本研究提出了一种评估食管鳞状细胞癌（ESCC）中PAK5功能的方法，表明PAK5的过表达可预测不良预后，并通过PAK5-GAREM1信号轴促进肿瘤进展。
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本研究提出了一种评估食管鳞状细胞癌（ESCC）中PAK5功能的方法，表明PAK5的过表达可预测不良预后，并通过PAK5-GAREM1信号轴促进肿瘤进展。
食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尤其在亚洲地区更为突出。由于缺乏早期症状，大多数患者在确诊时已处于晚期，导致治疗效果受限，预后较差。深入理解 ESCC 的发病机制，并鉴定其生物标志物或治疗靶点，对于改善患者预后至关重要。P21 激活蛋白激酶 5（PAK5）属于丝裂原活化蛋白激酶家族成员，已被发现通过调控细胞周期、迁移和侵袭在多种恶性肿瘤中发挥作用。然而，其在 ESCC 中的作用尚不明确。本研究采用免疫组织化学方法检测了 ESCC 组织及配对正常组织中 PAK5 的表达水平，并通过 Kaplan-Meier 生存分析评估 PAK5 与患者预后的关系。构建了 PAK5 过表达和敲低的 ESCC 细胞模型，开展了一系列功能实验，包括 CCK-8、克隆形成和 Transwell 实验。此外，通过 mRNA 测序分析，鉴定 PAK5 调控的下游靶基因及信号通路。结果显示，与正常组织相比，ESCC 组织中 PAK5 表达显著升高，且与不良预后相关。功能实验表明，PAK5 可促进 ESCC 细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，而转录组学分析揭示 GAREM1 是其关键的下游效应分子。上述结果表明，PAK5 参与了 ESCC 的进展过程，可能作为潜在的预后生物标志物和治疗靶点。
在全球范围内，食管癌是致死率最高的恶性肿瘤之一。在中国，食管鳞状细胞癌（ESCC）是最主要的组织学亚型。尽管治疗手段已取得一定进展，但ESCC患者的预后仍然极差，5年生存率仅为10%至25%1。这主要归因于早期诊断困难以及有效的分子靶向治疗手段有限2。与其他靶向治疗已显示出显著前景的实体瘤不同，ESCC中的此类治疗仍处于起步阶段，受限于可操作的分子靶点稀缺。
PAK5 是一种 II 组 PAK，可整合细胞骨架动态与促存活信号通路，并已在多种恶性肿瘤中被发现与化疗耐药相关3,4,5,6,7,8,9,10,11。鉴于 MAPK 信号通路在食管鳞状细胞癌（ESCC）生物学行为及治疗反应中的重要作用1,2,12，本研究提出假设：PAK5 在 ESCC 中表达上调，并通过调控 MAPK 信号通路促进恶性表型，此过程可能涉及适配蛋白/调节因子 GAREM1 的参与13,14,15,16。为验证该假设，研究采用了定量免疫组化、功能基因扰动及转录组学分析等方法。
食管鳞状细胞癌（ESCC）的治疗通常采用食管切除术、化疗和放疗相结合的方式。尽管食管切除术可能实现治愈，但其伴随较高的发病率风险4,8。此外，化疗和放疗常常无法彻底清除所有癌细胞，导致出现耐药性、复发和转移8,9。近年来，免疫治疗已成为肿瘤学领域的重要研究焦点，在治疗晚期癌症方面显示出一定疗效。这一趋势凸显了迫切需要发现新的生物标志物，以辅助ESCC的早期诊断和治疗方案制定。既往研究表明，其他PAK家族成员（如PAK1和PAK4）可促进ESCC中的细胞增殖、侵袭及治疗耐药性，突显了该激酶家族在ESCC生物学中的重要作用。然而，PAK5作为研究较少的II组PAK家族成员，其功能尚不明确，这促使了本研究的开展17,18。
P21活化激酶5（PAK5）是PAK II亚家族的成员，于2002年首次被鉴定为一种脑特异性激酶。PAK5定位于染色体20p12，编码一个分子量约为80 kDa的蛋白质，主要存在于线粒体和细胞核中，在细胞调控中发挥多种作用10,11,13。其在线粒体中的功能包括能量代谢及其调控，而在细胞核中的存在则与基因转录和细胞周期调控相关。尽管PAK5的研究尚不如其他同源蛋白深入，但普遍认为其在神经发育、细胞存活以及癌症进展中具有关键作用10。值得注意的是，PAK5已被证实参与细胞骨架调控、抗凋亡机制以及细胞增殖过程12。在肿瘤细胞中，PAK5的上调与新出现的药物耐药性相关，这与已有研究发现PAK5过表达可增强肿瘤细胞对化疗药物的耐受性相一致10,11,13,14。然而，PAK5在食管鳞状细胞癌（ESCC）进展中的确切功能仍不明确。本研究旨在探究PAK5对ESCC转录组环境的影响及其功能后果。通过转录组谱分析，识别与ESCC细胞中PAK5活性相关的基因表达变化。此外，构建了可调控PAK5表达的ESCC细胞模型，以阐明其在肿瘤生长和转移潜能中的作用。与传统主要依赖Western blot或单一模态转录检测的ESCC生物标志物发现策略不同，本研究流程整合了定量免疫组织化学、转录组谱分析和功能实验。这种联合方法可实现分子水平和表型水平的同步验证，既提供机制性见解，又提高生物学相关性。此外，该方案强调实验的可重复性，采用配对的肿瘤组织与邻近正常组织样本、标准化的免疫染色流程，以及高质量的RNA输入（RNA完整性数值≥7）进行测序。这些特点增强了实验的稳健性和在不同实验室间的适用性，尤其适用于旨在界定具有临床意义的激酶驱动型调控网络的ESCC研究。
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所有实验程序均经海南医科大学第二附属医院伦理委员会批准（批准号：LW2022602），并根据《赫尔辛基宣言》的要求获取每位参与者的知情同意。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 患者及组织样本采集
共纳入40例经病理确诊的食管鳞状细胞癌患者，所有患者术前肝肾功能均正常。手术切除后立即采集肿瘤组织（T组）和相邻的正常组织（N组；距肿瘤边缘≥2 cm）。组织在室温下用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液固定7天，随后进行石蜡包埋。
2. 免疫组织化学染色
将石蜡包埋的组织切成5 µm厚切片，并在60 °C下烘烤1小时。切片使用二甲苯替代物脱蜡，经梯度乙醇复水，随后在10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中于95–98 °C进行抗原修复20分钟。内源性过氧化物酶活性用3%过氧化氢孵育10分钟灭活，然后在室温下用5%正常血清封闭30分钟。切片在4 °C下与抗PAK5一抗（1:100稀释，参见材料表）孵育过夜（12–16小时）。PBS洗涤后，切片在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育30分钟，用DAB显色至出现颜色（1–5分钟，显微镜下监控以避免过度染色），随后用苏木精复染30–60秒。切片脱水、封片，并在明场显微镜下成像。使用图像分析软件对染色强度和阳性细胞比例进行定量，每张切片至少选取五个随机视野（200×放大倍数）。定量方法采用H评分计算，公式为：H-score = ∑（染色强度等级 × 阳性细胞百分比）（染色强度分为0 = 阴性，1 = 弱，2 = 中等，3 = 强；阳性细胞百分比分为0–25%，26–50%，51–75%，76–100%）。为确保结果可靠性，由两位独立的病理学家进行盲法评分，观察者间一致性κ值≥0.75。严格实施质量控制标准：阳性对照（已知PAK5阳性的食管鳞状细胞癌组织）和阴性对照（以PBS替代一抗）必须通过验证；背景染色强度必须低于预设阈值（例如H评分<50）；同一样本两次重复实验间的染色结果变异系数（CV）必须<20%，以排除实验变异性。
3. 细胞系与培养
KYSE-150（人食管鳞状细胞癌细胞）和 HEK-293（病毒包装用）细胞系均通过短串联重复序列（STR）分型进行鉴定，并确认无支原体污染。KYSE-150 细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的 RPMI-1640 培养基中培养。HEK-293 细胞则在含有相同添加剂的 DMEM 培养基中维持培养。当细胞融合度达到 70%–80% 时，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行传代，并在每次实验前 24 小时以适当密度接种。
4. 慢病毒载体构建与感染
慢病毒载体设计用于过表达PAK5（pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro）或沉默PAK5（pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro）。将HEK-293细胞接种于10 cm培养皿中，当细胞融合度达到70%-80%时，使用脂质体转染试剂共转染转移质粒、包装质粒（gag/pol和rev）以及包膜质粒（VSV-G），转染比例为4:3:1，每10 cm培养皿总DNA量约为20 µg。转染后6-8小时更换培养基。分别在转染后48小时和72小时收集病毒上清液，以500 × g离心10分钟以去除细胞碎片，经0.45 µm滤器过滤后，或浓缩或储存于−80 °C。进行转导时，KYSE-150细胞于感染前一天接种，并在含8 µg/mL polybrene的条件下，以感染复数（MOI）为5-10的病毒上清液进行感染。MOI定义为感染单位与靶细胞数量的比值。通过GFP计数或qPCR进行预实验以估算MOI，并选择MOI为5-10。感染12-16小时后更换培养基。通过将未转导的细胞暴露于0-4 µg/mL的嘌呤霉素中处理72-96小时，建立嘌呤霉素杀灭曲线，以确定最小致死浓度。用于筛选的浓度选定为1-2 µg/mL，维持浓度为0.5-1 µg/mL。从转导后48小时开始，使用嘌呤霉素（1-2 µg/mL）对细胞进行筛选。通过RT-qPCR使用PAK5特异性引物（上游引物5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′，下游引物5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′）和GAPDH引物（上游引物5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′）验证PAK5的过表达或沉默效果。PAK5的相对表达量采用2−ΔΔCt 法计算。所有实验均至少进行三次生物学重复。
5. CCK-8 细胞活力检测
使用基于细胞脱氢酶还原WST-8试剂原理的细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力。将对数生长期的KYSE-150细胞以每孔2,000个细胞接种于96孔板中，每孔加入100 µL完全培养基。在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h时，向每孔加入10 µL CCK-8试剂（含WST-8）。在37 °C孵育2 h后，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A450）。实验中设置仅含培养基的空白孔。每个实验组至少包含三个生物学重复，每次测定进行五个技术重复。
6. 克隆形成实验
将KYSE-150细胞以每孔1000个细胞的密度接种于6孔板中，培养14天，每2-3天更换一次培养基。用4%多聚甲醛固定集落15分钟，再用含20%甲醇的0.1%结晶紫染色15分钟，蒸馏水漂洗后空气干燥。使用图像分析软件计数包含超过50个细胞的集落，并计算集落形成率。
7. Transwell 侵袭实验
使用孔径为 8 µm 的插件，并预先包被基底膜基质（每插件 50 µL，1:8 稀释），于 37 °C 孵育 1 小时；在接种细胞前进行质量控制：设置空白插件（无细胞）和阴性对照插件（无趋化因子），以验证实验的有效性，并通过肉眼观察（或在更严格控制下采用称重法）确认基底膜基质层的均匀性。细胞在含 1% FBS 的培养基中饥饿处理 6–12 小时，以 2 × 10⁵ 个细胞/mL（每插件 200 µL）接种至插入式培养皿的上室。下室加入含 20% FBS 的培养基 600 µL 作为趋化因子。37 °C 孵育 24 小时后，用棉签擦去上表面未侵袭的细胞，下表面已侵袭的细胞用甲醇固定 10 分钟，并用 0.1% 结晶紫染色 15 分钟。染色后的细胞在明场显微镜下成像，每插件至少随机选取五个显微视野（200× 放大倍数）进行计数；计数采用盲法（计数人员不知晓分组信息），以避免主观偏差。
8. 细胞凋亡的流式细胞术检测
收集细胞（包括悬浮细胞），用PBS洗涤两次，然后重悬于结合缓冲液中，细胞浓度为1 × 106 个/mL。向100 µL细胞悬液中加入Annexin V-FITC（5 µL）和碘化丙啶（5 µL），避光、室温孵育15分钟；孵育结束后，每份样品中加入400 µL结合缓冲液。在进行流式细胞术分析前，使用单染对照样本（仅Annexin V-FITC染色的细胞和仅PI染色的细胞）进行补偿调节，以消除荧光溢出，并设置FSC/SSC门控以选择单个细胞（排除细胞碎片和细胞聚集体）。样品需在1小时内使用配备488 nm激光器的流式细胞仪进行分析，每份样本至少采集10,000个事件。采用流式细胞术分析软件对凋亡指数进行定量：所有样本均应用统一的门控阈值以确保一致性，并分别报告早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）和晚期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁺）的比例，以表征各组的细胞凋亡特征。
9. RNA测序与生物信息学分析
提取总RNA，并评估其纯度（A260/280比值在1.8至2.1之间）和完整性（RIN ≥7作为质量控制阈值）。使用oligo(dT)磁珠纯化mRNA，在94 °C下片段化5-7分钟，随后逆转录为cDNA。通过末端修复、接头连接和PCR扩增（8-12个循环）构建文库，并在Illumina测序平台上进行测序，生成每样本3000万至5000万对读段的双端150 bp序列。对原始读段进行修剪后，使用STAR或HISAT2将其比对至人类参考基因组。采用featureCounts获取基因计数，使用DESeq2进行差异表达分析，设定筛选阈值为FDR < 0.05且|log2倍数变化| ≥ 1。对差异表达基因进行功能富集分析，使用clusterProfiler工具分析基因本体（Gene Ontology）和KEGG通路（采用Benjamini-Hochberg（BH）法校正的FDR < 0.05），并利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。
10. 统计分析
连续数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准差表示。两组之间的比较采用双尾非配对 t检验，三组或更多组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验。在适用情况下使用非参数检验。生存分布通过Kaplan-Meier分析结合对数秩检验进行评估。对于RNA-seq数据，采用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。确切的p值在图注中列出；统计学显著性定义为p < 0.05，其中*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。
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PAK5 在食管鳞状细胞癌中高表达，且与不良预后相关
图1 展示了从PAK5的临床验证到功能及转录组学分析的整体工作流程，该流程鉴定出GAREM1是其下游靶点。为验证PAK5通过调控MAPK通路促进食管鳞状细胞癌（ESCC）进展的假设 通过 GAREM1，检测了PAK5在食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中的表达模式及其与临床预后的关联。首先，利用来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的基因表达数据集GSE269447，筛选食管鳞状细胞癌组织与正常组织之间显著差异表达的基因（DEGs）19随后，生成了热图和火山图（图2A，B）。通过热图直观展示表达差异最大的前 25 个基因（图2A）。在此热图中，蓝色表示显著下调，红色表示显著上调。火山图（...
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本研究通过结合临床样本、功能实验和转录组学分析，深入探讨了PAK5在食管鳞状细胞癌（ESCC）进展中的作用。这些发现拓宽了对PAK5在ESCC中作用机制的认识，凸显了其作为预后标志物和治疗靶点的潜力。
食管鳞状细胞癌组织中PAK5的显著过表达及其与患者较差生存率的相关性，与其他癌症中的研究结果一致，即PAK5与肿瘤进展和不良预后相关。10,11通过鉴定PAK5作为食管鳞状细胞癌（ESCC）进展的调控因子，本研究增进了对激酶介导的肿瘤发生机制的广泛理解，并为食管癌中MAPK通路的调控提供了新的见解。值得注意的是，PAK5并非唯一参与ESCC发病机制的PAK家族成员——先前的研究已揭示其他PAK亚型在该疾病中的促癌作用。例如，作为I组PAK家族成员的PAK1在ESCC组织中显著上调，其高表达与肿瘤进展期及淋巴结转移相关；在机制上，PAK1通过激活ERK/MAPK信号通路促进ESCC细胞增殖和侵袭，该信号通路与本研究中涉及PAK5的信号级联存在重叠。
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作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
本工作得到了中国海南省自然科学基金（项目编号：822QN474）的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1062S | 凋亡检测染色试剂盒 |
| 抗 PAK5 抗体 | Abcam | ab110069 | 免疫组化一抗，稀释比例 1:100 |
| 自动化电泳系统 | Agilent | 2100 Bioanalyzer | RNA 完整性评估 |
| cDNA 合成试剂盒 | Invitrogen | 1896649 | 逆转录试剂盒 |
| 结晶紫溶液 | Sigma-Aldrich | C3886 | 克隆和侵袭实验染色剂 |
| DMEM 培养基 | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | 细胞培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | 细胞培养添加剂 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCanto II | 细胞分析仪器 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本 8 | 统计分析与绘图软件 |
| H&E 染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | 苏木精-伊红染色液 |
| HRP 标记的抗大鼠 IgG 抗体 | Abcam | ab150165 | 免疫组化二抗 |
| Illumina NovaSeq 测序仪 | Illumina | NovaSeq 6000 | 高通量测序平台 |
| KYSE-150 细胞系 | RIKEN 细胞库 | RCB2057 | 人食管鳞状细胞癌细胞系 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000008 | 转染试剂 |
| 酶标仪 | Bio-Tek Instruments | ELx808 | 吸光度测定仪器 |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | 用于 mRNA 纯化 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | 细胞培养用抗生素 |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4864 | DNA 染色剂 |
| RPMI-1640 培养基 | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | 细胞培养基 |
| 分光光度计 | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | RNA 浓度与纯度测定 |
| SPSS 软件 | IBM | 版本 23 | 统计分析软件 |
| Transwell 小室 | Corning | 3422 | 细胞侵袭实验用小室 |
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