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模拟流感感染后肺泡的发育异常与功能性修复

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DOI：

10.3791/69062

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2025年9月19日

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1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

本文内容

摘要

本方案提供了流感病毒（IAV）鼻内接种小鼠以及对小鼠肺组织损伤和肺细胞类型相关转录变化进行后续分析的操作说明。

摘要

病毒感染会对肺泡造成急性和长期的损伤，肺泡是负责心血管系统与外界环境之间气体交换的特化组织结构。在小鼠中感染甲型流感病毒（IAV）是研究人类肺部对病毒感染反应的转化模型，可诱导肺泡发生短暂性和持续性的细胞状态改变。在某些情况下，病毒感染引起的异常细胞状态若未能随时间恢复，可能会永久损害肺部关键的气体交换功能。本文展示了通过鼻内途径使小鼠感染A/PR/8/34 IAV病毒的方法，并对受损肺组织的细胞组成和组织结构中短暂性及持久性改变进行表征。该模型有助于深入研究肺组织修复和慢性功能障碍背后的分子与细胞机制。此方法还为评估旨在促进病毒感染后肺组织有效再生和恢复呼吸功能的治疗干预措施提供了平台。

引言

肺在向局部组织供应氧气和营养物质方面发挥着关键作用。肺部微小毛细血管中的内皮细胞（ECs）对肺组织的正常功能至关重要，可维持血管完整性和高效的气体交换1。ECs 构成了血管微环境，并与上皮细胞、免疫细胞和间充质细胞等其他细胞进行双向通讯。这有助于调控肺的发育以及在损伤或疾病发生后的组织修复过程2。

H1N1甲型流感 病毒感染是一个全球性问题3。H1N1感染患者常被诊断为渗出性弥漫性肺泡损伤（DAD）4。H1N1感染可导致严重的肺损伤及严重后果，包括肺炎、重度急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）5。这种损伤主要源于病毒对肺上皮细胞的感染，从而引发过度的免疫反应，导致肺部炎症、组织损伤和液体积聚。负责气体交换的气道和肺泡上皮细胞直接受到H1N1病毒的损害，导致肺正常结构的破坏6,7。目前明确的是，其他细胞类型尽管未被流感病毒（IAV）直接感染，也可能在感染后发生损伤8,9。因此，流感感染后的组织损伤影响肺部所有细胞区室，最近的研究表明，IAV感染会导致多个细胞区室中细胞状态出现短暂性和持续性改变9。这种疾病诱导的细胞可塑性可能对组织修复有益或有害，值得进一步研究。

研究流感及其发病机制最常用的实验模型是通过鼻腔感染小鼠流感病毒 A/PR/8/3410。该技术对于研究疾病严重程度、死亡率以及病毒传染性具有重要意义。小鼠鼻腔感染可模拟人类自然感染途径，使研究者能够同时研究机体对病毒的适应性免疫和固有免疫应答。1934年，一种特定的甲型流感病毒株 "A/PR/8/34" 从波多黎各的一名患者体内分离获得11。该流感病毒株现已适应小鼠，不再对人类造成有效感染。由于小鼠与人类免疫系统具有相似性，小鼠已成为甲型流感病毒（IAV）研究中最常用的动物模型12。在本方法中，将 A/PR/8/34 H1N1 毒株直接经鼻腔给予小鼠，以模拟自然感染过程13。该方法操作简便、成本低廉且易于实施，适用于在野生型（WT）及基因敲除（KO）条件下研究病毒感染对宿主肺组织的影响。与其他技术相比，鼻腔感染模型具有独特优势。气管内接种（IT）可将病毒准确递送至肺部，但该技术不能完全模拟吸入感染过程，也无法提供上呼吸道毒性的相关信息；此外，IT接种需要较高的操作技巧，以降低气管损伤风险13,14。气溶胶吸入（AR）接种可模拟自然感染途径，并相较于鼻腔感染产生更均一的肺部病理变化，但维持气溶胶中病毒浓度的均一性及实现病毒气溶胶的精确递送较为困难，且该方法存在重要的生物安全风险10。因此，IAV的鼻腔接种技术是研究病毒感染所致肺部组织损伤与修复等下游效应的关键方法。与化学或机械模型相比，该方法为研究流感引起的肺损伤及宿主-病原体相互作用提供了更为真实且侵入性更小的途径。

本文建立了一种可重复的小鼠流感病毒（A/PR/8/34）鼻内感染方法，并用于表征病毒感染损伤后肺泡发生的短期与长期细胞及结构变化。采用该方法的研究有助于揭示肺组织损伤与修复的机制，从而为肺部疾病发现新的治疗靶点。

方案

在动物模型中操作甲型流感病毒属于生物安全二级（BSL2）和动物生物安全二级（ABSL2）。本研究中使用的所有动物实验程序均已获得美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心动物护理与使用委员会的批准（方案编号 #24-452）。该方案也已获得美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心机构生物安全委员会的批准。在开始本方案之前，建议使用者向其所在机构的动物护理与使用委员会以及机构生物安全委员会申请并获得相应批准。

1. 工作液的制备

注意：所有流感病毒操作均应在生物安全柜内的冰上进行。将接触过病毒的移液枪头及其他物品弃置入含10%次氯酸钠的容器中。冰桶、移液器和枪头盒应喷洒10%次氯酸钠溶液进行消毒，而非浸泡。室温孵育至少30分钟。固体废弃物应放入生物危害废物容器中处理，液体废弃物可倒入水槽，并用水充分冲洗。

  1. 在生物安全柜中将病毒冻存液（0.5 mL）置于冰上解冻。
  2. 准备一个含有10%次氯酸钠（漂白剂）的自来水废液容器。将两个可容纳最多100个样本管的塑料或纸板冷冻盒放入-80 °C超低温冰箱中进行预冷。
  3. 预先标记160个1.5 mL离心管，用于分装病毒。建议使用螺口管而非按盖管，以避免在开启病毒储存管时产生气溶胶。将离心管置于冰上预冷，待分装病毒前使用。
  4. 使用经校准的P20移液器及配套吸头，将病毒分装为每管3 µL，仅将病毒加入预冷的离心管中，并始终将分装后的样品置于冰上。
  5. 完成分装后，将样品存放在已预冷的冷冻盒中，冷冻盒上应标注"A/PR/8/34 流感病毒（IAV）"、货号、批号和有效期。
    注意：不同批次的病毒具有不同的感染活性，不应混合使用。
  6. 将冷冻盒放入-80 °C超低温冰箱中保存。确保所有操作尽可能保持低温，因为病毒滴度会随着每一次冻融循环而下降。

2. 用于鼻内感染实验的病毒等分试样稀释

  1. 在生物安全柜中，将一份数量为 3 µL 的病毒储备液置于冰上解冻。
  2. 将3 µL分装样品中的2 µL转移至预冷的1.5 mL离心管中，该离心管内含198 µL冷的D-PBS，制成1:100稀释液（稀释液A）。
  3. 继续稀释病毒原液，直至达到适用于0.5-1 LD的适当浓度50 在使用的小鼠品系背景下进行操作。所有步骤需保持在冰上，并使用预冷的离心管，以避免病毒过热。
    注意：例如，使用VR-95PQ（批号70063082）感染小鼠时，接种剂量为12,600至31,500 CEID50/µL 病毒（按体重比例稀释至1:500,000）
  4. 从稀释液A（1:100）中，取10 µL加入预冷的15 mL离心管内的4990 µL冷D-PBS中，配制成1:50,000的稀释液（稀释液B）。使用5 mL血清移液管反复吹打混匀。
  5. 从稀释液B中，取200 µL加入预冷的5 mL离心管中的1.8 mL D-PBS中，制备1:500,000的稀释液（稀释液C）。用移液器反复吹打充分混匀。
    注意：在购买新批次病毒时，为确定用于感染动物的理想稀释度，可根据产品说明书上标注的病毒滴度，并结合前一批次病毒的滴度进行估算调整。确定理想稀释度的最佳方法是使用野生型 C57BL/6 小鼠对新批次病毒进行经验性滴定。建议设置从 1:50,000 至 1:500,000 的一系列稀释梯度，每个稀释度准备 1–2 笼 C57BL/6 雌性小鼠用于测试。以不同浓度感染小鼠后，监测其体重下降情况。为检测病毒滴度，本研究建议仅使用雌性小鼠，以减少因性别或小鼠间体重差异带来的变异性。雌性小鼠通常比雄性小鼠病情更重，这可能与其体型较小有关，也可能与性别特异性的流感感染应答差异相关，类似现象也见于其他类型的小鼠肺损伤模型。15尽管这一点未被详细研究，但滴定实验使用了雌性小鼠，因为若使用雄性小鼠确定滴定剂量，雌性小鼠可能在该剂量下死亡。然而研究发现，当感染由仅使用雌性小鼠所确定的病毒滴度时，雄性小鼠会出现明显病症并伴有显著的肺部损伤。若使用混合背景或远交系小鼠，理想的稀释度将为 "1 LD50," 野生型C57BL/6小鼠死亡率为50%时的稀释度。远交系小鼠对感染更具抵抗力16 并且在此稀释度下会受到损伤并良好恢复。如果实验所用小鼠为近交系C57BL/6背景，则理想剂量为此剂量的一半 "0.5 LD50." 由于这些实验的目的是研究损伤与修复，因此最好确定一个剂量，使小鼠出现疾病症状并体重下降20-25%，但大多数小鼠最终能够恢复图1）。如果研究中所有小鼠的体重相近（约25 g），可向每只小鼠给予50 µL适当稀释度的流感病毒。然而，小鼠体重范围通常为15–35 g。因此，应按每克体重给予2 µL病毒稀释液（例如，15 g小鼠给予30 µL流感病毒，35 g小鼠给予70 µL）。这有助于在不同体型的动物中实现更一致的感染水平和组织损伤程度。此信息对于规划稀释液C的总体积至关重要。

3. 病毒分装样本向动物设施的转运

  1. 将含有最终病毒稀释液的 5 mL 管置于冰上，并在容器上贴上生物危害警示标签。用纸巾衬垫塑料样品运输盒，以吸收可能发生的溢出物。
  2. 将鼻内感染所需的材料放入贴有生物危害标签的盒子中：一支 P200 移液器、一盒未开封的滤芯式 P200 移液器吸头、一支笔，以及一个装有新鲜 10% 漂白液的 50 mL 锥形管，用于处理病毒废弃物。作为感染控制措施，用与稀释 IAV 时相同的冷 D-PBS 溶液填充一支 1.5 mL 离心管。

4. 向小鼠施用流感病毒（IAV）

注意：在动物实验设施中操作流感病毒需要具备生物安全二级（ABSL2）资质的实验室。标准个人防护装备包括刷手服、一次性实验服、两个发帽、双层腈纶手套、双层鞋套、眼部防护用具（安全护目镜）以及口罩。在给药操作全程中，稀释后的流感病毒应置于冰上，以避免感染活性丧失。

  1. 所有涉及病毒的操作必须在生物安全柜内进行。尽管 A/PR/8/34 流感病毒是一种适应小鼠的毒株，但流感病毒易于发生突变，因此应将其视为可能对人类具有感染性。
  2. 依次对动物使用异氟烷麻醉，异氟烷挥发罐的流速设定为2.5–3%。在给予流感病毒前，将动物从麻醉箱转移至鼻罩。
  3. 当小鼠处于麻醉状态时，应检查其呼吸情况，并进行足趾挤压以观察是否有反应。当小鼠表现出外周脊髓反射（如肢体回缩），但无中枢意识（表现为小鼠移动头部或环顾四周）时，即可进行甲型流感病毒（IAV）感染。
    注意：鼻内给药时首选亚外科麻醉深度（既非完全清醒，也非外科麻醉水平）。若处于外科麻醉水平，小鼠因液体误吸入肺而增加死亡风险；而麻醉不足则会导致接种物被排出，造成剂量不一致。这种中间状态下，小鼠可能对足趾夹捏仍有反应，可兼顾安全性和感染效率。
  4. 使用设置为50 µL（或按2 µL/g体重；见步骤2.5下方的注释）的P200移液器，从冰上的小瓶中吸取稀释后的IAV（或PBS对照），然后将移液器放置在吸头盒或纸巾上，确保吸头不接触手套或生物安全柜表面。
  5. 用拇指和食指捏住已麻醉小鼠的颈背部皮肤，将小鼠身体保持在与水平面呈45°角的直立方向。捏紧程度应足以拉长气管以利于吸入气体，但不可过紧而阻碍呼吸。确保小鼠呼吸浅而规律，无喘息现象。
  6. 将IAV稀释液缓慢滴入小鼠鼻孔。可采用步骤4.6.1和4.6.2中所述的任一方法成功完成此操作。
    1. 将病毒稀释液以滴剂形式滴入鼻腔，交替滴入两侧鼻孔，确保病毒进入鼻腔两侧。
    2. 创建一个 "气泡" 病毒液覆盖双侧鼻孔，通过在小鼠吸入液体时持续且缓慢地移液来维持。
      注意：本研究始终采用气泡灌注法，该方法更具可控性和可重复性。此方法可在麻醉条件下轻松将病毒悬液递送至鼻腔，并便于动物自然呼吸。滴注法同样有效，但无论采用何种方法，均应在各实验间保持方法的一致性，以减少结果的变异性。
  7. 将移液器吸头靠近小鼠鼻部，但不要接触鼻部。如果小鼠正在苏醒，先给予一半剂量，然后将小鼠放回异氟烷鼻罩中，再给予剩余一半剂量。
  8. 如果小鼠清醒到足以摇头、咳嗽或吐出病毒，则需要追加麻醉，以避免产生气溶胶并确保成功感染。如果小鼠仍处于无意识状态，给予全部剂量。若小鼠已重新置于鼻罩上，重复步骤4.6以接种剩余的IAV。
  9. 将枪头弃置到装有新鲜10%次氯酸钠的废液容器中。每处理一个鼠笼均需使用新的枪头。
  10. 每次给予IAV后，将小鼠保持直立姿势1-2分钟，以维持气道通畅，并确保流感病毒已充分递送至肺部。若流感病毒已成功递送至小鼠肺部，可通过将一根手指分别置于小鼠胸部两侧感知到啰音。
  11. 小鼠开始恢复后，将其放回笼中继续完全恢复。小鼠从异氟烷麻醉中恢复较快，但在能够自主活动前需持续监测。
  12. 记录事件，例如胸部的爆裂音和深呼吸，表明流感病毒（IAV）已充分吸入；或气泡和鼻腔喷雾现象，表明部分病毒已从小鼠鼻孔排出。将此类信息记录在损伤日志电子表格中。补充文件 1）和实验记录本。
  13. 对每只待感染的小鼠重复步骤 4.2–4.12。

5. 运送回实验室

  1. 将含有漂白剂和枪头的50 mL锥形管连同剩余的IAV稀释液（如有）以及用于流感感染的实验物品一起放回塑料样品运输盒中。
  2. 返回实验室后，将所有接触过病毒的物品用10%漂白剂孵育。对于冰桶、移液器和枪头盒，应喷洒10%漂白剂溶液而非浸泡处理。室温孵育至少30分钟。固体废弃物应丢弃至生物危害废物容器中，液体废弃物可排入水槽，并用水充分冲洗。

6. 小鼠的监测及其他实验步骤

  1. 在流感感染后，从感染后第1天（即感染次日）或第4天开始，每日监测所有对照组（PBS）和IAV感染小鼠的体况评分（BCS）17及体重。IAV感染小鼠在感染后第4天之前通常不会出现明显的体重下降（图1）。
    注意：若小鼠体重减轻超过30%，或体况评分降至1，应实施安乐死。
  2. 如需监测流感感染后细胞增殖情况，可通过腹腔（i.p.）注射或饮水中添加的方式给予EdU。
    注意：小鼠肺部多种细胞类型在IAV引起的损伤后会发生增殖9。可根据特定实验目的，选择性地给予其他药物、特殊饲料或特殊饮水。需注意，小鼠在流感恢复期间进食和饮水量通常低于正常水平，因此基于注射的给药方式可能更为可靠；但另一方面，体况评分为2–2.5的小鼠较难进行注射操作。

7. 获取肺组织以用于后续实验分析

  1. 在动物实验设施或实验室的生物安全柜中，采集肺组织用于后续实验，包括免疫荧光分析、流式细胞术或单细胞RNA测序。
  2. 使用CO2逐只实施安乐死。避免颈椎脱臼，以防气管脱位。双侧开胸术通常被批准作为辅助安乐死方法。
    注：本研究遵循机构批准的动物护理指南和CO2安乐死操作规程，在既往流感研究中持续采用该方法，未引起肺损伤或组织病理学结果的显著变异性。也可使用氯胺酮/甲苯噻嗪对小鼠实施安乐死，以避免CO2吸入造成的损伤。然而，若获取氯胺酮/甲苯噻嗪成本过高或难以获得美国药品执法局（DEA）许可，则CO2吸入是一种可接受的方法。
  3. 解剖打开胸腔，暴露肋骨和气管。
  4. 切开膈肌并小心将其从肋骨上分离，避免刺破肺组织。沿肋骨两侧剪开，并移除顶部的肋骨。剪断锁骨，并将骨骼及软组织从前部气管处剥离。
  5. 解剖气管周围的肌肉和组织，直至可见软骨环，但不得刺破气管。使用弯头镊子将食管从气管后方推出，并将其与气管分离。
  6. 将缝合线穿过气管后方，打一个松结（将一端双圈缠绕在一把镊子上，另一把镊子夹住缝线自由端，拉动自由端穿过线圈）。
  7. 用D-PBS灌注循环系统。夹住一条大血管（前肢下方或膈肌底部），通过右心室（心脏底部，朝上方向）缓慢推动注射器末端进行灌注。若针头未穿透心壁，则很可能位于左心室。此步骤可清除肺部血液。
    注：避免推入气泡。若管路中存在气泡，应在推动D-PBS前将其排出。若关注内皮细胞死亡问题，采用重力灌注比手动推动PBS更为温和。
  8. 若仅采集组织用于组织学或免疫荧光分析，请继续执行步骤7.9；若仅采集用于制备单细胞悬液，则剪下所有肺叶并置于冰上PBS中，随后进行步骤7.11。
  9. 用于后续免疫荧光或组织学分析的肺组织膨胀：
    1. 用2%多聚甲醛（PFA）膨胀肺组织，随后经乙醇脱水用于石蜡包埋；或用2% PFA膨胀后经蔗糖脱水用于冷冻切片。
    2. 对于RNAscope或杂交链式反应（HCR）等RNA检测技术，使用4% PFA固定肺组织。为获得最佳固定效果，可在2%超低熔点琼脂糖中膨胀肺组织，立即在振动切片机上切片，并将组织切片置于含2%或4% PFA的培养皿中，用于后续免疫荧光分析。
  10. 手动膨胀肺组织：
    1. 使用注射器配合21–23 G针头（可带或不带导管）手动膨胀肺组织，或通过将PFA导管固定在距实验台面30 cm高的铁架台上，利用重力进行膨胀。
    2. 分离气管后，将针头斜面向上插入气管顶端，避免刺穿气管底部，并在注入液体前收紧气管与针头周围的缝线。
      注：与钝头针相比，使用锐利针头存在轻微气管穿孔风险，研究人员在操作过程中必须格外小心以避免任何损伤。若锐利针头导致气管穿孔，应改用钝头针。
  11. 为进行后续流式细胞术或单细胞测序分析而制备单细胞悬液时，将肺组织从D-PBS中取出，用剪刀剪碎，再用剃刀片切碎2–3分钟，以获得更细小的组织碎片。
  12. 在含有480 U/mL胶原酶I、100 µL/mL分散酶和2 µL/mL DNase的D-PBS消化缓冲液中，于37 °C孵育30–35分钟进行组织解离。依次通过100 µm和40 µm滤膜过滤，使用氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液裂解残留红细胞，并将细胞重悬于含1% BSA的PBS中，用于后续处理与分析。
    注：为检测肺部病毒感染及感染后的病毒清除情况，可通过肺组织匀浆进行qRT-PCR或TCID50检测以评估病毒复制水平。神经氨酸酶和衣壳蛋白染色也可用于检测病毒感染。病毒感染后第8–9天应完成病毒清除18,19，而肺组织的修复与再生则可持续数周9。

结果

与未感染且经PBS处理的小鼠相比，IAV感染小鼠将表现出异质性组织损伤（图1A). 可使用 MATLAB 中的 k-均值聚类算法对组织损伤进行量化20 (图1B）。感染IAV的小鼠通常在感染后3至4天开始出现体重下降。在理想的感染滴度下，小鼠体重将减少初始体重的20%至30%，最大体重下降出现在感染后8至10天（dpi）。图1C）。到感染后11-12天，小鼠应开始恢复体重，并在感染后14天时恢复至初始体重的10-15%范围内。在再生研究中，若实验中的大多数小鼠出现体重下降和组织损伤但未死亡，则较为理想。然而，由于组织损伤存在异质性（图1A,B）以及鼻内给药可能存在的变异性，实验中部分小鼠未出现体重下降或组织损伤，而另有部分小鼠出现体重下降属于正常现象 >30% 体重减轻，导致实施安乐死（图1D). 例如，旨在确定特定基因敲除小鼠与其野生型对照小鼠在存活率和体重减轻方面差异的实验，可能需要调整流感病毒（IAV）的滴度和剂量，并需进行功效分析以确定在上述两个参数中检测到差异所需的样本量。

除了整体组织结构和小鼠健康状况的变化外，在肺组织对损伤的响应过程中，所有肺部细胞区室均会发生转录组层面的改变。这包括随着组织修复而最终消退的短暂细胞状态，例如过渡性或中间态的上皮细胞状态以及髓系免疫细胞状态；同时也包括不参与功能性修复的持续性细胞状态，例如Krt5+上皮细胞和TrkB+内皮细胞9。例如，在小鼠肺毛细血管内皮中，一种短暂的干扰素刺激性内皮细胞状态在感染后第6天（6 dpi）出现，其特征是干扰素刺激基因的高表达（图2A），并在11–19 dpi期间消退（图2A）。一种由损伤诱导的毛细血管内皮（iCAP）状态在11 dpi出现，其特征是Ntrk2（TRKB）、Sparcl1和Bnip3的高表达（图2B）。与干扰素刺激性内皮细胞状态不同，iCAP内皮细胞状态会在严重损伤区域持续存在，并在感染后一年仍可检测到（图2C）。感染后还会出现短暂的肺泡上皮细胞状态，包括肺泡过渡态细胞和未成熟的肺泡I型上皮（AT1）细胞状态（图2D）。最后，感染导致大量内源性肺泡巨噬细胞（aMAC_a）丢失，并由炎症单核细胞（iMON）和内源性aMACs共同重建。感染后一年的肺泡巨噬细胞根据其来源不同，呈现出不同的转录组状态（aMAC_a和aMAC_b）（图2E）9。急性肺损伤后出现的短暂性和持续性细胞状态值得进一步研究，因为它们在微环境中的异常行为可能对组织修复的成功与否以及后续组织功能产生积极或负面的影响。单细胞RNA测序数据此前已发表9，并存入基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus），编号为GEO: GSE262927。

肺部病理示意图；流感感染与对照；组织学、体重减轻和生存曲线。
图 1：监测肺损伤与动物健康状况。（A）左侧为模拟感染（PBS 处理）肺组织切片的苏木精和伊红（HE）染色，右侧为 IAV 感染肺组织切片的 HE 染色。与未受损肺组织相比，IAV 感染肺组织显示出异质性组织损伤。比例尺，1 mm。（B）使用 MATLAB20 中的 k-均值聚类算法，可将组织损伤分为严重（红色）、受损（绿色）或正常（蓝色）。需要注意的是，在左侧 PBS 处理的肺叶中，由于气道上皮细胞的密度和染色强度，气道结构被归类为“严重”损伤。然而，基于此基线仍可清晰区分 PBS 处理肺与流感感染肺。比例尺，1 mm。（C）代表性 IAV 感染实验中的体重减轻曲线示例，其中小鼠肺组织于感染后第 13 天（dpi）采集。该曲线包含六只野生型小鼠的数据，圆点表示均值，误差线表示均值的标准误。（D）代表性 IAV 感染实验中的生存曲线示例，其中小鼠肺组织于感染后第 14 天（dpi）采集。该曲线包含七只野生型小鼠的数据。请点击此处查看此图的放大版本。

干扰素评分分析图、感染进展图、随时间变化的细胞类型比例、显微镜图像。
图 2：监测 IAV 感染后毛细血管内皮细胞状态的变化。（A）在感染后第 6 天（dpi）出现一种干扰素刺激的内皮细胞（EC）状态，并在 11–19 dpi 之间逐渐消退。对流感感染后不同时间点小鼠肺组织已发表的单细胞 RNA 测序数据进行重新分析，结果显示所有毛细血管内皮细胞类型的干扰素模块评分在 6 dpi 时达到最高。数据使用 R 软件重新分析，干扰素模块评分基于每种细胞类型中 87 个干扰素刺激基因的表达水平。CAP1，毛细血管 1 型内皮细胞；iCAP，损伤诱导的内皮细胞；CAP2，毛细血管 2 型内皮细胞；EC，内皮细胞。（B）相比之下，一种以 Ntrk2（TRKB）表达为特征的损伤诱导 EC 状态在 11 dpi 出现，并持续至感染后一年。比例尺：500 µm。（C）流感感染后肺毛细血管内皮细胞的单细胞 RNA 测序转录数据表明，在组织修复过程中，毛细血管内皮细胞状态具有动态变化特性。（D）肺泡上皮细胞在流感感染后也表现出细胞可塑性。一种肺泡过渡态细胞类型在 6–11 dpi 之间出现，并在 19 dpi 时消失。一种不成熟的 AT1 细胞状态（AT1_c）在 11 dpi 出现，并持续至 90 dpi。（E）感染后，大量原有的肺泡巨噬细胞（aMAC_a）丢失，在 6 dpi 可观察到炎性单核细胞（iMON）的大量浸润。肺泡巨噬细胞群体的重建既来源于残存 aMAC 的自我扩增以恢复 aMAC_a 群体，也来源于炎性单核细胞分化形成 aMAC_b 群体。尽管两者均代表肺泡巨噬细胞状态，但所产生的 aMAC 在转录水平上可被区分。图（C–E）中的图表显示了纵向流感感染数据集中各时间点每个细胞群体所占的百分比，图表由 R 软件生成。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：流感感染后动物监测的损伤记录表、体重记录表和体况评分（BCS）记录表。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文报道了一种将流感病毒接种至小鼠的便捷方法，可快速有效地造成小鼠肺组织损伤，进而研究肺组织成功再生与异常修复的机制。我们证明，通过鼻内接种 A/PR/8/34 IAV 是一种无应激的技术：在异氟烷麻醉后，每只小鼠的接种过程耗时不到 2 分钟。该方法操作简便、无创，符合病毒感染的自然途径，能够以更符合生理条件的方式研究组织和免疫系统的反应。通过小鼠鼻腔接种病毒可诱导黏膜免疫和系统性免疫21。更重要的是，病毒感染所造成的损伤在经苏木精-伊红（HE）染色的肺组织切片中清晰可见22（图 1）。此前已有研究发表了小鼠肺部各区域不同肺细胞类型在感染后预期发生的转录组变化的完整时间线9。本文中，我们对其中部分数据进行了重新分析，以证明在小鼠肺部的毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞以及髓系免疫细胞区室中，从无感染状态到感染后一年期间，均会发生短暂性和持续性的转录组变化（图 2）。

本实验方案中有多个关键步骤，对这些步骤进行适当的故障排查将有助于实验成功。A/PR/8/34 流感病毒是一种适应小鼠的流感病毒株，不会在人体内有效感染23，但在实验过程中仍必须严格遵守所有规定的安全操作规程，以避免实验室人员感染的任何可能性。异氟烷麻醉的实施是确保病毒成功递送的关键步骤，因为小鼠在清醒状态下无法有效吸入病毒。操作过程中应检查小鼠的呼吸情况，并监测其头部运动，以确保病毒被接种至两个鼻孔中。如果小鼠未完全麻醉，可能会产生气泡，这不仅会限制病毒的吸入，还可能产生气溶胶。上述两种情况均应避免；若观察到小鼠出现打喷嚏或鼻孔处有气泡，应立即将其重新置于异氟烷鼻罩下。感染后的监测，如体重变化、体况评分、健康状况评估以及提供恢复期营养补充剂，也是本实验的重要组成部分。如果发现小鼠体重下降不足或组织损伤程度未达预期（图 1），可能是病毒剂量过低；相反，若大量小鼠达到体重下降30%的实验终点，则可能是剂量过高。在这两种情况下，最好通过使用一群C57BL/6小鼠对病毒批次进行经验性滴定，以确定合适的剂量。

由于流感感染在全球范围内持续流行，可引发严重的呼吸道疾病并可能导致死亡，因此了解病毒感染过程以及肺部对感染和组织损伤的细胞反应至关重要。本研究中描述的鼻内感染方法因此可能有助于识别重要的调控机制，并为肺部疾病开发新的治疗方法。此外，该技术的未来应用可采用不同类型的鼠适应性流感病毒株（如X31），以研究反复呼吸道感染对肺组织结构和功能的影响。鉴于许多人在一生中会经历多次呼吸道感染，对该模型的此类扩展可能对肺组织再生研究以及公共卫生具有重要意义。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所癌症研究中心的院内研究计划资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管 Fisher Scientific02-682-557
100 µm 细胞滤网Falcon352360
15 mL 锥形离心管Falcon352196
1× PBSGibco10010-023
40 µm 细胞滤网Falcon352340
5 mL 离心管Globe6101C
50 mL 锥形离心管Falcon352098
A/PR/8/34 流感病毒原液ATCC VR-95PQ不同批次病毒滴度不同
ACK 裂解缓冲液Quality Biological118-156-101
抗 TRKB 抗体R&D SystemsAF1494
次氯酸钠溶液（漂白剂）Clorox使用 10% 次氯酸钠溶液
牛血清白蛋白Sigma AldrichA8022
CO2 麻醉诱导室任意品牌N/A
I 型胶原酶Gibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
中性蛋白酶（Dispase）CorningCB-40235
解剖工具：剪刀、弯头镊子、直头镊子任意品牌N/A
脱氧核糖核酸酶（DNase）Sigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
乙醇Pharmco111000200
玻璃小瓶DWK Life Sciences986562
冰桶任意品牌N/A
异氟烷（Isoflurane）Covetrus29404
针头，21–23 G任意品牌N/A
P20/P200 移液器 PipetmanF144056M/F144058M,
P20/P200 移液器吸头Thomas Scientific1159M43/1159M40
多聚甲醛（PFA） Thermo ScientificJ19943-k2使用 2% PFA
移液器（Pipetman）任意品牌N/A
塑料或纸板冷冻盒任意品牌N/A
刀片任意品牌N/A
铁架台任意品牌N/A
5 mL 血清移液管Falcon357543
滑盖式小鼠异氟烷麻醉诱导室Somni Scientific
缝合线Fisher ScientificNC9422522
注射器管路及鲁尔锁接头任意品牌N/A
10 mL 注射器任意品牌N/A
台式异氟烷麻醉机OhmedaOhmeda Isotec-4气流速率应为 2.5–3%
超低熔点琼脂糖Sigma AldrichA5030-1G
电子天平OHAUSCS200

参考文献

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模拟流感感染后肺泡的发育异常与功能性修复
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