本方案详细描述了小鼠眼晶状体上皮细胞与纤维细胞大量组织的分离步骤，随后进行RNA提取及qPCR分析。该方法可实现晶状体不同细胞区室的分离，从而更深入地分析上皮细胞与已分化的纤维细胞在转录组及生物学过程中的差异。
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摘要
摘要
晶状体是位于眼球前房的一种特化的透明组织，由两种主要细胞类型构成：上皮细胞和纤维细胞。单层晶状体上皮细胞覆盖在晶状体的前半部分，而晶状体的大部分则由大量晶状体纤维细胞组成。一层胶原性质的基底膜（称为囊膜）包裹并包被整个组织。晶状体上皮细胞紧密附着于晶状体囊膜上，通过将囊膜从组织上剥离，可轻易地将上皮细胞与主体纤维细胞分离。由于晶状体单层中的上皮细胞数量较少，难以获得足够浓度的RNA，这在过去阻碍了上皮细胞与纤维细胞转录组的比较研究。本实验方案提供了一种方法，可清晰分离并纯化上皮细胞和纤维细胞组分，并通过RNA浓缩步骤，使得后续能够对来自单对小鼠晶状体的上皮细胞样本进行转录组学实验。对晶状体主要细胞类型进行独立研究的能力，有助于深入探究晶状体维持与失调的生物学机制，从而能够鉴定出导致年龄相关性晶状体病变的细胞类型特异性紊乱因素。
引言
晶状体是一个透明器官，可将光线精确聚焦到视网膜上，从而形成清晰的图像。晶状体主要由两种细胞类型构成：覆盖前半球表面的单层上皮细胞，以及构成组织大部分体积的纤维细胞（图1）。晶状体被一层胶原基底膜包裹，这层膜被称为晶状体囊，上皮细胞紧密附着于其上。随着晶状体的生长，赤道区的上皮细胞不断增殖并分化为新生的纤维细胞层，以同心圆方式逐层叠加于晶状体上1,2,3。终生的晶状体生长依赖于赤道区一小群构成生发区的上皮细胞持续增殖4。当纤维细胞成熟时，所有细胞器均被降解，以消除可能引起光散射的结构5,6,7,8,9,10,11，从而维持组织透明性；最内层的纤维细胞最终被压缩，形成坚硬的晶状体核心9,12。由于周围存在晶状体囊，晶状体内没有细胞更新，最初的纤维细胞终生保留在晶状体中心，而新的纤维细胞则在组织周边或皮质处不断添加。晶状体的纤维细胞因其年龄不同而具有不同的光学特性，能够提供各个特定发育阶段生物学特征的时间截面信息13。
尽管已有多种手术治疗方案，白内障——定义为原本透明的晶状体出现任何混浊——仍是全球失明的首要原因14。白内障可在晶状体上皮、皮质或核中发生，其病理生理学机制各不相同15。然而，白内障形成的细胞与分子机制仍不明确16,17。为了更深入地理解如何预防这些不同类型的白内障，并开发替代手术的治疗方法，我们必须更清楚地了解这些不同细胞类型在晶状体中是如何维持其稳态的。
晶状体上皮细胞和纤维细胞在晶状体中发挥不同的生理功能。例如，细胞增殖仅局限于晶状体上皮层18。与此同时，晶状体纤维细胞构成了晶状体的主体部分，为晶状体提供结构支持和屈光特性9。为了更深入地理解晶状体不同区域所涉及的生物学过程，必须分别对上皮细胞和纤维细胞进行研究。本文介绍一种方法，用于将上皮层与纤维细胞主体部分分离，从各组分中提取mRNA，并利用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）对这些转录产物进行分析。
图1：晶状体解剖结构示意图。 晶状体由两种细胞类型组成：覆盖前半球的单层上皮细胞（蓝色和橙色）以及大量晶状体纤维（白色）。该组织被一层薄的胶原膜包裹，称为晶状体囊（浅褐色）。前部上皮细胞（蓝色）处于静息状态，而赤道部上皮细胞（橙色）则增殖、分化并伸长，形成晶状体周边新的纤维细胞层（白色）。新一代的纤维细胞以同心壳层的方式叠加在先前生成的纤维细胞之上。最古老的晶状体纤维细胞被压缩至组织中心。本图经 Cheng（2024）38 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
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方案
所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及印第安纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 工作区域、仪器和试剂的准备
- 使用前将移液器吸头进行高压灭菌，并指定专用的灭菌吸头盒用于RNA实验，以避免RNase污染。
- 用RNase去污染溶液处理通风橱内的工作表面及组织匀浆研杵，再用去离子水彻底冲洗并干燥。
- 将解剖工具（弯头镊子、直头镊子和显微解剖剪）浸入70%乙醇中5分钟，使用前用无尘擦拭纸擦干。
- 解剖及组织分离步骤中使用全新的解剖托盘和培养皿。
- 在通风橱内，将400 µL冷的TRIzol酸-胍-苯酚试剂分装至无DNA酶和RNA酶的1.5 mL微量离心管中。
2. 小鼠晶状体解剖
- 使用过量 CO2 处死成年小鼠，随后以颈椎脱位作为辅助措施。
- 使用弯头镊子摘除眼球。
- 用镊子轻轻按压眼球周围组织，使眼球从眼窝中突出。将镊子闭合于眼球下方，稳定向上牵拉以摘除眼球。
- 将眼球转移至含有 750–1000 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的 1.5 mL 微离心管中。
- 进行解剖时，将眼球转移至解剖托盘的孔穴中，加入新鲜的 1× PBS。
- 在解剖显微镜下，用直头镊子夹住视神经根部，并用锋利的显微解剖剪尽可能靠近眼球处剪断视神经。
- 将精细的直头镊子小心插入视神经原先连接的开口处，夹紧以固定组织。
- 将显微解剖剪的尖端插入同一开口，从眼球后极小心剪向角膜-巩膜交界处。切勿将器械插入过深，以免损伤晶状体。
注意：啮齿类动物的晶状体在眼球中占据较大体积，因此建议进行浅层切割，以防刺破晶状体。 - 使用显微解剖剪沿角膜-巩膜交界处剪开，至少分离眼球周长的一半。
- 用直头镊子轻轻翻转眼球组织，同时按压角膜，使晶状体从角膜-巩膜切口处挤出。
- 使用精细的直头镊子小心去除附着在晶状体上的大块组织。
- 如有需要，可用弯头镊子将晶状体在洁净的精细擦拭纸上轻轻滚动，以去除残留的附着眼外组织。
注意：应快速在擦拭纸上滚动组织，避免组织过度干燥。晶状体表面可能出现因干燥斑点导致的微小浑浊，但将晶状体重新放入 1× PBS 后，这些浑浊通常可逆，不会影响后续操作。 - 将清洁后的晶状体转移至含有 1× PBS 的 6 cm 培养皿中。
- 使用精细的直头镊子在晶状体赤道附近浅刺晶状体囊膜，然后轻轻将囊膜从纤维主体上剥离。晶状体上皮细胞将保留在囊膜上。轻轻去除在去囊过程中可能附带脱落的大块纤维组织。
- 用精细的直头镊子夹住囊膜，在 1× PBS 中轻轻搅动，以去除残留的纤维。任何松散附着的纤维细胞将从囊膜和上皮细胞上解离。
3. RNA 提取
注意：RNA 提取的简化工作流程见图2。
- 将2个晶状体囊或2份纤维团块分别放入含有400 µL冷TRIzol试剂的1.5 mL微量离心管中。
注意：应使用弯头镊子从培养皿中转移纤维团块至离心管，以舀取组织。 - 盖紧管盖，将离心管转移至化学通风橱中进行后续操作。
- 使用洁净的研磨杵轻柔匀浆晶状体纤维团块。
注意：务必彻底打散纤维团块。 - 在通风橱中，将样品（晶状体囊或匀浆后的纤维团块）在TRIzol试剂中于室温孵育30分钟。
- 在通风橱中，向每管含400 µL TRIzol试剂的样品中加入200 µL氯仿。盖紧管盖后用手剧烈振荡15秒，拇指抵住管底，食指压紧管盖。
注意：材料清单中提到的1.5 mL微量离心管因其密封性良好而被选用。若使用其他品牌的微量离心管，请在振荡前测试管盖闭合性和密封性，以防TRIzol与氯仿混合液从密封不严的管盖下泄漏。 - 于室温孵育样品10–15分钟，以促进相分离。
注意：离心管底部应出现粉红色的TRIzol试剂层（含脂质和蛋白质），中间为白色层（含DNA），顶部为透明水相层（含RNA）。在上皮细胞样品中，白色DNA层可能较难观察。 - 在4 °C条件下以14,000 × g离心15分钟。
注意：将离心管小心放入和取出离心机时，注意避免扰动各相分层。 - 准备RNA纯化浓缩试剂盒中的离心柱管和相关试剂。将离心柱插入试剂盒提供的收集管中。
- 在通风橱中，小心吸取透明水相（上层）转移至新的1.5 mL洁净微量离心管中，并记录体积。
注意：避免扰动、接触或吸起水相下方的白色DNA层。转移水相时可倾斜离心管，以避开白色层。宁可残留少量水相在原管中，也不应污染样品。通常在加入200 µL氯仿后，可回收180–190 µL水相。 - 按1:1体积比向水相中加入无水乙醇。
注意：可在加入乙醇前，先按2:1体积比加入浓缩试剂盒中的RNA结合缓冲液。此步骤可省略，以提高RNA得率，且因RNA在分离后已具备足够纯度。 - 通过反复倒置离心管或移液吹打数次，轻柔混匀溶液。使用移液器将混合液转移至RNA离心柱中。
注意：移液时避免枪头接触滤膜。 - 在4 °C条件下以16,000 × g离心30秒。
注意：建议在离心柱盖和收集管侧面做好标记，以便区分配套的管组，防止后续离心过程中盖子断裂脱落。 - 弃去穿滤液，向离心柱中加入400 µL RNA预洗缓冲液。
- 在4 °C条件下以16,000 × g离心30秒。
- 弃去穿滤液，向离心柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液。
- 在4 °C条件下以16,000 × g离心30秒。
- 弃去穿滤液，向离心柱中加入400 µL RNA洗涤缓冲液。
- 在4 °C条件下以16,000 × g离心1分钟。
- 弃去穿滤液，再次在4 °C条件下以16,000 × g离心30秒，确保离心柱完全干燥。
- 将离心柱转移至一个新的已标记1.5 mL微量离心管中。
- 向膜滤器上加入15 µL无RNase水，在室温孵育2分钟。
注意：移液时避免枪头接触滤膜。 - 在4 °C条件下以16,000 × g离心30秒，以洗脱纯化的RNA。
注意：离心过程中1.5 mL微量离心管的管盖保持打开状态。应小心放置离心柱和微量离心管，使敞口管盖紧贴转子盖，防止其在离心过程中摆动或断裂。管盖应朝向转子旋转方向的后方。 - 取下并丢弃离心柱。RNA将存在于1.5 mL微量离心管收集的液体中。
- 盖紧1.5 mL微量离心管，将RNA样品在55–65 °C孵育10分钟，以促进RNA重新溶解。
- 加热后立即将样品置于冰上。
- 将样品储存于-80 °C，或反转录为cDNA以实现长期保存。
注意：RNA样品在储存长达3个月期间未见明显浓度下降。建议将RNA分装为小体积储存，以减少冻融循环次数，防止降解。
4. 使用紫外-可见分光光度计测量RNA浓度
- 将RNA样品置于冰上，打开NanoDrop（紫外-可见分光光度计）电源，等待仪器初始化完成。
- 在核酸菜单下，选择RNA定量模块。
- 使用移液器将RNA浓缩步骤中的洗脱液（本例中为分子生物学级水）取2.0 µL加到样品台，升起仪器臂并测量空白样品。
- 抬起仪器臂，先用洁净干燥的精密擦拭纸清洁传感器样品台，再用去离子水润湿的擦拭纸擦拭一次，最后再用干燥的擦拭纸擦干。
- 如有需要，可在紫外-可见分光光度计界面上输入样品信息。
- 将2.0 µL的RNA样品加到样品台上，放下仪器臂，进行定量测定。
- 重复步骤4.4至4.6，以在不同样品之间清洁样品台。
- 实验结束后，如有需要，保存并导出实验数据以进行进一步分析。
5. 逆转录
- 使用一种高效且耐热的逆转录酶，按照制造商推荐的方案，对2.0 µg晶状体纤维RNA以及所有提取的上皮细胞RNA进行逆转录。在洁净的PCR管中混合各反应体系组分和RNA。所有溶液和RNA样品均需置于冰上。
注意：该逆转录酶每反应最多可处理2.5 µg RNA。假设RNA完全转化为cDNA，因此将起始RNA浓度视为cDNA的理论浓度。 - 在PCR仪中按照表1所列条件运行反应。
- 将逆转录得到的cDNA储存于-80 °C，或直接进行qPCR步骤。
注意：cDNA比RNA更稳定，实验中cDNA样品储存长达4个月未见明显降解。若尽量减少冻融循环，样品可能可保存更长时间。
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 (min) | 循环次数 |
| 退火 | 25 | 10 | 1 |
| 逆转录 | 50 | 10 | 1 |
| 酶失活 | 85 | 5 | 1 |
| 保持 | 4 | ∞ | 1 |
表1：逆转录的PCR仪反应条件。这些条件针对一种特定的、具有高度持续性和耐热性的逆转录酶进行优化。运行条件可能因所使用的酶和试剂盒不同而有所差异。
6. 定量实时 PCR
- 在开始反应前，使用分子级水将cDNA稀释至所需浓度，制备cDNA储存液。在本实验中，每孔反应使用1 µL浓度为5 ng/µL的cDNA，即每孔加入5 ng cDNA。所有溶液和cDNA样品均需置于冰上保存。
注意：建议使用TaqMan阵列板（0.1 mL规格），以适应每孔5–50 ng cDNA的反应体系。将cDNA分装成小份有助于减少冻融循环次数。本研究中，样品冻融次数最多不超过5次。 - 根据商业试剂说明书推荐的方法，配制包含Advanced Master Mix和探针的工作用主混合液。示例配制方法见第7节。所有溶液和cDNA样品均需置于冰上保存。
注意：通常每个反应孔使用一对带有两种不同荧光染料的探针。例如，在本研究中，以Crygs-FAM-MGB作为目的基因探针，Ppia-VIC-MGB作为内参对照。探针和引物的终浓度推荐值分别为250 nM和900 nM。若目标基因表达水平极高，可能需要使用引物限制型探针，以防止反应试剂耗尽。 - 将cDNA储存液（1 µL）加入qPCR板的相应孔中，随后加入工作主混合液（9 µL）。在加入主混合液时，通过缓慢吹打混匀溶液。确保cDNA液滴完全混入溶液中，并避免产生气泡。
注意：根据目标物的检测灵敏度，可能需要在冰上进行加样操作。 - 小心地贴上光学粘性封膜，密封qPCR板。使用封膜压平仪压平封膜，确保每个孔周围均密封良好。
- 将qPCR板在1000 RPM条件下涡旋振荡10秒，以充分混匀。
- 在室温下以1000 × g 离心2分钟，确保各孔底部无气泡残留。
- 将qPCR板放入定量PCR仪中，按照表2列出的循环程序运行。
注意：常规qPCR程序通常最多设置40个循环。增加循环数通常不会产生有意义的结果，因为在40个循环后，单个目标拷贝理论上可扩增出约1万亿个产物分子19。
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 (s) | 循环次数 |
| 尿嘧啶-N-糖基化酶 (UNG) 失活 | 50 | 120 | 1 |
| 变性 | 95 | 120 | 1 |
| 变性 | 95 | 1 | 45 |
| 退火 | 60 | 20 | |
| 保持 | 4 | ∞ | 1 |
表2：定量聚合酶链式反应的热循环仪条件。 这些条件针对一系列特定的商用基因表达检测试剂盒进行了优化。除将扩增循环次数从40次增加至45次外，其余均采用默认参数。
7. qPCR 体积计算示例
注意：用于计算下述方程体积的 R 源代码可在补充文件1中获取。该计算器适用于材料表中所列的 Taqman 探针和预混液。
- 确定需要移液的孔数，并计算至少12.5%的过量体积。该过量常数（kExcess）用于补偿移液误差，确保溶液充足。本示例中，样品制备的目标为96孔。
公式：
示例：
注意：如果12.5%的过量值不是整数，为便于后续步骤中获得“整齐”的数值，可向上取整至最接近的整孔数，并相应调整kExcess。 - 计算工作母液的总体积。在这些实验中，每孔使用1 µL cDNA和9 µL工作母液。可根据需要调整cDNA和母液的体积。
公式：
示例：
- 计算浓度修正系数（kConc）。该系数用于配制更高浓度的工作母液，使其与cDNA混合后稀释至1x终浓度。
公式：
示例：
- 计算探针（20x）的体积。
公式：
示例：
- 计算母液原液（2x）的体积。
公式：
示例：
- 使用分子生物学级H2O将工作母液补足至计算所得体积。
公式：
示例：
补充文件 1：用于体积计算的 R 源代码。 请点击此处下载该文件。
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结果
从6至7周龄的野生型小鼠中分离出晶状体上皮细胞和晶状体纤维。这些实验共使用了三只小鼠，每只小鼠的2个晶状体囊或2份纤维细胞团块合并为一个生物学重复样本。如实验方案所述，采用TRIzol试剂进行相分离提取RNA。平均而言，一对晶状体上皮组织和纤维组织分别可获得0.8 µg（标准差±0.2）和9.7 µg（标准差±2.3）的RNA。在15 µL洗脱体积中，上皮样本和纤维样本的平均浓度分别为55.4 ng/µL（标准差±16.3）和650.0 ng/µL（标准差±152.2）。使用每孔5 ng的反应体系，理论上该方法从一对晶状体上皮组织中提取的RNA可支持平均160次反应。通过A260/A280比值测定的RNA纯度平均值分别为：上皮组织1.92（标准差±0.05），纤维组织2.05（标准差±0.01），表明蛋白污染极少。通常，A260/A280比值约为2.0时被认为RNA纯度较高20。总体而言，该分离方法获得了足够浓度且高纯度的RNA，可用于反转录为cDNA并进行多次qPCR实验。
我们按照方案所述进行了逆转录和定量PCR。为了通过实时定量...
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讨论
本文所述步骤展示了从晶状体不同区室中分离RNA的能力，所获RNA可成功逆转录为cDNA，用于分子生物学实验。由于分析方法具有较高的敏感性，在解剖阶段必须确保晶状体表面无附着组织。为达到足够的洁净度，可能需要将晶状体在Kimwipe纸巾上滚动数次。在分离胶原囊膜与纤维组织主体区室时，操作需谨慎，避免插入过深，以防纤维细胞大量污染上皮细胞样本。晶状体上皮细胞紧密附着于囊膜，而上皮细胞与下方纤维细胞之间的连接相对较弱，因此可实现囊膜及其附着的上皮细胞与纤维细胞团块的干净分离。一旦完成晶状体区室的分离并将其置入TRIzol试剂中，样品应在化学通风橱中进行后续处理，以避免有害气体暴露，并防止所提取RNA的污染与降解。
RNA 提取过程采用了一种经过改良的商业试剂盒（RNA Clean and Concentrator 5 Kit）操作流程。以往，由于每个晶状体提供的起始细胞数量较少，从上皮细胞中提取出足够浓度且高纯度的 RNA 存在困难。使用 RNA 浓缩试剂盒后，现已能够从成对的晶状体上皮组织片中成功提取 RNA。根据我们的测试结果，我们省略了商业试剂盒方案中的 RNA 结合步骤和 DNa...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立眼科研究所资助，资助编号为 R01 EY032056（授予 CC）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机和转子 | Fisher Scientific | 14285554PM | |
| 氯仿，HPLC 级 | Alfa Aesar | 22920 | |
| 乙醇（190-proof） | Decon Labs | 2801 | |
| 乙醇（200度） | Fisher BioReagents | BP2818 | |
| Fisherbrand 研磨杵 | Fisher Scientific | 12-141-363 | |
| 弯头镊子；7号学生镊子 | World Precision Instruments | 501981 | |
| 直头镊子；Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| 直头镊子；学生用镊子 #4 | 世界精密仪器公司 | 501978 | |
| Kimwipes，小型 | Kimberly-Clark | 34155 | 精细操作擦拭 |
| MicroAmp 粘性封膜压膜器 | 应用生物系统公司 | 4333183 | |
| MicroAmp EnduraPlate 光学 96 孔快速透明反应板（带条形码） | 应用生物系统公司 | 4483485 | |
| 微量移液器 | Eppendorf | 01-671-120 | |
| 显微镜，解剖 | 卡尔·蔡司 | SteREO Discovery.V8 | |
| MiniAmp 光学粘合盖 | 应用生物系统公司 | 4360954 | |
| MiniAmp 热循环仪 | 应用生物系统公司 | A37834 | |
| MixMate 平板涡旋混合器 | Eppendorf | 5353000529 | |
| 分子生物学级水 | Fisher Scientific | BP28191 | |
| Nanodrop One 微量紫外-可见分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-ONE-W | |
| Nunc MicroWell MiniTrays | Fisher Scientific | 12-565-154 | 解剖托盘 |
| PCR管 | VWR | 201007-012 | |
| 培养皿，60 mm × 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 磷酸盐缓冲液，1x 达尔伯克氏液 | Gibco | 14190-136 | |
| 移液器吸头，10 µL 刻度 | USA Scientific | 1161-3700 | |
| 移液器吸头，1250 µL XL 量筒 | USA Scientific | 1161-1720 | |
| 移液器吸头，200 µL型轮廓梯度尺 | USA Scientific | 1163-1700 | |
| QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统 | 应用生物系统公司 | A28567 | |
| 逆转录酶，SuperScript IV VILO | Invitrogen | 11756050 | 高度持续性和耐热的逆转录酶 |
| RNA纯化浓缩5号试剂盒 | Zymo | ZR1013 | |
| 无RNase水 | Fisher BioReagents | BP2819 | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | RNase 去污染溶液 |
| SealRite 微量离心管 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| SuperFine Vannas 8 cm | 世界精密仪器公司 | 501778 | 剪刀 |
| 用于qPCR的TaqMan FAST Advanced预混液 | 应用生物系统公司 | 4444557 | |
| TaqMan 基因表达检测（FAM）探针（MTO） | 赛默飞世尔科技 | 4448892 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | 酸-胍基-苯酚溶液 |
| 涡旋混合器 | 赛默飞世尔科技 | 88880017 |
参考文献
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