利用基于成像的染色质与表观遗传衰老生物标志物测量单细胞衰老

摘要

本方案介绍了提取和验证基于成像的染色质与表观遗传年龄（ImAge）的成像与计算工作流程。

摘要

为了推进个性化医疗并评估潜在的 rejuvenation（恢复活力）策略，能够反映生物年龄的生物标志物至关重要。我们提出了基于成像的染色质与表观遗传年龄（ImAge），这是一种基于单个细胞核内染色质空间组织和表观遗传标记所衍生的成像型生物标志物，可捕捉内在的与年龄相关的变化。ImAge 能有效捕捉并量化调节生物年龄干预措施的影响，在采用恢复活力策略（如热量限制以及通过短暂表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc（OSKM）进行部分重编程）后显著降低，而在化疗等处理后则显著升高，显示出高度敏感性。此外，较低的 ImAge 与较高的运动活性相关，表明其不仅反映生物年龄的逆转，还能捕捉功能上的改善，因而为评估长寿干预提供了一种有前景的单细胞工具。由于 ImAge 是一种整合性方法，需要高质量的成像数据以及精细的计算分析，因此我们旨在提供详尽的操作指南以提取和验证该指标。本综合实验方案将详细阐述湿实验流程（样本制备与成像）以及开源计算流程（环境配置与成像数据处理）的正确使用方法，以实现 ImAge 的提取与验证。

引言

随着平均寿命的延长和全球人口老龄化加剧，对功能性或生物学年龄的有效生物标志物的需求日益凸显^1,2,3。这些生物标志物对于准确预测疾病风险和寿命至关重要，可显著改善老年医学护理并降低相关成本。尽管DNA甲基化（DNAm）时钟在量化生物学衰老方面已取得显著进展^4,5,6，但其通常依赖线性回归方法，并需要大规模队列数据，可能忽略个体特异性的、细微且依赖于具体生物学背景的成分^7,8。此外，这类基于测序的技术需要细胞裂解、复杂的样本制备过程，且每个细胞均需使用昂贵的试剂，导致成本较高，在需要高通量、大规模或纵向研究的应用中，样本破坏性成为其主要局限⁹。

为了克服这些局限性，我们开发了基于成像的染色质和表观遗传年龄（ImAge）技术，这是一种旨在以单细胞分辨率量化衰老与 rejuvenation（重编程）的新方法。该技术已在小鼠外周血及多种实体器官中得到应用和验证，相关研究由 Alvarez-Kuglen 等人¹详细描述。本文详细阐述了优化后的实验方案，以便其他研究人员能够根据需要将其适配并应用于各种研究场景。

该方法与传统的DNA甲基化时钟有本质区别，其基于单个细胞核内染色质的空间组织和表观遗传标记来捕捉内在的、与年龄相关的动态轨迹¹。基于成像的技术具有显著优势：它本质上是非破坏性的，意味着细胞在处理过程中不会被破坏，而测序方法则通常会破坏细胞。这种非破坏性特征至关重要，因为它能够在单细胞水平上保留染色质和表观遗传标记的空间结构，维持细胞在组织中的空间背景——而这一信息在传统的测序流程中常常丢失。此外，成像技术通常在大规模或纵向研究中更具成本效益，因为它不需要为每个细胞使用昂贵的试剂或进行复杂的文库构建，因而适用于随时间推移的重复观察^10,11。

ImAge 的一个关键优势在于，它能够揭示与年龄相关的轨迹，这些轨迹是数据本身固有的主要特征，无需对实际年龄进行回归分析。ImAge 在小鼠外周血单个核细胞及多种实体器官中均表现出与实际年龄的高度相关性¹。尤为重要的是，ImAge 能有效捕捉生物年龄的预期扰动：在化疗处理后显示升高，而在热量限制以及通过瞬时表达 OSKM 实现部分重编程的情况下，肝脏和骨骼肌中的 ImAge 水平则下降。此外，在实际年龄相同的小鼠中，ImAge 的读数被观察到与运动活动能力呈负相关，表明其在衡量生物年龄和功能年龄方面具有应用价值。

实施ImAge方法需要具备湿实验操作¹²和计算分析¹（图1）两方面的专业知识；因此，本文提供了这两个方面的全面、逐步操作方案。该优化后的实验流程旨在促进ImAge方法的广泛应用，使研究人员能够在单细胞分辨率下研究多种细胞类型和组织中与年龄相关的染色质及表观遗传结构变化。在本方案中，选择了H3K27ac和H3K27me3这两个能够为ImAge测定提供足够对比度和分辨率的标志物作为代表性标记。研究人员可沿用本方案来量化生物衰老程度、评估长寿干预措施的影响，并在个体水平上探索衰老与重编程过程中的内在异质性。

方案

所有动物实验均按照斯克里普斯研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的指南和方案（方案编号 09-0004-6）进行。本论文中展示的数据均来自雄性 i4F 小鼠，年龄范围为 2 至 14 个月。用于实验的器官（肝脏和骨骼肌）取自经低剂量多西环素（0.2 mg/ml）处理 1 周的 13.8 月龄 i4F 小鼠及其同窝对照小鼠¹⁴。细胞核样本来自年轻小鼠（3.2 个月）、年老小鼠（13.8 个月）以及经多西环素处理以过表达 OSKM 因子的年老小鼠（aged-OSKM）。

1. 样品成像

1. 样品制备
   1. 从刚解剖的小鼠（或其他目标物种）中取出目标器官（肝脏和骨骼肌），并用液氮速冻。将样品储存于 -80 °C，待使用时取出。
   2. 将器官和组织转移至预冷的研钵中，并置于干冰上。向冷冻组织上倾倒液氮，使用预冷的研杵进行研磨。持续用预冷的研钵和研杵研磨，直至获得均匀细腻的粉末。
   3. 使用预冷的金属刮勺将研磨后的组织分装至多个离心管中，未使用的样品储存于 -80 °C。
      注：研磨后的组织样品可长期保存于 -80 °C，或直接进行细胞核分离。
   4. 使用市售的细胞核裂解缓冲液试剂盒，按照制造商说明书从冷冻分装样品中提取细胞核。
   5. 使用台盼蓝对细胞核进行计数。在另一离心管中将细胞核与台盼蓝按等体积混合。取 10 µl 细胞核-台盼蓝混合液，加入血细胞计数板或自动细胞计数仪中。
   6. 用 PBS + 0.5% BSA 稀释样品，使每孔可接种 10,000 个细胞核，接种体积为 20–30 µL/孔。
2. 接种准备
   1. 将所有与接种准备和计算分析相关的元数据录入“接种图谱”（见补充文件 1）。在 sampleID 标签页中，按照实际孔板的布局记录样品标识符（如数字或字符）。在 condition 标签页中，同样按照实际孔板布局记录实验条件，包括样品的年龄。
      注：condition 标签页中提供的信息将用于识别每个样品的年龄组别（即年轻或年老）。这些识别出的年龄组别将作为构建衰老（ImAge）预测模型的参考依据。因此，condition 标签页必须包含可与年龄相关联的数据，以及必要时的其他相关实验条件。
   2. 在 channel#（# 替换为数字）标签页中，按照实际孔板布局记录目标生物标志物（如 H3K27me3）。确认所有元数据组合匹配无误，并在 platemap 标签页中以连续表格形式正确呈现。
      注：表格中的每一列应对应一个指定的标签页名称（如 "sampleID"）。另提供一个名为 "metadata" 的标签页，用于记录项目目标和染色细节；该信息不会用于数据分析。可根据需要使用此标签页。
   3. 将 platemap 标签页导出为 csv 文件格式，并使用简短且具有描述性的项目名称命名（如 project.csv）。
      注：metadata 标签页提供了一个模板，用于汇总项目目标和免疫染色信息。在接种过程中，Platemap 模板中的 metadata 标签页为可选使用。但 sampleID、channel#（# 替换为数字）等其他标签页是进行计算分析所必需的。
3. 在孔板（如 384 孔板）中每孔接种 10,000 个细胞核，接种体积为 20–30 µL。在 4 °C 下以 1,000 × g（加速度 9，减速度 4）离心 10 分钟。
4. 加入等体积的 8% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液固定，室温孵育 10 分钟。
   警告：PFA 操作应在通风橱中进行，并按照机构安全规程处理废弃物。
5. 移除溶液。加入 30 µL PBS 配制的 0.1 M 甘氨酸，室温孵育 5 分钟。移除溶液后，用 100 µL PBS 洗涤 2 次，最后加入 30 µL PBS 用于储存。
   注：细胞可储存于 4 °C，或立即进行免疫标记。
6. 免疫标记
   1. 移除 PBS。加入 30 µL 封闭液（含 2% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 PBS），室温孵育 1 小时。移除封闭液。
   2. 加入 25 µL 一抗：Mouse anti-H3K27ac（1:250）和 Rabbit anti-H3K27me3（1:250），用封闭缓冲液（0.4–2 µg/mL）稀释。4 °C 过夜孵育。
   3. 移除一抗溶液。用 100 µL PBS 室温洗涤 3 次，每次 3 分钟。
   4. 加入 25 µL 二抗：Alexa 488 Donkey Anti-Mouse（1:250）和 Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit（1:250），用封闭缓冲液（1–10 µg/mL）稀释。4 °C 孵育 2 小时，或室温孵育 1 小时。
   5. 用 100 µL PBS 室温洗涤 3 次，每次 3 分钟。加入 DAPI/Hoechst 染色，浓度为 0.01 mg/mL，体积为 30 µL。再用 100 µL PBS 洗涤。
      注：将孔板用铝箔包裹后储存于 4 °C，或立即进行成像。DAPI/Hoechst 染色是细胞核分割步骤所必需的。
7. 成像
   1. 使用高内涵成像仪进行细胞成像，以获得最高分辨率（本数据集使用 20x 物镜，但推荐使用 63x）。
      注：尽管可使用任意高内涵成像仪，本方案假设图像采集后采用扁平文件夹结构，且输出图像格式为通用格式（如 .tiff）（图 2）。
   2. 每孔采集多个视野和多个 z 轴层叠图像，理想情况下应覆盖细胞核的顶部到底部。沿 z 轴 10 µm 的覆盖范围（例如，0.5 µm 步长，共 20 层 z 切片）通常足以覆盖大多数小鼠细胞核。所需尺寸和覆盖范围取决于目标物种和细胞类型。代表性成像结果见 图 3。
   3. 将成像数据转移至用于计算分析的计算机中，文件夹结构应遵循 图 2 所示。
   4. 将步骤 1.2.2 中定义的项目名称前缀加上方括号标注，添加至图像数据文件夹名中（例如，[project]original_folder_name）

2. 成像数据的计算分析

1. 系统软件需求准备（仅初始设置时需要）
   1. 如果在 Windows 计算机上操作，请按照 https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install 的说明安装 Windows 子系统 for Linux (WSL)。请按照 https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main 的说明安装 Anaconda 或 Miniconda。
2. 计算环境准备（仅初始设置时需要）
   1. 从 GitHub 仓库下载工作流程脚本 https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow。解压下载的文件。
      注意：数据存储位置可任意指定；但建议选择与系统文件存储位置（例如 Windows 上的 C 盘）不同的目录。
   2. 整理克隆的 ImAge 仓库，使其符合脚本正确执行所需的文件夹结构（图 2）。
   3. 如果在 Linux 或 macOS 上操作，请打开终端应用程序；如果在 Windows 上操作，请打开 WSL 应用程序。
   4. 将当前目录切换至克隆的仓库文件夹。此后，“命令：”表示将后续代码复制粘贴到终端应用程序中，然后按 Enter 键。
      命令：cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      注意：请将 "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" 替换为用户特定的路径设置。例如，若仓库解压在 D 盘的 "analysis" 文件夹中，并通过 WSL 访问，则应为 "/mnt/d/analysis"。
   5. 使用 conda（随 Anaconda/miniconda 安装的命令行工具）创建 Python 3.10 版本的新计算环境。
      命令：conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. 激活新创建的环境。
      ​命令：conda activate ImAge_workflow
   7. 使用 pip 安装程序（在创建 ImAge_workflow 环境时已安装的 Python 包安装工具）安装 poetry（Python 包管理器）。
      ​命令：pip install poetry
   8. 使用 poetry 安装所需的 Python 软件包。
      命令：poetry install
      ​警告：请确保当前目录为 ImAge_workflow 文件夹，可通过运行命令 pwd 进行验证。
   9. 在 Conda 环境中配置 CUDA，以在分割步骤中启用图形处理单元（GPU）功能，从而加快计算速度（仅适用于配备 Nvidia GPU 的 Linux 或 Windows 计算机）。
      命令：mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia;print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; do if [ -d "$dir/lib" ]; then export LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      ​注意：脚本会自动检测服务器上的 GPU 可用性。若无可用 GPU，将默认在 CPU 上运行。
3. 按以下说明运行计算。
   注意：计算分析包括四个步骤：细胞核分割、图像特征提取、衰老（ImAge）轴构建以及 ImAge 预测。每个过程均通过 Python 脚本执行：o1_illumination_correction、o2_segmentation、o3_extract_features 和 o4_ImAge_validation。所有这些步骤均包含在一个 Python 脚本 main.py 中。提取的 ImAge 读数可通过箱形图和小提琴图进行可视化（如 图 4 所示）。ImAge 读数也可导出为简单的表格格式（标准 .csv 文件格式），其中样本作为行，相应的读数和元数据作为列。用户可根据需要对 ImAge 读数进行额外的数值分析。这些图表和 CSV 文件可通过一个 Python 脚本 visualization.py 获得。ImAge 预测过程利用来自同一组织内单个细胞的自举信号。这些自举信号是通过对随机采样进行重复迭代得到的平均信号。该方法旨在确保分析捕捉到最可靠且具有代表性的读数，其分析不确定性与组织固有的异质性成正比。
   1. 如果在 Linux 或 macOS 上操作，请打开终端应用程序；如果在 Windows 上操作，请打开 WSL 应用程序。
      命令：cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ​警告：请确保当前目录为 ImAge_workflow 文件夹，可通过运行命令 pwd 进行验证。
   2. 激活环境。
      ​命令：conda activate ImAge_workflow
   3. 在代码或文本编辑器（例如记事本应用程序、Microsoft Visual Studio Code 等）中配置 workflow/main.py 文件中的分析参数。
      1. 将变量 p 设置为一个简短、文件系统安全的标识符，用于组织输出（例如 p = brain_3ages_k27me3）。
      2. 在 chs 中设置用于特征提取的通道列表。如果需要从该通道获取特征用于分析，则包括分割通道（chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']）。
      3. 使用 imageIndex 将图像通道标识符从文件名映射到板图（platemap）列。确定成像系统用于获取图像数据的通道标签格式，并将该标签用作键。将每个标签映射到步骤 1.2.2 中保存的板图文件中确切的、区分大小写的列标题（例如 imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}）。
         警告：列名区分大小写，必须与您的板图文件一致。
      4. 设置数据位置：orgDataLoadPath 指向数据集根目录，如有必要，orgDataSubFolder 指向图像子文件夹，resultsSavePath 指向输出根目录。
      5. 确认 imageFileFormat 中的文件名扩展名，并编辑 imageFileRegEx，使用 Python 命名捕获组表示所有必需部分：row、col、field、zposition 和 channel。使用以下语法：(?P<GROUP>\d+)，其中 GROUP 替换为 row、col、field、zposition 或 channel。
         注意：如果文件名不同，请更新正则表达式；所有命名组必须能正确解析。例如，文件名 r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff 应转换为以下形式：r(?P<raw>\d+)c(?P<col>\d+)f(?P<field>\d+)p(?P<zposition>\d+)-ch(?P<channel>\d+)sk1fk1fl1\.tiff。
      6. 将 segmentation_ch 设置为用于对象检测的核通道（例如 segmentation_ch = 'DAPI'）。
      7. 通过设置 illumiCorrection 决定是否使用照明校正。设为 True 以计算并应用 BaSiC 模型；设为 False 以处理原始图像。
         注意：对于包含 ≥ 25 个孔的板，建议进行照明校正以减少系统性偏差。
      8. 以微米为单位设置物理体素尺寸 voxel_dim，格式为 [z, y, x]。使用显微镜元数据确定间距（例如 voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6]）。验证每个参数后保存文件并关闭编辑器。
   4. 运行脚本以获取 ImAge 读数并执行验证。运行脚本期间，请勿关闭终端或 WSL 应用程序。
      命令：Python workflow/main.py
      注意：该脚本（main.py）默认包含所有步骤，包括分割、特征提取、ImAge 轴构建和预测。脚本将为每个步骤（例如细胞核分割）生成预计完成时间。每个过程（例如 o1_illumination_correction）将生成 .pickle 格式的中间文件，其中包含各过程的结果。然而，这仅用于进程间的数据传递，以确保标准化处理，本文中不建议用户直接操作这些文件。尽管如此，如果用户需要操作或采用这些文件，请参阅每个 Python 函数中包含的文档以了解数据形状和类型¹³。
   5. 可视化结果，并将原始 ImAge 读数导出以供外部软件进行进一步分析。命令：Python workflow/visualization.py
      注意：此步骤生成 ImAge 读数的图表和表格，文件分别位于 fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN 和 export_o4_ImAge_validation 文件夹中（图 2）。

结果

代表性图像应具有足够的细胞密度以获得单个细胞，但各个细胞核之间不应相互接触，否则会降低细胞核分割的质量。图3展示了获得可靠计算分析结果的代表性成像效果。

本方法论文中所述结果改编自Alvarez-Kuglen等人发表的ImAge研究论文¹。ImAge成功检测到通过OSKM在体（in vivo）诱导的局部重编程所实现的衰老逆转（图4）。研究分析了i4F小鼠的肝脏和骨骼肌组织，这是一种经基因工程改造的小鼠模型，可诱导表达OSKM因子。这些小鼠接受了低剂量多西环素处理，从而在i4F小鼠中触发OSKM的表达¹⁴。根据本实验方案所述方法，对年轻小鼠（3.2个月）、老年小鼠（13.8个月）以及经多西环素处理的老年小鼠（old-OSKM）的细胞核进行免疫标记和成像。年轻组与老年组样本之间ImAge存在显著差异，而old-OSKM组的ImAge较老年组降低，但高于年轻...

讨论

样品制备
进行样品制备时，应迅速采集目标组织并立即在液氮中速冻。使用研钵和研杵研磨组织时，可使用研钵硅胶盖以防止样品损失。若组织难以粉碎，可添加更多液氮。对于较脆弱的组织，也可直接使用新鲜样品（而非冷冻样品）进行处理，以减少机械破坏或组织损伤。细胞核分离方案可能需要根据组织类型进行优化；请参考生产商的说明书。在分离并计数细胞核后，确保在384孔板中每孔的加样体积至少为20 µL，以完全覆盖孔底并保证分布均匀。

铺板准备
将细胞核悬浮于含0.5% BSA的PBS中；对于完整细胞，使用培养基以提高存活率。保持样品置于冰上，并将悬浮液加入每孔中央，避免在边缘聚集。离心前将离心机预冷至4 °C。较慢的减速有助于防止细胞核移向边缘，但会延长转子停止时间。应优化减速参数，以平衡处理时间与样品完整性。通过分批处理样品，尽量缩短铺板与固定之间的时间间隔。固定和淬灭步骤应按照方法中所述保持一致，确保所有样品的表位可及性无差异。一旦完成固定，同一块板可多次离心。避免使用超过1000 × g 的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647
驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa 488	Invitrogen	A-21202
驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa 555	Invitrogen	A-31572
甘氨酸	Bio-Rad	161-0718
组蛋白H3K27ac抗体（单克隆抗体）	Active Motif	39685
组蛋白H3K27me3抗体（多克隆抗体）	Active Motif	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	NUC101
Operetta CLS 高内涵成像系统	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
16% 甲醛水溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	15710-S
PBS	Thermo Fisher	AM9624
PhenoPlate 384孔微孔板	Revvity	6057302
Triton-X	Sigma	T8787
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061