从小鼠眼晶状体上皮和纤维细胞团块中分离RNA

摘要

本方案详细描述了小鼠眼晶状体上皮细胞与纤维细胞大量组织的分离步骤，随后进行RNA提取及qPCR分析。该方法可实现晶状体不同细胞区室的分离，从而更深入地分析上皮细胞与已分化的纤维细胞在转录组及生物学过程中的差异。

摘要

晶状体是位于眼球前房的一种特化的透明组织，由两种主要细胞类型构成：上皮细胞和纤维细胞。单层晶状体上皮细胞覆盖在晶状体的前半部分，而晶状体的大部分则由大量晶状体纤维细胞组成。一层胶原性质的基底膜（称为囊膜）包裹并包被整个组织。晶状体上皮细胞紧密附着于晶状体囊膜上，通过将囊膜从组织上剥离，可轻易地将上皮细胞与主体纤维细胞分离。由于晶状体单层中的上皮细胞数量较少，难以获得足够浓度的RNA，这在过去阻碍了上皮细胞与纤维细胞转录组的比较研究。本实验方案提供了一种方法，可清晰分离并纯化上皮细胞和纤维细胞组分，并通过RNA浓缩步骤，使得后续能够对来自单对小鼠晶状体的上皮细胞样本进行转录组学实验。对晶状体主要细胞类型进行独立研究的能力，有助于深入探究晶状体维持与失调的生物学机制，从而能够鉴定出导致年龄相关性晶状体病变的细胞类型特异性紊乱因素。

引言

晶状体是一个透明器官，可将光线精确聚焦到视网膜上，从而形成清晰的图像。晶状体主要由两种细胞类型构成：覆盖前半球表面的单层上皮细胞，以及构成组织大部分体积的纤维细胞（图1）。晶状体被一层胶原基底膜包裹，这层膜被称为晶状体囊，上皮细胞紧密附着于其上。随着晶状体的生长，赤道区的上皮细胞不断增殖并分化为新生的纤维细胞层，以同心圆方式逐层叠加于晶状体上^1,2,3。终生的晶状体生长依赖于赤道区一小群构成生发区的上皮细胞持续增殖⁴。当纤维细胞成熟时，所有细胞器均被降解，以消除可能引起光散射的结构^{5,6,7,8,9,10,11}，从而维持组织透明性；最内层的纤维细胞最终被压缩，形成坚硬的晶状体核心<....

方案

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及印第安纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 工作区域、仪器和试剂的准备

1. 使用前将移液器吸头进行高压灭菌，并指定专用的灭菌吸头盒用于RNA实验，以避免RNase污染。
2. 用RNase去污染溶液处理通风橱内的工作表面及组织匀浆研杵，再用去离子水彻底冲洗并干燥。
3. 将解剖工具（弯头镊子、直头镊子和显微解剖剪）浸入70%乙醇中5分钟，使用前用无尘擦拭纸擦干。
4. 解剖及组织分离步骤中使用全新的解剖托盘和培养皿。
5. 在通风橱内，将400 µL冷的TRIzol酸-胍-苯酚试剂分装至无DNA酶和RNA酶的1.5 mL微量离心管中。

2. 小鼠晶状体解剖

1. 使用过量 CO₂ 处死成年小鼠，随后以颈椎脱位作为辅助措施。
2. 使用弯头镊子摘除眼球。
   1. 用镊子轻轻按压眼球周围组织，使眼球从眼窝中突出。将镊子闭合于眼球下方，稳定向上牵拉以摘除眼球。
   2. 将眼球转移至含有 750–1000 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的 1.5 mL 微离心管中。
   ....

结果

从6至7周龄的野生型小鼠中分离出晶状体上皮细胞和晶状体纤维。这些实验共使用了三只小鼠，每只小鼠的2个晶状体囊或2份纤维细胞团块合并为一个生物学重复样本。如实验方案所述，采用TRIzol试剂进行相分离提取RNA。平均而言，一对晶状体上皮组织和纤维组织分别可获得0.8 µg（标准差±0.2）和9.7 µg（标准差±2.3）的RNA。在15 µL洗脱体积中，上皮样本和纤维样本的平均浓度分别为55.4 ng/µL（标准差±16.3）和650.0 ng/µL（标准差±152.2）。使用每孔5 ng的反应体系，理论上该方法从一对晶状体上皮组织中提取的RNA可支持平均160次反应。通过A260/A280比值测定的RNA纯度平均值分别为：上皮组织1.92（标准差±0.05），纤维组织2.05（标准差±0.01），表明蛋白污染极少。通常，A260/A280比值约为2.0时被认为RNA纯度较高²⁰。总体而言，该分离方法获得了足够浓度且高纯度的RNA，可用于反转录为cDNA并进行多次qPCR实验。

我们按照方案所述进行了逆转录和定量PCR。为了通过实时定量.......

讨论

本文所述步骤展示了从晶状体不同区室中分离RNA的能力，所获RNA可成功逆转录为cDNA，用于分子生物学实验。由于分析方法具有较高的敏感性，在解剖阶段必须确保晶状体表面无附着组织。为达到足够的洁净度，可能需要将晶状体在Kimwipe纸巾上滚动数次。在分离胶原囊膜与纤维组织主体区室时，操作需谨慎，避免插入过深，以防纤维细胞大量污染上皮细胞样本。晶状体上皮细胞紧密附着于囊膜，而上皮细胞与下方纤维细胞之间的连接相对较弱，因此可实现囊膜及其附着的上皮细胞与纤维细胞团块的干净分离。一旦完成晶状体区室的分离并将其置入TRIzol试剂中，样品应在化学通风橱中进行后续处理，以避免有害气体暴露，并防止所提取RNA的污染与降解。

RNA 提取过程采用了一种经过改良的商业试剂盒（RNA Clean and Concentrator 5 Kit）操作流程。以往，由于每个晶状体提供的起始细胞数量较少，从上皮细胞中提取出足够浓度且高纯度的 RNA 存在困难。使用 RNA 浓缩试剂盒后，现已能够从成对的晶状体上皮组织片中成功提取 RNA。根据我们的测试结果，我们省略了商业试剂盒方案中的 RNA 结合步骤和 DNa.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机和转子	Fisher Scientific	14285554PM
氯仿，HPLC 级	Alfa Aesar	22920
乙醇（190-proof）	Decon Labs	2801
乙醇（200度）	Fisher BioReagents	BP2818
Fisherbrand 研磨杵	Fisher Scientific	12-141-363
弯头镊子；7号学生镊子	World Precision Instruments	501981
直头镊子；Dumont #5	Fine Science Tools	11252-40
直头镊子；学生用镊子 #4	世界精密仪器公司	501978
Kimwipes，小型	Kimberly-Clark	34155	精细操作擦拭
MicroAmp 粘性封膜压膜器	应用生物系统公司	4333183
MicroAmp EnduraPlate 光学 96 孔快速透明反应板（带条形码）	应用生物系统公司	4483485
微量移液器	Eppendorf	01-671-120
显微镜，解剖	卡尔·蔡司	SteREO Discovery.V8
MiniAmp 光学粘合盖	应用生物系统公司	4360954
MiniAmp 热循环仪	应用生物系统公司	A37834
MixMate 平板涡旋混合器	Eppendorf	5353000529
分子生物学级水	Fisher Scientific	BP28191
Nanodrop One 微量紫外-可见分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-ONE-W
Nunc MicroWell MiniTrays	Fisher Scientific	12-565-154	解剖托盘
PCR管	VWR	201007-012
培养皿，60 mm × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
磷酸盐缓冲液，1x 达尔伯克氏液	Gibco	14190-136
移液器吸头，10 µL 刻度	USA Scientific	1161-3700
移液器吸头，1250 µL XL 量筒	USA Scientific	1161-1720
移液器吸头，200 µL型轮廓梯度尺	USA Scientific	1163-1700
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统	应用生物系统公司	A28567
逆转录酶，SuperScript IV VILO	Invitrogen	11756050	高度持续性和耐热的逆转录酶
RNA纯化浓缩5号试剂盒	Zymo	ZR1013
无RNase水	Fisher BioReagents	BP2819
RNaseZap	Sigma	R2020	RNase 去污染溶液
SealRite 微量离心管 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
SuperFine Vannas 8 cm	世界精密仪器公司	501778	剪刀
用于qPCR的TaqMan FAST Advanced预混液	应用生物系统公司	4444557
TaqMan 基因表达检测（FAM）探针（MTO）	赛默飞世尔科技	4448892
TRIzol	Invitrogen	15596026	酸-胍基-苯酚溶液
涡旋混合器	赛默飞世尔科技	88880017