症及相关病理改变。通过免疫荧光技术检测心脏组织中免疫细胞的浸润情况。采用免疫组化法检测心肌组织中VDAC1蛋白的表达与定位。 体外，通过将RAW264.7巨噬细胞与 白色念珠菌 孢子，以及自噬溶酶体的形成与功能通过LC3免疫荧光染色和Lyso-Tracker Red探针进行评估。通过剂量筛选确定，8 mg为诱导冠状动脉炎症的最佳建模剂量，该剂量下小鼠死亡率适中。HE染色显示，CAWS注射可稳定诱导小鼠冠状动脉病变，其特征与人类川崎病一致。Masson染色证实，CAWS组小鼠冠状动脉及主动脉周围存在显著的胶原纤维沉积，且沉积区域与炎症区域高度重合，在注射后14天与对照组相比差异具有统计学意义（p < 0.05）。 < 0.001）。免疫荧光结果显示，在造模第14天，CAWS组小鼠心肌组织中多种免疫细胞的浸润显著增加（p < 0.001）。免疫组化结果显示，在造模第28天，CAWS组小鼠心肌组织中VDAC1蛋白的表达显著上调（p < 0.001). 体外 实验表明，在感染了的巨噬细胞中 白色念珠菌 孢子在早期阶段自噬溶酶体的形成增加，而后期自噬流受阻，提示存在功能紊乱。

引言

川崎病（KD）是一种黏膜皮肤淋巴结综合征，是一种发生于5岁以下儿童的自身免疫性疾病，伴有发热性血管炎^1,2,3。研究表明，未经治疗或严重川崎病治疗疗程超过10天者，易引发严重的心血管并发症，主要包括冠状动脉瘤和冠状动脉狭窄^4,5。冠状动脉瘤破裂可能导致心源性休克甚至猝死，是儿童获得性心脏病的主要病因^6,7。尽管静脉注射免疫球蛋白的应用已显著改善预后，但其病因和发病机制仍不明确，限制了靶向治疗策略的发展^8,9。因此，建立能够准确模拟人类疾病特征的动物模型已成为当前研究的迫切需求。

目前，川崎病研究面临的主要障碍之一是缺乏能够充分模拟人类疾病病理特征的、经过充分表征的动物模型。在已建立的多种模型中，由干酪乳杆菌细胞壁提取物（LCWE）诱导的血管炎模型是一种相对成熟的体系，该模型可引发冠状动脉炎，被广泛用于研究免疫失调及特定细胞因子在类似川崎病的血管....

方案

所有涉及动物数据的研究实验均经南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会批准（批准号：KY-2024-250-01）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. CAWS 的制备

1. 根据 Duong 等人建立的方案¹⁸，将白色念珠菌（Candida albicans）接种于沙氏葡萄糖液体培养基中。然后，将接种后的培养液置于密闭厌氧培养箱中，在37 °C下以混合气体环境厌氧培养48小时。
   ​注意：为确保培养基的无菌状态，必须严格控制37 °C的厌氧培养条件，防止杂菌污染。
2. 用限碳培养基反复冲洗，并在37 °C、4.5 x g 转速条件下培养48小时。
3. 加入等体积无水乙醇，于4 °C静置过夜。
4. 在4 °C、4.5 x g 条件下离心15分钟，弃去上清液，向沉淀中加入等体积无水乙醇，4 °C下静置过夜。
5. 再次离心后，弃去上清液，向沉淀中加入50 mL丙酮，离心并干燥沉淀。将沉淀溶解于无菌生理盐水中，备用。

2. 构建川崎病小鼠模型

1. 选取80只4至6周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠，在标准饲养条件下饲养，自由摄食和饮水。
   ....

结果

首先，我们系统评估了不同剂量CAWS在小鼠中诱导的心肌病理改变。在PBS对照组、4 mg CAWS组和8 mg CAWS组中均未观察到死亡（每组n=20）。相比之下，4 mg组的炎症反应较轻，未达到建模要求。12 mg CAWS组的死亡率较高（9/20，45%），死亡发生在注射后第3至第10天。这些结果表明，12 mg剂量可引起过度的局部炎症损伤和全身毒性，因此该剂量被排除在后续研究之外。最终选择8 mg剂量作为最佳给药方案，因其可有效诱导显著的冠状动脉炎，同时维持可接受的存活率和最少的局部不良反应。（图1A）最终确定腹腔注射8 mg CAWS为最佳建模剂量。实验组的HE染色结果显示了炎症与纤维化典型的动态过程：第3天出现以血管周围中性粒细胞和单核细胞为主的局灶性炎性浸润；第7天炎症范围扩展至心肌间质，伴有明显的心肌细胞肿胀和间质水肿；第14天炎症达到高峰，出现心肌纤维排列紊乱和局灶性坏死；第28天尽管炎症有所缓解，但已形成早期纤维化（图1B 和

讨论

川崎病（KD）中的冠状动脉瘤（CAA）和心肌纤维化是导致长期心血管事件的主要原因。尽管在急性期治疗方面已取得进展，但仍有约5%的患者会发展为持续性冠状动脉瘤^28,29。这种延迟性病理改变的机制尚不明确，迫切需要建立动物模型以揭示其动态过程³⁰。由于人类川崎病患者的心脏组织样本极为有限，且临床研究难以对冠状动脉和心肌的长期变化进行动态追踪，因此迫切需要一种能够模拟从急性血管炎到慢性纤维化整个过程的动物模型，以阐明其潜在机制并探索干预策略^16,30。

本研究采用CAWS诱导的小鼠血管炎模型，系统模拟了川崎病（KD）急性炎症期和慢性纤维化期的动态演变过程。该模型的建立为研究川崎病的免疫病理机制提供了新的视角。通过免疫荧光染色，我们观察到在CAWS诱导的模型中，冠状动脉及心肌组织中多种免疫细胞的浸润显著增加，这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一种山羊来源的兔IgG Alexa Fluor 488二抗	abcam	ab15081	一种山羊来源的兔IgG Alexa Fluor 488二抗
厌氧培养箱	Thermo Scientific	Thermo Scientific	厌氧培养箱
苯胺蓝	Solarbio	G3668	苯胺蓝
anti-LC3	abcam	ab192890	LC3一抗
生物安全柜	Thermo Scientific	1500	生物安全柜
BSA	Solarbio	A8020	BSA
白色念珠菌（菌株）	NBRC	1385	白色念珠菌（菌株）
CD3e	BD Bioscience	561827	FITC仓鼠抗小鼠CD3e(145-2C11)
CD86	BD Bioscience	105013	CD86
CD8a	BD Bioscience	100713	CD8a
细胞培养箱	Thermo Scientific	311	细胞培养箱
离心机	Thermo Scientific	ST4R Plus	离心机
共聚焦显微镜	Olympus	IX73	共聚焦显微镜
DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131-25ml	DAPI
DMEM	Gibco	11965126	DMEM
包埋机	P.S.J MEDICAL	BM450A	包埋机
伊红	Solarbio	G1100	伊红
F4/80	BD Bioscience	123109	F4/80
FBS	Gibco	16000044	FBS
甲醛	Solarbio	P1110	甲醛
全自动组织脱水机	Leica Biosystems	ASP3005	全自动组织脱水机
玻璃载玻片	Citotest	250124A1	玻璃载玻片
H&E染液	Beyotime Biotechnology	C0105M	H&E染液
IHC试剂盒	Absin Biotechnology	abs996-5ml	IHC试剂盒
LC3探针	Beyotime Biotechnology	C3018M	LC3探针
低剖面切片刀	Thermo Fisher	3052835	低剖面切片刀
溶酶体探针	Beyotime Biotechnology	C1046	溶酶体探针
标记笔	Deli	SK109	标记笔
Masson染液	Beyotime Biotechnology	C0189M	Masson染液
切片机	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	切片机
中性树胶	Solarbi	G8590	中性树胶
NK1.1	BD Bioscience	561117	NK1.1
光学显微镜	Nikon	Nikon	光学显微镜
石蜡	Solarbio	YA0012	石蜡
石蜡	Solarbio	YA0012	石蜡
PBS	Solarbio	P1020	PBS
磷钼酸	Solarbio	G3472	磷钼酸
VDAC1	Abcam	ab34726	抗VDAC1抗体