从小鼠晶状体上皮和纤维细胞块块中分离 RNA

晶状体是一种透明器官，可将光线精细地聚焦到视网膜上以产生清晰的图像。晶状体由两种主要细胞类型组成：覆盖前半球的单层上皮细胞和构成组织大块的纤维细胞（图1）。晶状体被称为晶状体囊的胶原基底膜包裹，上皮细胞紧紧粘附在膜上。随着晶状体的生长，赤道的上皮细胞增殖并分化成纤维细胞的新生壳，这些纤维细胞以同心方式分层到晶状体上^1,2,3。晶状体的终生生长取决于构成发芽区⁴ 的这一小群赤道上皮细胞的持续增殖。随着纤维细胞的成熟，所有细胞器都被降解以消除光散射物体5,6,7,8,9,10,11并保持组织透明度，最里面的纤维细胞最终被压实，从而产生刚性晶状体中心^9,12.由于周围的晶状体囊，晶状体中没有细胞更新，并且随着在组织外围或皮层添加新纤维，精纤维在整个生命周期中都保留在晶状体的中心。晶状体的纤维细胞根据其年龄具有不同的光学特性，并且可以提供每个给定阶段不同生物学特性的时间快照¹³。

尽管有可用的手术选择，但白内障（定义为通常透明晶状体的任何混浊）仍然是世界上失明的主要原因¹⁴。白内障可表现在晶状体上皮、皮层或晶状体核中，具有不同的病理生理学¹⁵。然而，白内障形成的细胞和分子机制仍不清楚^16,17。为了更好地了解如何预防这些不同类型的白内障并开发手术的替代方案，我们必须更好地了解这些不同的细胞类型如何在晶状体中维持体内稳态。

上皮细胞和纤维细胞在晶状体中起着不同的生理作用。例如，细胞增殖仅限于晶状体上皮¹⁸。同时，透镜纤维构成透镜的体积，为透镜⁹提供结构和折射性能。为了更细致地了解晶状体不同隔室中涉及的生物过程，必须分别研究上皮细胞和纤维细胞。在这里，我们提出了一种从纤维细胞块块中分离上皮细胞的方法，从每个部分中提取mRNA，并使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析这些转录本。

图 1：晶状体解剖图。 晶状体由两种细胞类型组成，一种是覆盖前半球的单层上皮细胞（蓝色和橙色），另一种是大量晶状体纤维（白色）。该组织被一层薄薄的胶原膜包围，称为晶状体囊（棕褐色）。前上皮细胞（蓝色）静止，而赤道上皮细胞（橙色）增殖、分化和伸长，在晶状体外围成为新的纤维细胞层（白色）。新一代纤维细胞覆盖在同心壳中的前几代纤维上。最古老的晶状体纤维细胞被压实到组织的中心。该图已根据 Cheng （2024）³⁸ 修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

所有动物实验均根据美国国立卫生研究院的“实验动物护理和使用指南”以及印第安纳大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的协议进行。

1. 工作区域、设备和试剂制备

1. 使用前高压灭菌移液器吸头，并指定高压灭菌吸头盒用于 RNA 实验，以避免 RNase 污染。
2. 用RNase去污液处理通风橱和组织均质杵中的工作表面积，用去离子水彻底冲洗，然后干燥。
3. 将解剖工具（弯曲的镊子，直的镊子和显微解剖剪刀）浸泡在70%乙醇中5分钟，并在使用前用精致的擦拭擦干。
4. 使用全新的解剖托盘和培养皿进行解剖和组织分离步骤。
5. 将 400 μL 冷 TRIzol 酸-胍-苯酚试剂等分到通风橱中不含 DNAse 和 RNAse 的 1.5 mL 微量离心管中。

2. 小鼠晶状体解剖

1. 使用CO₂ 过量对成年小鼠实施安乐死，然后以颈椎脱位作为次要措施。
2. 使用弯曲的镊子对眼睛进行剜除。
   1. 用镊子轻轻压住眼睛周围的组织，使眼睛从眼窝中突出。关闭眼睛下方的镊子，然后稳定向上拉动以取下。
   2. 将眼睛转移到装有 750-1000 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 1.5 mL 微量离心管中。
3. 对于解剖，将眼睛转移到装有新鲜 1x PBS 的解剖托盘中的孔中。
4. 在解剖显微镜下，使用直镊子夹住视神经的基部，并用锋利的显微解剖剪刀将神经切开，尽可能靠近眼睛。
5. 小心地将细直镊子插入连接视神经的开口中，并捏住以将组织固定到位。
6. 将显微解剖剪刀的尖端插入同一开口，并小心地从眼睛的后极向角膜巩膜交界处剪下。请勿将仪器插入太深，以免损坏镜头。
   注意：啮齿动物晶状体在眼睛中占据很大的体积，因此建议浅切以防止刺穿晶状体。
7. 使用显微解剖剪刀沿角膜-巩膜交界处切割，将至少一半的眼睛周长分开。
8. 使用直镊子轻轻倒置眼组织，同时推动角膜，通过角膜巩膜切口挤出晶状体。
9. 使用细直镊子小心地从晶状体上去除任何大的附着组织。
10. 如果需要，使用弯曲的镊子在干净、精致的工作擦拭器上轻轻滚动镜片，以去除任何残留的粘附晶状体外组织。
    注意：将纸巾快速滚动到任务擦拭布上，不要让纸巾过度干燥。由于晶状体囊上的干点，晶状体表面可能会有小的混浊。当将镜头放回 1x PBS 时，这些混浊通常是可逆的，并且不会影响后续步骤。
11. 将清洁后的镜片转移到装有 1x PBS 的 6 厘米培养皿中。
12. 使用细直镊子，浅浅刺穿赤道附近的晶状体囊，然后轻轻地将晶状体囊从纤维块上剥离。晶状体上皮细胞将保持附着在胶囊上。轻轻地从胶囊中取出任何可能因解封而脱落的大纤维碎片。
13. 用细直镊子轻轻夹住胶囊，并在 1x PBS 中旋转以去除任何残留的纤维。任何松散附着的纤维细胞都会与胶囊细胞和上皮细胞解离。

3. RNA分离

注意：RNA分离的总结工作流程如 图2所示。

1. 将 2 个透镜胶囊或 2 个纤维散块沉积到含有 400 μL 冷 TRIzol 试剂的相应 1.5 mL 微量离心管中。
   注意：应使用弯曲的镊子将纤维团块从培养皿移动到管中以舀起组织。
2. 盖紧管子并将管子移至化学通风橱中以进行后续步骤。
3. 使用干净的颗粒杵轻轻均质透镜纤维块。
   注意：确保完全分解纤维块。
4. 将样品（透镜胶囊或均质纤维块）在通风橱室温下在TRIzol中孵育30分钟。
5. 在通风橱中，每 400 μL TRIzol 试剂向每个试管中加入 200 μL 氯仿。紧紧关闭管子并用手剧烈摇晃 15 秒，将拇指放在管子底部，食指放在盖子上。
   注意：由于密封紧密，因此使用材料列表中注明的 1.5 mL 微量离心管。如果使用其他品牌的微量离心管，请在摇晃前测试管盖和密封，因为 TRIzol 和氯仿溶液可能会从密封不严密的管盖下方泄漏。
6. 将样品在室温下孵育 10-15 分钟，以进行相分离。
   注意：管底部应有含有脂质和蛋白质的粉红色TRIzol试剂层，含有DNA的相之间应有白色层，顶部应有含有RNA的透明水相。在上皮细胞样本中，白色 DNA 层可能更难看到。
7. 在4°C下以14,000 x g 离心样品15分钟。
   注意：小心地将试管移入和移出离心机，注意不要干扰转移阶段。
8. 从 RNA Clean and Concentrator 试剂盒组装试管和试剂。旋转柱管安装到试剂盒中的收集管中。
9. 在通风橱中，小心地将透明水相（顶层）转移到干净的 1.5 mL 微量离心管中，注意体积。
   注意：避免干扰、触摸或绘制水相下方的白色 DNA 层。转移水相时倾斜管子，以免干扰白层。最好在管中留下少量水相，而不是污染样品。通常，对于 200 μL 添加的氯仿，可以回收 180-190 μL 水相。
10. 以 1：1 的体积比向水相中加入 200 度乙醇。
    注意：在加入乙醇之前，可以将浓缩器试剂盒中的 RNA 结合缓冲液以 2：1 的体积比添加到水相中。跳过此步骤以提高 RNA 产量，并且因为 RNA 在分离后具有足够的纯度。
11. 通过倒置试管数次或上下移液溶液来轻轻混合。使用移液器将混合溶液转移到 RNA 离心柱中。
    注意： 小心不要用移液器吸头接触过滤器。
12. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心柱 30 秒。
    注意：建议在色谱柱的盖子和收集管的侧面贴上标签，以保持管组井井有条，以防盖子在随后的离心步骤中破裂。
13. 丢弃流通液，向离心柱中加入 400 μL RNA 制备缓冲液。
14. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心柱 30 秒。
15. 丢弃流通并向离心柱中加入 700 μL RNA 洗涤缓冲液。
16. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心柱 30 秒。
17. 丢弃流通并向离心柱中加入 400 μL RNA 洗涤缓冲液。
18. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心柱 1 分钟。
19. 丢弃流通物，在 4°C 下再次以 16,000 x g 离心 30 秒，以确保离心柱干燥。
20. 将离心柱移至新的标记的 1.5 mL 微量离心管中。
21. 将 15 μL 不含 RNase 的水加入膜过滤器上。在室温下孵育2分钟。
    注意： 小心不要用移液器吸头接触过滤器。
22. 在4°C下以16,000 x g 离心柱30秒，以洗脱纯化的RNA。
    注意：1.5 mL微量离心管的盖子在离心过程中将保持打开状态。小心地放置离心柱和微量离心管，使打开的盖子靠在转子盖上，这样在离心过程中就不会摆动和断裂。盖子应跟随转子旋转的方向。
23. 移除并丢弃旋转柱。RNA 将存在于 1.5 mL 微量离心管中收集的液体中。
24. 紧紧关闭 1.5 mL 微量离心管，将 RNA 样品在 55-65 °C 下孵育 10 分钟以促进再溶解。
25. 加热步骤后立即将样品放在冰上。
26. 将样品储存在-80°C或逆转录成cDNA以长期储存。
    注意：RNA样品储存长达3个月，没有明显的浓度损失。将 RNA 样品等分到较小的体积进行储存，以最大限度地减少冻融循环并防止降解。

4. 使用紫外-可见分光光度计测量RNA浓度

1. 将 RNA 样品放在冰上，打开 NanoDrop（紫外-可见分光光度计）电源，然后让仪器初始化。
2. 在“ 核酸 ”菜单下，选择 “RNA 定量”模块。
3. 通过将 RNA 浓度台阶中的 2.0 μL 洗脱液移液到基座（在本例中为分子级水）上，使紫外-可见分光光度计空白。降低仪器臂并读取空白样品。
4. 提起仪器臂，使用干净、干燥的精致任务湿巾清洁传感器底座，然后用去离子水润湿另一次擦拭，然后再次干擦。
5. 如果需要，请在紫外-可见分光光度计界面中输入样品详细信息。
6. 将 2.0 μL RNA 样品加载到基座上，放下手臂并定量。
7. 重复步骤 4.4 至 4.6 以清洁样品之间的基座。
8. 完成后，保存并导出实验，以便在必要时进行进一步定量。

5. 逆转录

1. 使用高度合成和耐热的逆转录酶，使用制造商推荐的方案逆转录 2.0 μg 晶状体纤维 RNA 和所有提取的上皮 RNA。在干净的 PCR 管中混合每个样品的试剂和 RNA。将所有溶液和 RNA 样品放在冰上。
   注意：该转录酶每次反应可逆转录多达 2.5 μg RNA。假设从 RNA 到 cDNA 的完全转化，因此将 RNA 起始浓度用作假定的 cDNA 浓度。
2. 使用表 1 中列出的条件在热循环仪中运行反应。
3. 将逆转录的 cDNA 储存在 -80 °C 或继续进行 qPCR 步骤。
   注意：cDNA 样品可储存长达 4 个月，没有明显降解，因为 cDNA 比 RNA 更稳定。只要尽量减少冻融循环，样品可能会储存更长时间。

表1：逆转录的热循环仪条件。 这些条件与特定的、高度合成的和热稳定的逆转录酶相协调。运行条件可能因所使用的酶和试剂盒而异。

6. 定量实时荧光定量PCR

1. 在开始反应之前，通过用分子级水稀释将 cDNA 储备溶液制备至所需浓度。在这些实验中，将以 5 ng/μL 的 1 μL cDNA 用于 5 ng/孔反应。将所有溶液和 cDNA 样品放在冰上。
   注意：建议使用 TaqMan 阵列板（0.1 mL 规格）以适应每孔 5-50 ng cDNA 的反应。制作 cDNA 的等分试样有助于限制冻融循环。在这项研究中，样品最多被限制为 5 个冻融循环。
2. 根据商业建议制备由高级预混液和探针组成的工作预混液。有关示例准备，请参阅第 7 节。将所有溶液和 cDNA 样品放在冰上。
   注意：每孔通常使用一对具有两种不同染料的探针。例如，在本研究中，Crygs-FAM-MGB作为目标基因探针，Ppia-VIC-MGB作为内部对照。 最终探针和引物浓度的商业建议分别为 250 nM 和 900 nM。如果靶标表达非常高，则可能需要引物限制探针来防止反应试剂耗尽。
3. 将 cDNA 储备液 （1 μL） 加载到 qPCR 板上的适当孔中，然后加载工作预混液 （9 μL）。在添加预混液的同时缓慢上下移液来混合溶液。确保将 cDNA 滴混合到溶液中并避免气泡。
   注意：根据目标的灵敏度，板可能需要装载在冰上。
4. 小心地盖上光学粘合剂盖，密封 qPCR 板。使用胶膜涂抹器平滑盖子并确保每个孔周围紧密密封。
5. 涡旋板以 1000 RPM 搅拌 10 秒。
6. 在室温下以 1000 x g 离心板 2 分钟，以确保孔底部没有气泡。
7. 将板加载到定量PCR热循环仪中，并使用 表2中列出的循环运行。
   注意：传统的qPCR方案通常限制为40个周期。增加循环计数不太可能产生有意义的结果，因为到 40 个循环时，单个目标拷贝理论上可以产生大约 1 万亿个扩增子¹⁹。

表2：定量聚合酶链反应的热循环仪条件。 这些条件与一系列特定的商业基因表达测定相适应。使用默认参数，但放大周期从 40 增加到 45 除外。

7. qPCR 体积计算示例

注意： 补充文件 1 中提供了下面描述的方程的体积计算器的 R 源代码。该计算器适用于 材料表中列出的 Taqman 探针和预混液。

1. 确定要移液的孔数并计算至少 12.5% 的超额。这个过量常数 （k_Excess） 补偿移液误差并确保有足够的溶液。对于本例，将使用 96 孔作为样品制备的目标。
   方程：
   
   例：
   
   注意：如果 12.5% 的超额不是整数，则确保后续步骤中“好”数字的简单方法是四舍五入到最接近的井并相应地调整 k_超额 。
2. 计算工作预混液体积。在这些实验中，每孔使用 1 μL cDNA 和 9 μL 工作预混液。cDNA 和预混液体积可根据需要进行调整。
   方程：
   
   例：
   
3. 计算浓度调节剂 （k_Conc）。该改性剂用于创建更浓缩的工作预混液，当与 cDNA 混合时，该预混液将稀释至 1 倍。
   方程：
   
   例：
   
4. 计算探头 （20x） 体积。
   方程：
   
   例：
   
5. 计算预混液 （2x） 体积。
   方程：
   
   例：
   
6. 使用分子级H₂O使工作预混液达到计算的体积。
   方程：
   
   
   
   
   
   例：
   
   
   
   
   

补充文件 1：体积计算器的 R 源代码。请点击此处下载此文件。

从6至7周龄的野生型小鼠中分离出晶状体上皮和纤维。这些实验使用三只小鼠，并将每只小鼠的 2 个晶状体囊或 2 个纤维细胞团汇集在一起进行一次生物复制。如方案所述，使用TRIzol试剂相分离提取RNA。平均而言，一对晶状体上皮和纤维块分别产生 0.8 μg （SD ± 0.2） 和 9.7 μg （SD ± 2.3） 的 RNA。上皮和纤维样品在15 μL洗脱液中的平均浓度分别为55.4 ng/μL（SD ± 16.3）和650.0 ng/μL（SD ± 152.2）。使用5ng /孔反应，理论上允许使用该协议分离的一对晶状体上皮平均进行160次反应。通过 A260/280 比率测量的平均 RNA 纯度为上皮 1.92 （SD ± 0.05），纤维为 2.05 （SD ± 0.01），表明蛋白质污染最小。通常，对于 RNA20，~2.0 的 A260/280 比率被认为是纯的。总体而言，这种分离产生了足够浓度的高纯度 RNA，以逆转录为 cDNA 并进行重复的 qPCR 实验。

我们按照方案中的描述进行了逆转录和qPCR。我们选择晶状体中已知转录本或蛋白质高表达的7个基因进行实时qPCR分析，以揭示组织区室21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32之间的差异表达。相对表达显示为 2-ΔΔCq 值，归一化为上皮细胞（图 3）。平均相对表达式显示为具有标准差的几何均值。由于已知的差异表达，连接蛋白用于确定上皮细胞和纤维细胞的成功分离。连接蛋白 43 （Cx43;间隙连接蛋白 α 1;Gja1）在晶状体上皮细胞33 中表达，Cx46 （Gja3） 在晶状体纤维细胞34 中表达，Cx50 （Gja8） 在上皮细胞和纤维细胞25,29 中表达。观察到晶状体纤维表达 Gja1 和 Gja8 的水平分别比晶状体上皮低约 200 倍和 7.5 倍。同时，Gja3 在晶状体纤维中的表达量高出约 1.5 倍，与之前的报告一致28。

同样，钙粘蛋白也存在差异表达，即E-钙粘蛋白（Cdh1）和N-钙粘蛋白（Cdh2）。E-钙粘蛋白表达仅限于晶状体上皮，而N-钙粘蛋白在上皮和纤维中均表达35。在这里，我们表明与上皮相比， 纤维中 Cdh1 和 Cdh2 的表达分别低约 330 倍和 2.4 倍。

还使用两个额外的上皮细胞和纤维细胞标记物，分别配对盒6（Pax6）和γS-晶状体蛋白（Crygs）来证明晶状体隔室的成功分离36,37。与先前观察到的表达模式一致，Pax6 仅限于上皮细胞，在纤维中的表达量降低 8 倍。γ-晶状体蛋白主要在晶状体纤维细胞中表达，我们观察到纤维中的 Crygs 比上皮细胞高约 3 倍 1。这些数据表明晶状体上皮和纤维质量的干净分离，允许对每个组织区室进行转录组学分析以进行比较。

图 2：分步 RNA 分离工作流程图。 （A） 相分离：步骤 3.1-3.11。这些步骤描述了通过酸-胍-苯酚相分离均质化原代组织、提取 RNA 和分离 RNA 的过程。（B）RNA浓度：步骤3.12-3.19。这些步骤描述了使用清洁浓缩柱洗涤和浓缩分离的 RNA 的过程。（C）洗脱：步骤3.20-3.26。这些步骤描述了使用不含 RNase 的水和加热从清洁浓缩器柱中洗脱 RNA 以促进溶解。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：比较分离的晶状体 上皮细胞与纤维细胞体积的 相对基因表达。RNA 水平标准化至上皮区室。与纤维细胞相比，上皮细胞标志物 Gja1 [编码连接蛋白 43 （Cx43）]、 Chd1 （编码 E-钙粘蛋白）和 Pax6 （编码转录因子 Pax6）在上皮细胞中的表达升高。纤维细胞标志物 Gja3 （编码 Cx46）和 Crigs （编码 γS-晶状体蛋白）与上皮细胞相比表达升高。在上皮细胞和纤维细胞中表达的标记物 Gja8 （编码 Cx50）和 Chd2 （编码 N-钙粘蛋白）在两个区室中显示可检测到的信号。图显示了使用 2-ΔΔCq 方法的标准差几何均值。使用双向方差分析确定统计显着性，然后使用 Šidák 多重比较检验确定。* p ≤ 0.05;** 页≤ 0.01; 页≤ 0.001; 页≤ 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。