体感神经元神经元膜蛋白酶体细胞亚型特异性分析

Summary

神经元膜蛋白酶体 （NMP） 最近在体感神经元的一个子集中被鉴定为触觉、疼痛和瘙痒感知的关键调节因子。本文介绍了使用细胞分选、转录组分析和基于培养的免疫荧光分析分析细胞类型特异性 NMP 表达和功能的强大工作流程。

Abstract

感觉神经元信号传导取决于功能性蛋白酶体，其亚细胞定位影响功能。最近在外周体感神经元亚群中发现了一种特殊的蛋白酶体复合物，即神经元膜蛋白酶体 （NMP）。NMP 仅定位于体细胞的质膜以及近端和远端轴突。单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，在正常条件下，NMP主要在MrgprA3⁺和Cysltr2⁺神经元中表达，介导机械、瘙痒和疼痛感。小鼠爪子皮肤中的急性、选择性NMP抑制降低了机械和疼痛敏感性，而不影响热感觉。值得注意的是，与整体蛋白酶体抑制不同，选择性 NMP 抑制不会引起神经病变。体外研究表明，NMP 可能通过信号肽的释放促进神经元与神经元之间的通讯，并且对于神经元对刺激的正常反应至关重要。这些发现确定 NMP 是正常触摸、疼痛和瘙痒感所需的感觉神经元串扰的关键调节因子。因此，NMP 代表了疼痛管理的潜在目标。本文介绍了使用抗体饲养和荧光激活细胞分选（FACS）分离表达NMP和非NMP表达的神经元群的方法。这些群体适用于通过 scRNA-seq 或基于培养的 NMP 表达动力学分析进行细胞类型特异性表达谱分析。这些方法共同为研究 NMP 表达动力学及其对疼痛相关疾病状况的贡献提供了强大的工作流程。

Introduction

蛋白酶体功能对于周围神经系统（PNS）1,2,3,4,5,6的最佳发育和维持至关重要。使用蛋白酶体抑制剂的体外和体内研究表明，蛋白酶体活性对于神经发育、髓鞘形成、兴奋性和神经胶质细胞功能至关重要 7,8,9,10。此外，基于蛋白酶体抑制剂的化疗会在 30-60% 的患者中诱发疼痛性神经病变，通常以慢性疼痛和四肢感觉改变为特征 8,9,11,12,13。有趣的是，这些相同抑制剂的低剂量给药会降低对疼痛刺激的敏感性，这表明蛋白酶体在^{感觉处理中}具有复杂的作用^6,14,15。然而，尽管进行了这些广泛的研究，但人们对蛋白酶体在PNS中的具体功能仍然知之甚少。

蛋白酶体是生命所有领域中的主要蛋白质降解机制，对于维持蛋白质稳态至关重要¹⁶。20S核心蛋白酶体由α、β、β α亚基的四个七聚体环组成，介导非凡素蛋白降解^17,18。与调节颗粒结合形成 26S 和 30S 加帽蛋白酶体，介导泛素依赖性蛋白质降解 ^4,17。在神经元中，蛋白酶体已在所有细胞区室中被鉴定出来，并且已知它们的亚细胞定位会影响功能¹⁹。然而，许多常用的蛋白酶体抑制剂缺乏选择性靶向差异定位蛋白酶体群体的特异性。

事实上，在非透膜细胞中使用膜不渗透蛋白酶体抑制剂和抗体标记，发现神经元特异性蛋白酶体复合物定位于体感神经元子集中的质膜²⁰。通过针对蛋白酶体亚基的抗体喂养和FACS分选，将原代背根神经节（DRG）神经元分离为NMP ⁺和NMP^-群体的scRNA-seq分析，产生了20个转录不同的细胞簇²⁰。进一步分析表明，NMP⁺ 细胞仅聚集到 20 个簇中的 3 个。使用特定神经元亚型的基因标记集，鉴定了 13 种不同的体感神经元亚型²⁰。大多数NMP⁺神经元与MrgprA3⁺和Cysltr2⁺感觉神经元聚集在一起²⁰.极少数的 NMP⁺ 细胞聚集到第三个簇中，其中没有识别出特定的基因集，因此该簇未分配²⁰。MrgprA3⁺和Cysltr2⁺神经元是C型伤害感受器，对热，机械和致痒刺激敏感，分别对应于CGRP-θ和SST神经元亚型，^21,22。在已鉴定的 20 个细胞簇中，7 个 NMP ^簇表达与非神经元细胞一致的基因标记，包括雪旺细胞、卫星胶质细胞和免疫细胞，并且也未分配²⁰。这些细胞群是意料之中的，因为在DRG神经元培养过程中不可能将非神经元细胞与神经元细胞分离²⁰。

研究其功能，体外抑制NMP改变了神经元对KCl，组胺和αβ-亚甲基腺苷5'-三磷酸刺激的兴奋性²⁰。在体内，NMP 抑制降低了对机械和疼痛刺激的敏感性，而对热感觉没有影响²⁰。这些发现表明，NMP 是机械感、疼痛感和瘙痒感的关键调节因子，也是疼痛管理的潜在治疗靶点²⁰。然而，在不同疾病背景下将 NMP 活性与疼痛发展联系起来的具体机制仍然知之甚少。因此，有必要进一步研究 NMP 在疼痛和神经病变相关疾病中的表达动力学和功能。

在这里，本文描述了用于识别和分离 NMP⁺ DRG 神经元群的稳健工作流程（图 1）。这种方法能够使用 FACS 分选、scRNA-seq 和免疫染色对 NMP 表达动力学进行细胞类型特异性研究。这些方法能够以细胞类型特异性方式对 NMP 表达进行高分辨率分析，可用于研究 NMP 在正常和各种疼痛相关疾病中的作用。

Protocol

使用实验动物描述的所有方法均已获得芝加哥洛约拉大学斯特里奇医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 消解液、DRG 培养基和 FACS 培养基的制备

1. 制备含有 137 mM NaCl、5.3 mM KCl、1 mM MgCl₂·6H₂O、25 mM 山梨糖醇、10 mM HEPES 和 3 mM CaCl₂·2H₂O 的完全盐水溶液 （CSS）。用 NaOH 将 pH 值调节至 7.2 并过滤灭菌。
2. 通过混合 190 μL 储备液（H₂O 中的 5 mg/mL）、84 μL 50 mM EDTA 和 6.5 mL CSS 制备组织解离酶混合物工作溶液（适度研磨）。使用前新鲜准备并过滤灭菌。
3. 制备含有 190 μL 酶混合储备溶液、150 μL 木瓜蛋白酶、84 μL 50 mM EDTA 和 6.5 mL CSS 的组织解离酶混合物（低研磨）-木瓜蛋白酶溶液。使用前新鲜准备并过滤灭菌。
4. 通过将 7.5 mg 胰蛋白酶抑制剂和 7.5 mg BSA 混合在 5 mL DMEM/F12 培养基中来制备 BSA/TI/DMEM 溶液。新鲜准备并过滤灭菌。
5. 通过将 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉素/链霉素、1% 谷氨酰胺和 2% 50x B27 补充剂混合在 430 mL DMEM/F12 中来制备 DRG 神经元培养基。
6. 通过在高压灭菌水中混合 1% FBS、1x PBS、25 mM HEPES 和 1% 青霉素/链霉素来制备 FACS 缓冲液。新鲜准备并过滤灭菌。
7. 在方案开始前 24 小时，通过用 FACS 缓冲液填充并置于 4°C 来涂覆两个 5 mL 聚苯乙烯圆底管。

2. 单细胞DRG神经元悬液的制备

1. 按照先前描述的方法^20,23从4-6只P20-P23小鼠中收获所有DRG。
2. 将DRG转移到15mL锥形管中，并加入7mL组织解离酶混合物（中度研磨）工作溶液。在37°C下轻轻搅拌（通过旋转）孵育20分钟。
3. 以 120 × g 旋转神经节 2 分钟。小心地除去上清液，不要干扰沉淀，并将神经节重悬于7mL组织解离酶混合物（低研磨）-木瓜蛋白酶工作溶液中。在37°C下轻轻搅拌（通过旋转）孵育15分钟。
4. 以 120 × g 旋转 2 分钟。除去上清液并将神经节重悬于 500 μL BSA/TI/DMEM 溶液中。
5. 用 1 mL 封闭的火抛光玻璃巴斯德移液器研磨神经节 12-16 倍。
6. 通过将细胞通过 40 μm 细胞过滤器过滤掉细胞碎片。用 1 mL BSA/TI/DMEM 溶液洗涤过滤器，以确保收集所有 DRG 神经元。将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。
7. 以 120 × g 旋转 2 分钟。除去上清液并将沉淀轻轻重悬于 1 mL DRG 培养基中。
   注意：这是单细胞DRG神经元悬浮液。

3. 抗体喂养标记NMP阳性神经元

1. 将 DRG 神经元悬液分成两个 1.5 mL 管，每个管含有 500 μL，并标记两个管：“初级”和“无初级”。
2. 将 20 μL 山羊抗蛋白酶体 20S 亚基 α 2 （PSMA2） 抗体加入“一级”标记管中（1：25 稀释）。
   1. 可选：为了测试PSMA2抗体的膜完整性和特异性，包括与鸡抗神经丝重链（NF-H）（1：1,000）孵育的初级DRG的额外样品，然后是抗鸡（例如，488偶联）次级（1：250）（步骤3.10）。
      注意：如果神经元膜完好无损，抗NF-H标记对照不应导致细胞标记。
3. 在37°C下轻轻搅拌下孵育细胞30分钟。
4. 在一抗孵育期间温过滤、灭菌的 1x PBS。
5. 将试管以 200 × g 离心 2 分钟，并除去 90% 的上清液（丢弃）。
6. 将神经元重悬于 500 μL 温热的 1x PBS 中。在37°C下轻轻搅拌孵育试管3分钟。
7. 重复步骤 3.5-3.6，总共洗涤 3 次。
8. 在洗涤步骤进行时，通过在 1,000 μL 温热 DRG 培养基（1：250 稀释度）中稀释 4 μL 抗山羊 IgG（555 nm 荧光团）来制备二抗。
9. 第三次洗涤后，将“一抗”和“无一抗”管重悬于 500 μL 二抗溶液中。
   注意：从这一点开始，用铝箔包裹管子来保护它们免受光线照射。
10. 在37°C下轻轻搅拌孵育管40分钟。
11. 通过重复步骤 3.5-3.6 洗涤细胞，总共洗涤 3 次。
12. 第三次洗涤后，将神经元重悬于 300 μL FACS 缓冲液中。将重悬的细胞转移到单独的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，并放在带盖的冰桶中冰上以避光。
13. 将前一天含有FACS缓冲液的预处理圆底管与含有细胞的管一起放入冰桶中，然后进行FACS分选步骤。

4. 通过FACS分选分离NMP阳性（NMP⁺）和NMP阴性（NMP^-）神经元

1. 在抗体喂养和标记DRG神经元后，立即将细胞和包被管带到FACS分选机。
2. 将 7-氨基放线菌素 D （7-AAD） （1：1,000） 添加到“初级”和“无初级”试管中。在冰上孵育10-30分钟。
   注意：7-AAD用于从分选过程中排除死细胞。
3. 从包被过夜的试管中取出 FACS 缓冲液，并用 1 mL 新鲜的 FACS 缓冲液替换。这些管用作分选神经元的收集管。
4. 使用“无初级”标记管为未标记的神经元设置参数和门控。
5. 应用前向散射（FSC）门控来分离与感觉神经元大小一致的细胞。感觉神经元直径范围为 10 至 50 μm。
6. 应用侧向散射 （SSC） 门控以排除死细胞和碎片（下侧散射）并隔离与 DRG 神经元粒度一致的事件（较大的侧向散射）。
7. 加载“初级”试管并设置使用“无初级”样品建立的门控参数，以检测未标记 （NMP^-） 和 555 阳性 （NMP⁺） 神经元群。
8. 使用100μm喷嘴和15-20psi的分选压力，将神经元分选为555⁺和555^-。
9. 继续对分选的神经元进行下游分析。

5. NMP⁺和NMP^-神经元的单细胞RNA测序

1. 将分选的细胞转移到 1.5 mL 试管中并置于冰上。将细胞转运到单细胞测序核心。
2. 对NMP⁺和NMP^分选神经元进行单细胞RNA测序，每个细胞30,000至100,000个read的深度。
3. 使用各种免费提供的软件程序分析 scRNA-seq 数据，以根据特定的基因表达谱生成细胞簇。有关先前使用的分析步骤和程序的更多详细信息，请参阅 Villalón Landeros 等人 ²⁰。
4. 构建特定基因标记列表，以使用可用数据库（例如 https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ 或 https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all）识别单个神经元群
5. 使用特定基因标记列表来识别生成的细胞簇。
   注意：之前进行的 scRNA-seq 分析是由一家独立咨询公司 （www.cmcherryconsulting.com） 进行的。

6. 富集NMP⁺和NMP^-神经元的原代培养

1. 实验前一天，将 12 毫米圆形盖玻片放入 24 孔培养板（1 个盖玻片/孔）中，并用 70% 乙醇洗涤 15 分钟。然后，用无菌水冲洗 3 次，并在无菌组织培养罩中风干。
2. 盖玻片干燥后，涂上 0.1 mg/mL 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 （PLL），并在 4°C 下放置过夜。
3. 在实验当天，取出PLL，用无菌水冲洗盖玻片3次，然后在组织培养罩中干燥。
   注意：PLL 可以保存和重复使用。
4. 在 125 μL DRG 培养基中稀释 10 μL 1 mg/mL 层粘连蛋白，并在每个盖玻片的中心点 20-30 μL。
5. 使用前在盖玻片上涂上层粘连蛋白至少 40 分钟。
6. 将FACS分选的细胞转移到1.5mL管中，并以200× g 离心5分钟以收集细胞。除去上清液并将神经元重悬于 50 μL 温热的 DRG 培养基中。
7. 从盖玻片中吸出层粘连蛋白，让盖玻片干燥。
8. 在每个盖玻片上接种 15-20 μL 重悬神经元。小心地将带有接种盖玻片的板移至组织培养箱中，孵育至少30分钟（不超过1小时），以使细胞粘附。
9. 将板移回组织培养罩中，并将 1 mL 无菌温热 DRG 培养基添加到盖玻片上含有细胞的每个孔中。
   注意：将移液器吸头降低到孔的底角并缓慢分配，以避免接触盖玻片并破坏细胞。添加培养基太快会产生湍流并移位细胞。
10. 将培养物保持在 37 °C，湿度为 5% CO₂/95%，每 2-3 天更换 75% 培养基。

7. 细胞类型特异性NMP表达分析

1. 准备一个 140 毫米培养板或免疫荧光染色托盘，用一大块封口膜衬里。
2. 使用无菌 5/45 镊子，将盖玻片从组织培养皿转移到染色盘上的封口膜上，确保包含 DRG 神经元的一侧朝上。
3. 将 100 μL DRG 培养基添加到封口膜上的每个盖玻片中，以防止细胞变干。
   注意：通过在盖玻片边缘缓慢移液来添加液体。
4. 在温热的DRG培养基中以1：20的稀释度稀释山羊抗PSMA2一抗。
5. 使用装有 P10 未过滤吸头的吸气器，从边缘吸出，缓慢地从盖玻片上取出介质。将 100 μL 山羊抗 PSMA2 抗体溶液加入盖玻片中，并在室温下孵育 40 分钟。
6. 小心地将一抗溶液从盖玻片上吸出。加入 100 μL PBS（在室温下）并在室温下孵育 3 分钟洗涤。
7. 从盖玻片上吸出PBS，并重复PBS的添加和抽吸，总共洗涤三次。
8. 在温热的DRG培养基中以1：250的稀释度制备抗山羊（例如，555偶联）二抗。
9. 第三次洗涤后，将 100 μL 稀释的二抗加入盖玻片中，并在室温下孵育 40 分钟。
   注意：从这一步开始，保护细胞免受光照。
10. 从盖玻片上吸出二抗溶液，并按照步骤 7.6-7.7 中的说明洗涤 3 次。
11. 去除最后一次PBS洗涤，并通过在1x PBS中加入100μL含有4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖的固定溶液来固定细胞。在室温下孵育10分钟。
12. 吸出固定剂并通过重复步骤 7.6-7.7 洗涤 3 次。
13. 通过在 1x PBS 中加入 100 μL 0.1% 非离子去污剂（例如 Triton X-100）来透化细胞，并在室温下孵育 5 分钟。
14. 吸出透化溶液并通过重复步骤7.6-7.7洗涤3次。
15. 在1x PBS中加入100μL由5%FBS，5%驴血清组成的封闭溶液，并在室温下孵育40分钟。
16. 在封闭溶液中根据以下稀释度制备DRG神经元细胞类型特异性一抗混合物：兔抗降钙素基因相关肽（CGRP）（1：500）;异凝集素B4，生物素偶联物（IB4）（1：50）;鸡抗 NF-H （1：1000）。
    注意：这些抗体不会相互干扰，可以在同一溶液中一起添加。
17. 除去封闭溶液并将一抗混合物添加到盖玻片中。在室温下孵育45分钟。
18. 取出抗体溶液并通过重复步骤7.6-7.7洗涤3次。
19. 通过将链霉亲和素（例如，647-偶联），驴抗兔（例如，488-偶联）和驴抗鸡（例如，405-偶联）稀释至各1：500，制备二抗混合溶液。
20. 取出最后一次 PBS 洗涤液，并在盖玻片中加入 100 μL 二抗溶液。在室温下孵育45分钟。
21. 重复步骤 7.6-7.7 洗涤 3 次。
22. 可选：以 1-10 μg/mL 制备核染色剂。加入100μL核染色液，在室温下孵育30秒，重复步骤7.6-7.7用去离子水（diH₂O）洗涤2次。
23. 吸出盖玻片上的最后一次洗涤液，并使用细头镊子将盖玻片从封口膜上提起。通过轻轻接触盖玻片的边缘到无绒纸巾上，吸干多余的液体。
24. 将 7 μL 封固剂液滴放在显微镜载玻片上。将盖玻片轻轻放在封片培养基液滴上，确保细胞朝下并与培养基接触。
25. 将带有盖玻片的显微镜载玻片放入黑暗、干燥的抽屉或盒子中至少 1 小时，以干燥并密封盖玻片的边缘。用快干指甲油完成盖玻片边缘的密封，等待 10-15 分钟后再成像。
26. 使用配备适当滤光片的荧光或转盘共聚焦显微镜对蓝、绿、红和远红荧光进行成像载玻片。

Results

区分 NMP 和细胞内蛋白酶体的能力依赖于膜不渗透的标记方法。抗体喂养允许在活神经元上使用蛋白酶体亚基特异性抗体来标记只能从细胞外部访问的蛋白酶体。由于其大小和亲水性，抗体无法穿过完整的细胞膜²⁴。活神经元保持膜完整性，防止抗体进入细胞。使用这种方法，可以可靠地标记NMP并区分表达它的神经元（NMP ⁺）和不表达它的神经元（NMP^-）（图2A）。仅接受二抗标记的对照细胞不显示NMP标记（图2B）。此外，该方法表明只有DRG神经元的一个亚群表达NMP。要将DRG神经元分离为NMP ⁺和NMP^-群体以进行进一步研究，请使用FACS分选。NMP 标记神经元的细胞分选已产生一致的结果。首先调整分选器以排除死细胞和碎片，方法是应用前向和侧向散射门控策略来隔离与DRG神经元的大小（>10μm直径）和粒度一致的事件。然后根据是否...

Discussion

蛋白酶体在所有细胞中都是必需的，并且可以在整个细胞的所有隔室中找到¹⁹。最近在中枢^25、26、27和外周²⁰ 神经系统的神经元中发现了一种特殊的蛋白酶体复合物 NMP，改变了我们目前对蛋白酶体功能的理解。先前的研究表明，NMP 作为一种信号蛋白酶体起作用，介导感觉神经元之间的串扰，以调节对机械、疼痛和瘙痒感的敏感性²⁰。NMP 在结构上似乎与细胞质 20S 蛋白酶体相同，表明其功能独特性源于其膜定位²⁰。选择性地标记 NMP 以研究其功能、形成和回收可能具有挑战性。该协议中描述的方法使研究人员能够可靠地标记活单细胞DRG神经元悬液中的NMP，并使用FACS分离NMP ⁺和NM...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES 缓冲溶液，pH 7.3	优质生物	118-089-721	FACS缓冲液
10 倍 PBS	赛默飞世尔科技	70011-044	FACS缓冲液
16%多聚甲醛（PFA）储备液;EM级	EMS的	15710	固定液
1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	费雪科学	10-010-023	FACS 清洗
5 mL 聚苯乙烯圆底管	费雪科学	14-959-6	FACS管
7-氨基放线菌素 D （7-AAD）	Invitrogen	A1310	标记死细胞
B27补充剂	赛默飞世尔科技	17504044	培养基
牛血清白蛋白	毫孔西格玛	A9647;CAS：9048-46-8	BSA/TI/DMEM
氯化钙二水合物（CaCl？-2H？O)	毫孔西格玛	C7902型	完整的生理盐水溶液
鸡抗神经丝重链（NF-H）	毫孔西格玛	AB5539	抗体
DMEM/F12 1：1	赛默飞世尔科技	11320033	培养基;BSA/TI/DMEM
驴抗山羊 IgG （H+L） Alexa Fluor Plus 555	赛默飞世尔科技	A32816	抗体
驴抗兔 IgG （H+L） Alexa Fluor Plus 488	赛默飞世尔科技	A32790	抗体
DyLight 405驴防鸡	杰克逊免疫研究	703-475-155	抗体
乙二胺四乙酸	毫孔西格玛	E5134;机关电话：6381-92-6	Liberase TM/Liberase TL-木瓜蛋白酶工作解决方案
胎牛血清 （FBS）	毫孔西格玛	A9647	培养基/FACS缓冲液/封闭溶液
玻璃巴斯德移液器，9 英寸	费雪科学	1367820D	滴定
山羊抗PSMA2	内部制造	那	抗体
HEPES粉	毫孔西格玛	H4034	完整的生理盐水溶液
霍克斯特	赛默飞世尔科技	H21492	核染色
马血清	赛默飞世尔科技	26050070	阻塞解决方案
IB4，生物素偶联物	毫孔西格玛	L2140型	抗体
层粘连蛋白	西格玛-奥尔德里奇	L2020-1MG型	培养菜
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030081	培养基
自由酶研磨低 （TL）	毫孔西格玛	54010200001	Liberase TL 储备液
自由酶研磨中度 （TM）	毫孔西格玛	5401119001	Liberase TM 储备液
六水氯化镁（MgCl？-6H？O)	毫孔西格玛	型号M2393	完整的生理盐水溶液
封片介质	南方生物	0100-01	荧光套料-G
木瓜 蛋白酶	沃辛顿	货号#： 9001-73-4	Liberase TL-木瓜蛋白酶工作溶液
青霉素/链霉素	毫孔西格玛	15140122	培养基/FACS缓冲液
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 （PLL）	毫孔西格玛	第 4707 页	培养菜
氯化钾 （KCl）	毫孔西格玛	第5405页	完整的生理盐水溶液
兔抗CGRP	免疫星	24112	抗体
氯化钠 （NaCl）	毫孔西格玛	S9888;机关电话：7647-14-5	完整的生理盐水溶液
山梨醇	毫孔西格玛	56755-米	完整的生理盐水溶液
链霉亲和素 Alexa Fluor 647 偶联物	赛默飞世尔科技	S21374	抗体
蔗糖	西格玛-奥尔德里奇	S0389-500G	固定液
胰蛋白酶抑制剂	毫孔西格玛	T9253;CAS：9035-91-8	BSA/TI/DMEM