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方法文章

体感神经元中神经元膜蛋白酶体的细胞亚型特异性分析

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DOI：

10.3791/69061

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2025年10月10日

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

本文内容

摘要

最近在部分体感神经元中发现神经元膜蛋白酶体（NMP）是触觉、痛觉和痒觉感知的关键调控因子。本文介绍了一种强大的工作流程，通过细胞分选、转录组分析以及基于培养的免疫荧光分析，用于研究特定细胞类型的NMP表达与功能。

摘要

感觉神经元信号传导依赖于功能正常的蛋白酶体，而蛋白酶体的亚细胞定位会影响其功能。最近在部分外周体感神经元中发现了一种特化的蛋白酶体复合物，称为神经元膜蛋白酶体（neuronal membrane proteasome, NMP）。NMP 仅定位于胞体以及近端和远端轴突的质膜上。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）显示，在正常条件下，NMP 主要在 MrgprA3+ 和 Cysltr2+ 神经元中表达，这些神经元介导机械觉、瘙痒和疼痛感知。在小鼠足垫皮肤中急性、选择性地抑制 NMP 可降低机械觉和痛觉敏感性，但不影响温度觉。值得注意的是，与全局性蛋白酶体抑制不同，选择性抑制 NMP 不会引起神经病变。体外研究表明，NMP 可能通过释放信号肽促进神经元之间的通讯，并对神经元正常响应刺激至关重要。这些发现表明，NMP 是调控感觉神经元间串扰的关键因子，对正常的触觉、痛觉和痒觉感知必不可少。因此，NMP 是疼痛管理的潜在靶点。本文介绍了利用抗体孵育和荧光激活细胞分选（FACS）技术分离表达 NMP 与不表达 NMP 的神经元群体的方法。这些细胞群体适用于通过 scRNA-seq 进行细胞类型特异性的表达谱分析，或用于基于培养的 NMP 表达动态研究。这些方法共同构成了一个可靠的工作流程，可用于研究 NMP 表达动态及其在与疼痛相关疾病状态中的作用。

引言

蛋白酶体功能对于周围神经系统（PNS）的最佳发育和维持至关重要1,2,3,4,5,6。利用蛋白酶体抑制剂开展的体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，蛋白酶体活性对神经发育、髓鞘形成、兴奋性以及胶质细胞功能均具有关键作用7,8,9,10。此外，基于蛋白酶体抑制剂的化疗会导致30%至60%的患者出现疼痛性神经病变，通常表现为四肢的慢性疼痛和感觉异常8,9,11,12,13。有趣的是，低剂量使用这些相同的抑制剂可降低对疼痛刺激的敏感性，提示蛋白酶体在感觉信息处理中具有复杂作用6,14,15。然而，尽管已有大量相关研究，蛋白酶体在PNS中的具体功能仍不甚明确。

蛋白酶体是所有生命领域中主要的蛋白质降解机器，对于维持蛋白质稳态至关重要16。20S核心蛋白酶体由四个七聚体环组成，其亚基排列为α、β、β、α，介导泛素非依赖性的蛋白质降解17,18。当其与调节颗粒结合时，可形成26S和30S帽状蛋白酶体，介导泛素依赖性的蛋白质降解4,17。在神经元中，蛋白酶体存在于所有细胞区室中，其亚细胞定位已知会影响其功能19。然而，许多常用的蛋白酶体抑制剂缺乏特异性，无法选择性地靶向不同定位的蛋白酶体群体。

事实上，通过使用膜不通透性蛋白酶体抑制剂以及在未透化的细胞中进行抗体标记，发现在部分躯体感觉神经元中存在一种神经元特异性的蛋白酶体复合物定位于质膜上20。对原代背根神经节（DRG）神经元进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，通过针对蛋白酶体亚基的抗体摄取及FACS分选，将细胞分为NMP+和NMP- 两个群体，结果共鉴定出20个转录上不同的细胞簇20。进一步分析显示，NMP+细胞仅聚类于这20个簇中的3个。利用特定神经元亚型的基因标记集，共鉴定出13种不同的躯体感觉神经元亚型20。大多数NMP+神经元与MrgprA3+ 和Cysltr2+感觉神经元聚类在一起20。极少数NMP+ 细胞聚类于第三个簇，该簇未发现特异性基因集合，因此未予归类20。MrgprA3+ 和Cysltr2+ 神经元属于C型伤害性感受器，分别对热、机械和致痒刺激敏感，对应于CGRP-θ和SST神经元亚型21,22。在鉴定出的20个细胞簇中，有7个NMP-簇表达与非神经元细胞一致的基因标记，包括施万细胞、卫星胶质细胞和免疫细胞，这些也被列为未归类20。这些细胞群体的存在是可预期的，因为在DRG神经元培养过程中无法将非神经元细胞与神经元细胞完全分离20。

研究其功能发现，体外抑制NMP会改变神经元对KCl、组胺和αβ-亚甲基腺苷5'-三磷酸刺激的兴奋性20。在体内，抑制NMP可降低对机械刺激和痛觉刺激的敏感性，但对温度感觉无影响20。这些结果表明，NMP是机械觉、痛觉和痒觉感知的关键调控因子，也是疼痛管理的潜在治疗靶点20。然而，NMP活性在不同疾病背景下与疼痛发生之间的具体机制仍不清楚。因此，有必要进一步研究NMP在疼痛及相关神经病变条件下的表达动态及其功能。

本文介绍了一种用于鉴定和分离 NMP+ DRG 神经元群体的可靠工作流程（图 1）。该方法结合 FACS 分选、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和免疫染色，可实现对 NMP 表达动态的细胞类型特异性研究。这些技术能够以高分辨率、细胞类型特异性地分析 NMP 的表达，可用于探究 NMP 在正常状态及多种与疼痛相关条件下的作用。

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方案

所有使用实验动物的方法均经芝加哥洛约拉大学斯特里奇医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 消化液、DRG 培养基和 FACS 培养基的制备

  1. 配制含有 137 mM NaCl、5.3 mM KCl、1 mM MgCl2·6H2O、25 mM 山梨醇、10 mM HEPES 和 3 mM CaCl2·2H2O 的完全生理盐水溶液（CSS）。用 NaOH 调节 pH 至 7.2，并过滤除菌。
  2. 通过将 190 µL 储存液（5 mg/mL 溶于 H2O）、84 µL 50 mM EDTA 和 6.5 mL CSS 混合，制备组织解离酶混合工作液（中等吹打强度）。使用前新鲜配制并过滤除菌。
  3. 通过将 190 µL 酶混合储存液、150 µL 木瓜蛋白酶、84 µL 50 mM EDTA 和 6.5 mL CSS 混合，制备组织解离酶混合液（低强度吹打）-木瓜蛋白酶溶液。使用前新鲜配制并过滤除菌。
  4. 通过将 7.5 mg 胰蛋白酶抑制剂和 7.5 mg BSA 溶于 5 mL DMEM/F12 培养基中，制备 BSA/TI/DMEM 溶液。新鲜配制并过滤除菌。
  5. 通过将 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素、1% 谷氨酰胺和 2% 50x B27 补充剂加入 430 mL DMEM/F12 培养基中，制备背根神经节（DRG）神经元培养基。
  6. 通过将 1% FBS、1x PBS、25 mM HEPES 和 1% 青霉素/链霉素溶于高压灭菌水中，制备 FACS 缓冲液。新鲜配制并过滤除菌。
  7. 在实验方案开始前 24 小时，用 FACS 缓冲液充满两个 5 mL 聚苯乙烯圆底管，并置于 4 °C 环境中进行包被处理。

2. 单细胞背根神经节神经元悬液的制备

  1. 按照先前描述的方法20,23，采集4-6只P20-P23小鼠的所有背根神经节（DRG）。
  2. 将DRG转移至15 mL锥形管中，加入7 mL组织解离酶混合液（中等吹打强度）工作液。在37 °C下轻轻振荡（旋转）孵育20分钟。
  3. 在120 × g下离心2分钟以沉淀神经节。小心移除上清液，避免扰动沉淀物，并将神经节重悬于7 mL组织解离酶混合液（低强度吹打）-木瓜蛋白酶工作液中。在37 °C下轻轻振荡（旋转）孵育15分钟。
  4. 在120 × g下离心2分钟。弃去上清液，将神经节重悬于500 µL BSA/TI/DMEM溶液中。
  5. 使用1 mL带滤塞且经火焰抛光的玻璃巴斯德吸管对神经节进行12-16次吹打解离。
  6. 通过40 µm细胞筛过滤去除细胞碎片。用1 mL BSA/TI/DMEM溶液冲洗细胞筛，以确保收集所有背根神经节神经元。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
  7. 在120 × g下离心2分钟。弃去上清液，轻柔地将沉淀物重悬于1 mL DRG培养基中。
    注：此即为单细胞背根神经节神经元悬液。

3. 抗体孵育标记 NMP 阳性神经元

  1. 将DRG神经元悬液分装至两个1.5 mL离心管中，每管含500 µL，并标记为“"primary"”和“"no primary"”。
  2. 向标记为“"primary"”的离心管中加入20 µL山羊抗蛋白酶体20S亚基α2（PSMA2）抗体（1:25稀释）。
    1. 可选：为检测细胞膜完整性和PSMA2抗体的特异性，可额外设置一组初级DRG样本，先与鸡抗神经丝重链（NF-H）抗体（1:1,000）孵育，再加入二抗（如488标记的抗鸡IgG，1:250）（参见步骤3.10）。
      注意：若神经元细胞膜完整，抗NF-H标记对照应无细胞着色。
  3. 在37 °C下轻柔振荡孵育30分钟。
  4. 在初级抗体孵育期间，将过滤灭菌的1×PBS预热。
  5. 以200 × g离心2分钟，弃去90%上清液。
  6. 用500 µL预热的1×PBS重悬神经元，于37 °C轻柔振荡孵育3分钟。
  7. 重复步骤3.5–3.6，共进行三次洗涤。
  8. 在洗涤过程中，将4 µL抗山羊IgG（555 nm荧光染料标记）加入1,000 µL预热的DRG培养基中进行稀释（1:250稀释），以配制二抗溶液。
  9. 第三次洗涤后，将“"primary"”和“"no primary"”两管均用500 µL二抗溶液重悬。
    注意：自此步骤起，需用铝箔包裹离心管以避光。
  10. 在37 °C下轻柔振荡孵育40分钟。
  11. 重复步骤3.5–3.6，共进行三次细胞洗涤。
  12. 第三次洗涤后，用300 µL FACS缓冲液重悬神经元，转移至两个独立的5 mL聚苯乙烯圆底管中，置于带盖冰桶内的冰上，避光保存。
  13. 将前一日已预处理并含FACS缓冲液的圆底管一同放入冰桶中，与含细胞的管子一起进行后续FACS分选步骤。

4. 通过FACS分选分离NMP阳性（NMP+ ）和NMP阴性（NMP- ）神经元

  1. 在抗体孵育并标记背根神经节（DRG）神经元后，立即将细胞和包被的试管转移至流式细胞分选仪进行分选。
  2. 加入7-氨基放线菌素D（7-AAD）（1:1,000）至两者中 "初级" 和 "无主要抗体" 离心管。在冰上孵育10-30分钟。
    注意：7-AAD 用于在分选过程中排除死细胞。
  3. 从经包被过夜的离心管中移除FACS缓冲液，并替换为1 mL新鲜FACS缓冲液。这些离心管将用作分选神经元的收集管。
  4. 使用 "无主要抗体" 将标记的试管用于设定未标记神经元的参数和门控。
  5. 应用前向散射（FSC）门控以分离与感觉神经元大小一致的细胞。感觉神经元的直径范围为10至50 µm。
  6. 应用侧向散射（SSC）设门以排除死细胞和碎片（低侧向散射），并筛选出符合背根神经节（DRG）神经元颗粒度特征的事件（较高侧向散射）。
  7. 加载 "初级" 管并根据已确定的设门参数进行设置 "无主要抗体" 样本以检测未标记的（NMP-）以及 555 阳性（NMP+神经元群体。
  8. 使用100 µm喷嘴和15–20 psi分选压力，将神经元分选至555+ 和 555-.
  9. 进行分选后神经元的下游分析。

5. NMP+ 和 NMP- 神经元的单细胞 RNA 测序

  1. 将分选后的细胞转移至1.5 mL离心管中，置于冰上，并将细胞运送至单细胞测序中心。
  2. 对分选得到的NMP+ 和NMP- 神经元进行单细胞RNA测序，测序深度为每个细胞30,000至100,000条reads。
  3. 使用多种免费可用的软件程序分析scRNA-seq数据，根据特定基因表达谱生成细胞聚类。有关此前所用分析步骤和程序的更多细节，请参见Villalón Landeros等20。
  4. 利用现有数据库（如 https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ 或 https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all）构建特异性基因标志物列表，以鉴定不同的神经元群体。
  5. 使用特异性基因标志物列表来鉴定所获得的细胞聚类。
    注：此前进行的scRNA-seq分析由一家独立咨询公司（www.cmcherryconsulting.com）完成。

6. 富集的 NMP+ 和 NMP- 神经元的原代培养

  1. 实验前一天，将直径12 mm的圆形盖玻片放入24孔培养板中（每孔1片），用70%乙醇浸泡15分钟。随后用无菌水清洗3次，于无菌细胞培养超净台中自然晾干。
  2. 盖玻片干燥后，加入0.1 mg/mL的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL），4 °C孵育过夜。
  3. 实验当天，吸除PLL溶液，用无菌水清洗盖玻片3次，并在细胞培养超净台中晾干。
    注意：PLL溶液可保存并重复使用。
  4. 将10 µL浓度为1 mg/mL的层粘连蛋白（laminin）加入125 µL DRG培养基中稀释，取20–30 µL滴加于每张盖玻片中央。
  5. 使用前，将盖玻片与层粘连蛋白共同孵育至少40分钟。
  6. 将FACS分选的细胞转移至1.5 mL离心管中，在200 × g条件下离心5分钟以收集细胞。弃去上清液，用50 µL预热的DRG培养基重悬神经元。
  7. 吸除盖玻片上的层粘连蛋白溶液，让盖玻片自然干燥。
  8. 将重悬的神经元细胞悬液取15–20 µL接种于每张盖玻片上。小心将接种后的培养板转移至细胞培养箱中，孵育至少30分钟（不超过1小时），使细胞充分贴附。
  9. 将培养板移回细胞培养超净台，向每孔含有细胞的盖玻片中加入1 mL无菌预热的DRG培养基。
    注意：将移液器枪头缓慢降至孔的底部角落，缓慢释放液体，避免触碰盖玻片或扰动细胞。加液过快可能引起湍流，导致细胞脱落。
  10. 将培养物置于37 °C、5% CO2/95%湿度条件下培养，每2–3天更换75%培养基。

7. 细胞类型特异性 NMP 表达分析

  1. 用一张较大的石蜡膜衬垫一个140 mm的培养皿或免疫荧光染色托盘。
  2. 使用无菌的5/45镊子，将盖玻片从组织培养皿转移至染色托盘的石蜡膜上，确保含有背根神经节（DRG）神经元的一面朝上。
  3. 在石蜡膜上的每片盖玻片上加入100 µL DRG培养基，以防止细胞干燥。
    注意：加液时应使用移液器缓慢地从盖玻片边缘上方加入。
  4. 用预热的DRG培养基按1:20的比例稀释山羊抗PSMA2一抗。
  5. 使用装有P10无滤芯吸头的移液器，从盖玻片边缘缓慢吸除培养基。向每片盖玻片加入100 µL山羊抗PSMA2抗体溶液，并在室温下孵育40分钟。
  6. 小心吸除盖玻片上的一抗溶液。加入100 μL室温的PBS缓冲液，在室温下孵育3分钟以进行洗涤。
  7. 吸除盖玻片上的PBS，重复加入并吸除PBS的操作，共完成三次洗涤。
  8. 用预热的DRG培养基按1:250的比例稀释抗山羊二抗（例如555标记）。
  9. 第三次洗涤后，向盖玻片加入100 µL稀释后的二抗溶液，在室温下孵育40分钟。
    注意：从本步骤开始，需避免样品暴露于光照下。
  10. 吸除盖玻片上的二抗溶液，并按照步骤7.6–7.7所述方法重复洗涤三次。
  11. 移除最后一次PBS洗涤液，加入100 µL固定液（含4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖的1×PBS溶液）以固定细胞，在室温下孵育10分钟。
  12. 吸除固定液，并重复步骤7.6–7.7的操作进行三次PBS洗涤。
  13. 加入100 µL含0.1%非离子型去垢剂（如Triton X-100）的1×PBS溶液以通透细胞，在室温下孵育5分钟。
  14. 吸除通透液，并重复步骤7.6–7.7的操作进行三次洗涤。
  15. 加入100 µL封闭液（含5%胎牛血清和5%驴血清的1×PBS溶液），在室温下孵育40分钟。
  16. 在封闭液中按以下比例配制针对DRG神经元细胞类型的特异性一抗混合液：兔抗降钙素基因相关肽（CGRP）抗体（1:500）；生物素标记的异凝集素B4（IB4）（1:50）；鸡抗NF-H抗体（1:1000）。
    注意：这些抗体之间无交叉干扰，可同时加入同一溶液中。
  17. 移除封闭液，将一抗混合液加至盖玻片上，在室温下孵育45分钟。
  18. 移除抗体溶液，并重复步骤7.6–7.7的操作进行三次洗涤。
  19. 配制二抗混合液：将链霉亲和素（如647标记）、驴抗兔二抗（如488标记）和驴抗鸡二抗（如405标记）分别按1:500比例稀释。
  20. 移除最后一次PBS洗涤液，向盖玻片加入100 µL二抗混合液，在室温下孵育45分钟。
  21. 重复步骤7.6–7.7的操作进行三次洗涤。
  22. 可选步骤：配制1–10 µg/mL的核染液。加入100 µL核染液，在室温下孵育30秒，然后用去离子水（diH2O）重复步骤7.6–7.7的操作洗涤两次。
  23. 吸除最后一次洗涤液，用细尖镊子将盖玻片从石蜡膜上轻轻提起。用镊子夹住盖玻片边缘，轻轻接触无尘纸以吸去多余液体。
  24. 在载玻片上滴加7 µL封片剂。将盖玻片轻轻覆盖在封片剂液滴上，确保细胞面朝下并与封片剂接触。
  25. 将带有盖玻片的载玻片置于黑暗、干燥的抽屉或盒子中至少1小时，使其干燥并封闭盖玻片边缘。随后用快干指甲油完全封边，等待10–15分钟后再进行成像。
  26. 使用配备适当激发滤光片的荧光显微镜或转盘共聚焦显微镜，对载玻片进行成像，以观察蓝色、绿色、红色和远红荧光信号。

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结果

区分核膜蛋白酶体（NMP）与细胞内蛋白酶体的能力依赖于膜不通透性标记方法。抗体孵育法允许在活神经元上使用蛋白酶体亚基特异性抗体，仅标记细胞外可接触的蛋白酶体。由于抗体的分子大小和亲水性，其无法穿过完整的细胞膜24。活神经元保持细胞膜完整性，阻止抗体进入细胞内。利用该方法，可可靠地标记NMP，并区分表达NMP的神经元（NMP+）与不表达NMP的神经元（NMP-）（图2A）。仅接受二抗标记的对照细胞未显示NMP标记信号（图2B）。此外，该方法表明仅背根神经节（DRG）神经元的一个亚群表达NMP。为将DRG神经元分为NMP+和NMP-群体以进行后续研究，可采用流式细胞分选（FACS）。对NMP标记的神经元进行细胞分选已获得一致结果。首先通过前向散射和侧向散射设门策略调整分选仪，排除死细胞和碎片，筛选出符合DRG神经元大小（&g...

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讨论

蛋白酶体在所有细胞中均至关重要，并存在于细胞的各个区室中19。近期在中枢25,26,27和外周20神经系统神经元中发现了一种特化的蛋白酶体复合物——膜相关蛋白酶体（NMP），这一发现改变了人们对蛋白酶体功能的现有认知。先前的研究表明，NMP作为一种信号传导型蛋白酶体，介导感觉神经元之间的串扰，从而调控对机械刺激、疼痛和瘙痒感觉的敏感性20。NMP在结构上似乎与胞质中的20S蛋白酶体完全相同，提示其功能独特性可能源于其在细胞膜上的定位20。选择性地标记NMP以研究其功能、形成及再循环过程具有较大挑战性。本实验方案中描述的方法可使研究人员在活体单细胞背根神经节（DRG）神经元悬液中可靠地标记NMP，并通过流式细胞分选（FACS）分离出NMP+&#...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

E.V.L 获得了芝加哥洛约拉大学斯特里奇医学院启动资金的支持。我们感谢 Robert Ladd 在 FACS 实验方面的建议与协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M HEPES 缓冲液，pH 7.3Quality Biological118-089-721FACS 缓冲液
10x PBSThermo Fisher Scientific70011-044FACS 缓冲液
16% 多聚甲醛（PFA）储备液；电镜级EMS15710固定液
1x 磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific10-010-023FACS 洗涤液
5 mL 聚苯乙烯圆底管Fisher Scientific14-959-6FACS 管
7-氨基放线菌素 D（7-AAD）InvitrogenA1310标记死细胞
B27 添加剂Thermo Fisher Scientific17504044培养基
牛血清白蛋白MilliporeSigmaA9647; CAS: 9048-46-8BSA/TI/DMEM
二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O）MilliporeSigmaC7902完全生理盐水溶液
鸡抗神经丝重链（NF-H）抗体MilliporeSigmaAB5539抗体
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Scientific11320033培养基；BSA/TI/DMEM
驴抗山羊 IgG（H+L）Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher ScientificA32816抗体
驴抗兔 IgG（H+L）Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32790抗体
DyLight 405 驴抗鸡抗体Jackson ImmunoResearch703-475-155抗体
EDTAMilliporeSigmaE5134; CAS: 6381-92-6Liberase TM/Liberase TL-木瓜蛋白酶工作液
胎牛血清（FBS）MilliporeSigmaA9647培养基/FACS 缓冲液/封闭液
玻璃巴斯德吸管，9 英寸Fisher Scientific1367820D吹打
山羊抗 PSMA2 抗体（实验室自制）made in houseNA抗体
HEPES 粉末MilliporeSigmaH4034完全生理盐水溶液
Hoechst 染料Thermo Fisher ScientificH21492细胞核染色剂
马血清Thermo Fisher Scientific26050070封闭液
IB4，生物素偶联物MilliporeSigmaL2140抗体
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020-1MG培养皿
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030081培养基
Liberase 低吹打型（TL）MilliporeSigma54010200001Liberase TL 储备液
Liberase 中等吹打型（TM）MilliporeSigma5401119001Liberase TM 储备液
六水氯化镁（MgCl₂·6H₂O）MilliporeSigmaM2393完全生理盐水溶液
封片剂SouthernBiotech0100-01Fluoromount-G
木瓜蛋白酶WorthingtonCat#: 9001-73-4Liberase TL-木瓜蛋白酶工作液
青霉素/链霉素MilliporeSigma15140122培养基/FACS 缓冲液
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）MilliporeSigmaP4707培养皿
氯化钾（KCl）MilliporeSigmaP5405完全生理盐水溶液
兔抗 CGRP 抗体Immunostar24112抗体
氯化钠（NaCl）MilliporeSigmaS9888; CAS: 7647-14-5完全生理盐水溶液
山梨醇MilliporeSigma56755-M完全生理盐水溶液
链霉亲和素 Alexa Fluor 647 偶联物Thermo Fisher ScientificS21374抗体
蔗糖Sigma-AldrichS0389-500G固定液
胰蛋白酶抑制剂MilliporeSigmaT9253; CAS: 9035-91-8BSA/TI/DMEM

参考文献

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