本研究提出了一种评估食管鳞状细胞癌（ESCC）中PAK5功能的方法，表明PAK5的过表达可预测不良预后，并通过PAK5-GAREM1信号轴促进肿瘤进展。
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本研究提出了一种评估食管鳞状细胞癌（ESCC）中PAK5功能的方法，表明PAK5的过表达可预测不良预后，并通过PAK5-GAREM1信号轴促进肿瘤进展。
食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尤其在亚洲地区更为突出。由于缺乏早期症状，大多数患者在确诊时已处于晚期，导致治疗效果受限，预后较差。深入理解 ESCC 的发病机制，并鉴定其生物标志物或治疗靶点，对于改善患者预后至关重要。P21 激活蛋白激酶 5（PAK5）属于丝裂原活化蛋白激酶家族成员，已被发现通过调控细胞周期、迁移和侵袭在多种恶性肿瘤中发挥作用。然而，其在 ESCC 中的作用尚不明确。本研究采用免疫组织化学方法检测了 ESCC 组织及配对正常组织中 PAK5 的表达水平，并通过 Kaplan-Meier 生存分析评估 PAK5 与患者预后的关系。构建了 PAK5 过表达和敲低的 ESCC 细胞模型，开展了一系列功能实验，包括 CCK-8、克隆形成和 Transwell 实验。此外，通过 mRNA 测序分析，鉴定 PAK5 调控的下游靶基因及信号通路。结果显示，与正常组织相比，ESCC 组织中 PAK5 表达显著升高，且与不良预后相关。功能实验表明，PAK5 可促进 ESCC 细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，而转录组学分析揭示 GAREM1 是其关键的下游效应分子。上述结果表明，PAK5 参与了 ESCC 的进展过程，可能作为潜在的预后生物标志物和治疗靶点。
在全球范围内，食管癌是致死率最高的恶性肿瘤之一。在中国，食管鳞状细胞癌（ESCC）是最主要的组织学亚型。尽管治疗手段已取得一定进展，但ESCC患者的预后仍然极差，5年生存率仅为10%至25%1。这主要归因于早期诊断困难以及有效的分子靶向治疗手段有限2。与其他靶向治疗已显示出显著前景的实体瘤不同，ESCC中的此类治疗仍处于起步阶段，受限于可操作的分子靶点稀缺。
PAK5 是一种 II 组 PAK，可整合细胞骨架动态与促存活信号通路，并已在多种恶性肿瘤中被发现与化疗耐药相关3,4,5,6,7,8,9,10,11。鉴于 MAPK 信号通路在食管鳞状细胞癌（ESCC）生物学行为及治疗反应中的重....
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所有实验程序均经海南医科大学第二附属医院伦理委员会批准（批准号：LW2022602），并根据《赫尔辛基宣言》的要求获取每位参与者的知情同意。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 患者及组织样本采集
共纳入40例经病理确诊的食管鳞状细胞癌患者，所有患者术前肝肾功能均正常。手术切除后立即采集肿瘤组织（T组）和相邻的正常组织（N组；距肿瘤边缘≥2 cm）。组织在室温下用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液固定7天，随后进行石蜡包埋。
2. 免疫组织化学染色
将石蜡包埋的组织切成5 µm厚切片，并在60 °C下烘烤1小时。切片使用二甲苯替代物脱蜡，经梯度乙醇复水，随后在10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中于95–98 °C进行抗原修复20分钟。内源性过氧化物酶活性用3%过氧化氢孵育10分钟灭活，然后在室温下用5%正常血清封闭30分钟。切片在4 °C下与抗PAK5一抗（1:100稀释，参见材料表）孵育过夜（12–16小时）。PBS洗涤后，切片在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育30分钟，用DAB显色至出现颜色（1–5分钟，显微镜下监控以避免过度染色），随后用苏木精复染30–60....
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PAK5 在食管鳞状细胞癌中高表达，且与不良预后相关
图1 展示了从PAK5的临床验证到功能及转录组学分析的整体工作流程，该流程鉴定出GAREM1是其下游靶点。为验证PAK5通过调控MAPK通路促进食管鳞状细胞癌（ESCC）进展的假设 通过 GAREM1，检测了PAK5在食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中的表达模式及其与临床预后的关联。首先，利用来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的基因表达数据集GSE269447，筛选食管鳞状细胞癌组织与正常组织之间显著差异表达的基因（DEGs）19随后，生成了热图和火山图（图2A，B）。通过热图直观展示表达差异最大的前 25 个基因（图2A）。在此热图中，蓝色表示显著下调，红色表示显著上调。火山图（.......
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本研究通过结合临床样本、功能实验和转录组学分析，深入探讨了PAK5在食管鳞状细胞癌（ESCC）进展中的作用。这些发现拓宽了对PAK5在ESCC中作用机制的认识，凸显了其作为预后标志物和治疗靶点的潜力。
食管鳞状细胞癌组织中PAK5的显著过表达及其与患者较差生存率的相关性，与其他癌症中的研究结果一致，即PAK5与肿瘤进展和不良预后相关。10,11通过鉴定PAK5作为食管鳞状细胞癌（ESCC）进展的调控因子，本研究增进了对激酶介导的肿瘤发生机制的广泛理解，并为食管癌中MAPK通路的调控提供了新的见解。值得注意的是，PAK5并非唯一参与ESCC发病机制的PAK家族成员——先前的研究已揭示其他PAK亚型在该疾病中的促癌作用。例如，作为I组PAK家族成员的PAK1在ESCC组织中显著上调，其高表达与肿瘤进展期及淋巴结转移相关；在机制上，PAK1通过激活ERK/MAPK信号通路促进ESCC细胞增殖和侵袭，该信号通路与本研究中涉及PAK5的信号级联存在重叠。
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作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
本工作得到了中国海南省自然科学基金（项目编号：822QN474）的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1062S | 凋亡检测染色试剂盒 |
| 抗 PAK5 抗体 | Abcam | ab110069 | 免疫组化一抗，稀释比例 1:100 |
| 自动化电泳系统 | Agilent | 2100 Bioanalyzer | RNA 完整性评估 |
| cDNA 合成试剂盒 | Invitrogen | 1896649 | 逆转录试剂盒 |
| 结晶紫溶液 | Sigma-Aldrich | C3886 | 克隆和侵袭实验染色剂 |
| DMEM 培养基 | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | 细胞培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | 细胞培养添加剂 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCanto II | 细胞分析仪器 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本 8 | 统计分析与绘图软件 |
| H&E 染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | 苏木精-伊红染色液 |
| HRP 标记的抗大鼠 IgG 抗体 | Abcam | ab150165 | 免疫组化二抗 |
| Illumina NovaSeq 测序仪 | Illumina | NovaSeq 6000 | 高通量测序平台 |
| KYSE-150 细胞系 | RIKEN 细胞库 | RCB2057 | 人食管鳞状细胞癌细胞系 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000008 | 转染试剂 |
| 酶标仪 | Bio-Tek Instruments | ELx808 | 吸光度测定仪器 |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | 用于 mRNA 纯化 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | 细胞培养用抗生素 |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4864 | DNA 染色剂 |
| RPMI-1640 培养基 | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | 细胞培养基 |
| 分光光度计 | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | RNA 浓度与纯度测定 |
| SPSS 软件 | IBM | 版本 23 | 统计分析软件 |
| Transwell 小室 | Corning | 3422 | 细胞侵袭实验用小室 |
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