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方法文章

通过Langendorff灌注与重力沉降法分离与纯化成年小鼠心肌细胞

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DOI：

10.3791/69102

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2026年3月31日

 ,  , 
1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

本文内容

摘要

本研究旨在优化和简化成年小鼠心肌细胞的分离流程，最终目标是改进心血管疾病领域的研究方法。该方案能够在较短的处理时间内高效地获得高活力和高纯度的心肌细胞，从而实现更可靠的实验，并加速治疗进展。

摘要

心血管疾病仍然是全球主要的健康挑战，迫切需要可靠的体外模型。本研究提出了一种优化的成年小鼠心肌细胞分离与培养方案，以解决现有方法中心肌细胞存活率低和非心肌细胞污染的问题。该方案基于逆行Langendorff灌注法，采用肝素钠抗凝，并单独使用II型胶原酶（1.2 mg/mL）进行消化。心肌细胞通过重力沉降法纯化，并在层粘连蛋白包被的表面进行培养。该方法稳定获得8.75 ± 0.36 × 105 每颗心脏可获得大量心肌细胞，其中杆状细胞占比较高（91.2% ± 2.11%），纯度较高（cTNT⁺DAPI⁺细胞占DAPI⁺细胞的比例约为97.47% ± 1.365%），且具有清晰的肌节结构。该方案通过提供一种标准化且可重复的方法来获取高质量的成年心肌细胞，有效弥合了 体外 研究及其病理生理学意义，从而支持先进的心血管研究。

引言

心血管疾病仍然是全球死亡的首要原因1心肌细胞作为心脏研究的核心焦点，长期以来一直是研究心脏生理学和病理学的重要工具2尽管市面上可获得的心肌细胞系以及近年来广受关注的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）在可及性和操作便利性方面具有明显优势3,4,5原代心肌细胞分离 离体 在心脏生理与病理机制方面表现出更优的结构与功能相关性。因此，掌握相关技术对于 体外 心肌细胞分离至关重要。

心肌细胞在发育过程中表现出明显的形态和功能转变。值得注意的是，这些细胞在胚胎发育期和新生期（出生后7天内）保持增殖能力，但此后这种再生能力将永久丧失6。随着出生后的成熟过程，心肌细胞经历显著的形态重塑，最终在2月龄时获得典型的成年表型——呈现杆状形态，并具有高度有序的肌节结构7,8。这些依赖于发育阶段的特征凸显了在心脏病理生理机制研究中使用成年小鼠心肌细胞的重要性。

推动该领域发展的关键在于可靠地获取高保真的心肌细胞，特别是能够准确模拟人类心脏生理功能的成年来源细胞。目前成年小鼠心肌细胞的分离方案面临若干持续存在的挑战：（i）细胞活力受损，（ii）细胞群体异质性高，以及（iii）技术操作复杂——这些因素共同阻碍了研究进展9,10。这凸显出迫切需要优化细胞分离方法，以提高细胞得率和纯度，从而为心血管疾病研究提供更具生理相关性的细胞平台。

通过系统优化灌注参数、酶消化方案和试剂配方，本研究成功建立了一种改进的成年小鼠心肌细胞分离与培养方法。优化后的方案所获得的心肌细胞具有良好的形态完整性，表现为高比例的杆状细胞和清晰可见的肌节结构。这些改进为深入研究心肌细胞的病理生理学提供了可靠的实验平台，显著推动了以心肌细胞机制为核心的 cardiovascular disease 研究。

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方案

本研究中的所有动物实验均严格遵循德清县人民医院伦理委员会批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南进行。实验所用动物为购自集萃药康有限公司的8至12周龄雄性C57BL/6小鼠。所有动物均饲养在符合国家标准的SPF级屏障环境中，环境参数符合国家规定（室温22 ± 2 °C，相对湿度50 ± 10%，12小时光照/12小时黑暗循环）。在整个实验过程中，本研究严格遵守"3R"原则（替代、减少、优化），并实施了包括麻醉和镇痛在内的标准操作程序，以最大程度减轻动物痛苦。

注意：简而言之，完整的心脏从小鼠胸腔中迅速取出后，通过兰格多夫装置以II型胶原酶溶液进行逆行灌注，从而酶解消化细胞外基质。组织完全消化后，软化的心肌被小心地分离成单细胞悬液。所得细胞悬液依次过滤以去除未消化的组织碎片，随后通过重力沉降富集有活力的心肌细胞。纯化后的心肌细胞可用于后续实验应用。

1. 兰根多夫灌注装置的准备

注意：朗根多夫系统的总管路容积为15.5 mL。心脏灌注的灌注流速为3.5 mL/min，系统冲洗时为10–15 mL/min。

  1. 用 50 mL 75% 乙醇冲洗 Langendorff 灌流系统。
    注意：每月使用 1 M HCl 清洗玻璃管路以确保无菌。
  2. 用 250 mL 无菌 ddH2O 冲洗，以去除乙醇残留并排除气泡。
  3. 将水浴温度设置为 42 °C，开启泵以启动循环加热，并用温水填充蛇形管的外部腔室。
    注意：这可确保灌流液到达心脏时温度为 37 °C。

2. 缓冲液的配制

  1. 根据表1中列出的配方配制Krebs-碳酸氢盐溶液缓冲液（KB）、灌注缓冲液（PB）、消化缓冲液（DB）、心肌细胞接种培养基（MPM）和心肌细胞培养基（MCM）。
    注意：请在使用当天新鲜配制。
  2. 将10 mL KB缓冲液预冷于冰上。
  3. 用PB填充管腔，设置流速为3.5 mL/min，并测量流出液温度（最佳温度为37 °C）。
  4. 向管道中冲洗7 mL DB，然后关闭灌注管路。
  5. 配制肝素钠溶液（0.5%，62.5 KU），并将300 µL装入胰岛素注射器中。
  6. 分别将10 mL PB和10 mL KB分装至两个独立的培养皿中，并置于冰上预冷。
  7. 将一个100 µm细胞筛网放置在50 mL离心管盖上，用1 mL KB预润湿，然后固定在50 mL离心管上。

3. 心脏提取与插管

注意：本方案中，整个操作过程均使用无菌手套、器械、纱布和棉签，以尽量减少外部污染。虽然完整的无菌技术对于原代细胞培养至关重要，但此处采用无菌措施的目的是为了保障动物福利以及组织完整性，以利于后续的组织学和分子分析，而非维持细胞分离所需的无菌状态。

  1. 通过腹腔注射80 mg/kg戊巴比妥钠（药用级）联合5 IU/g体重的肝素钠麻醉小鼠。密切监测直至达到深度麻醉状态。轻捏小鼠脚趾，观察脚趾夹捏反射消失以确认麻醉成功。
  2. 使用脱毛膏去除胸部毛发。
  3. 将小鼠固定在泡沫板上，并用75%酒精对胸部皮肤进行消毒。
  4. 用镊子提起胸部皮肤，在剑突处做一切口。
  5. 抬起剑突，沿双侧向腋窝方向剪开肋骨，随后完全横断膈肌。
    注意：避免损伤心脏。
  6. 使用止血钳固定胸骨和肋骨，充分暴露心脏。
  7. 吸除血液，并用组织轻轻将肝脏推向后肢方向。小心使用棉签操作心脏，以暴露下腔静脉。
  8. 使用预先准备的胰岛素注射器，向下腔静脉注入300 µL肝素钠溶液（来自步骤2.5）。
    注意：注意防止引入气泡。
  9. 切除胸腺组织，随后切断周围静脉和动脉。立即将心脏转移至预冷的PB缓冲液（来自步骤2.6）中。
    注意：去除胸腺有助于提高主动脉的可视性。在切除过程中保留一段主动脉。预冷的PB溶液可减缓心肌收缩。在麻醉状态下进行心脏切除可实现人道安乐死。
  10. 使用显微镊夹住主动脉，并将其套入Langendorff灌流系统的灌流管上，用5-0丝线固定。
    注意：此步骤应迅速完成。在安装心脏时确保灌流系统处于关闭状态。

4. 心脏灌注

  1. 启动灌注系统，并开始计时 2 分 30 秒。在此期间，流出液为 PB 缓冲液，无需收集。
  2. 当 2 分 30 秒计时期间结束后，开始收集并循环 DB 缓冲液，同时计时 15 分钟。
    注意：监测心肌状态——理想的消化表现为组织弹性降低和透明度增加。若消化不完全，可适当延长消化时间，但总时长不应超过 20 分钟，以避免心肌细胞损伤。
  3. 计时期间结束后，将灌注液由 DB 缓冲液切换为 PB 缓冲液，继续灌注 4 分 30 秒。此阶段的流出液含有 DB 缓冲液，需进行收集。
  4. 在最终计时期间结束后，关闭系统以终止灌注。

5. 细胞解离与纯化

  1. 将心脏从灌流管中取出，并转移至预冷的 KB 缓冲液中（按步骤 2.6 配制）。
    注意：通过立即将心脏转移至 KB 缓冲液中以终止酶消化。这可迅速稀释残留酶液，防止过度消化，确保细胞高存活率。
  2. 使用精细剪刀小心切除心房和主动脉组织，仅保留心肌组织。
  3. 使用显微镊子将心肌组织机械解离成小碎片（<1 mm3）。
  4. 用 2 mL 滴管轻轻吹打组织碎片，以获得单细胞悬液。
    注意：吹打过程中需格外小心，以保持杆状心肌细胞的形态。避免使用标准移液器吸头，因其狭窄的孔径可能机械性破坏细胞完整性。
  5. 将所得细胞悬液通过预先润湿的 100 µm 细胞筛（按步骤 2.7 组装）过滤至 50 mL 离心管中。
  6. 将过滤后的悬液转移至 15 mL 离心管中，通过重力沉降法使心肌细胞沉降（15 分钟，4 °C）。
    注意：与 50 mL 离心管相比，15 mL 离心管的底部表面积较小，可显著提高细胞回收效率。
  7. 小心吸除上清液，使用 2 mL 移液管将沉淀的心肌细胞重悬于 10 mL 冰冷的 KB 缓冲液中，并重复沉降步骤（15 分钟，4 °C）。
  8. 重复步骤 5.4–5.7，以获得适用于后续应用的纯净、完整杆状心肌细胞制备物。

6. 细胞培养

  1. 用 10 µg/mL 层粘连蛋白包被培养皿，在 37 °C 下孵育 2 小时。
    注意：为尽量减少对杆状心肌细胞的机械损伤，并降低与差速贴壁法相关的延长操作时间，本研究采用层粘连蛋白包被替代差速贴壁法。该策略不仅能提高细胞贴壁效率，还可保持心肌细胞的天然生理特性。
  2. 将心肌细胞重悬于 4 mL 预热（37 °C）的 MPM 中。去除层粘连蛋白溶液后，将心肌细胞接种至包被的培养皿中。在 37 °C、2% CO2 条件下孵育 1 小时。在显微镜下观察细胞形态、大小和密度。
  3. 孵育后，小心倾去 MPM，更换为预热（37 °C）的 MCM。继续在 37 °C、2% CO2 条件下培养 24 小时。
  4. 24 小时后，检查心肌细胞的结构完整性和形态。
    注意：整个操作过程中须严格保持无菌技术。
    警告：II 型胶原酶可能引起呼吸道过敏、皮肤和眼睛刺激。务必在通风良好的环境中操作，避免吸入粉尘或接触皮肤及黏膜。所有废弃的小鼠心脏组织、血液样本以及任何接触过这些材料的一次性耗材，均须作为生物危害废物收集于专用的防漏容器中，并标有生物危害标志。这些材料随后将接受集中去污和处理程序。

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结果

本方案展示了成年小鼠心肌细胞的分离与培养步骤，所需仪器及管路装置如图1所示。形态学评估显示， freshly分离的心肌细胞以及培养1小时和24小时后的细胞均呈现典型的杆状或纺锤形形态，横纹清晰可见（图2A–C）。培养24小时的心肌细胞经心肌肌钙蛋白T（cTNT）免疫荧光染色后，显示细胞纯度高（图2D），肌节结构清晰（图2D），表明该方法所获得的心肌细胞具有较高的纯度和活性。

随后，我们将该提取方法的心肌细胞产量与先前报道的心肌细胞分离方案进行了比较。首先，在本研究中，小鼠心脏从胸腔取出前，先去除心脏周围邻近的附属组织（如肺动脉和胸腺），再进行心脏切除。与以往研究2,

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讨论

本研究通过建立成年小鼠心肌细胞分离与培养的优化方案，在心血管研究领域实现了重要的方法学突破。通过对缓冲液成分和酶消化参数进行系统性优化，该方法显著提高了培养体系的可靠性，同时改善了心肌细胞的纯度和存活率。这些技术进步为利用原代成年心肌细胞建模心血管疾病提供了坚实可靠的实验平台。

通常，温和的消化有助于心肌细胞的贴壁和存活，而消化酶浓度过低则可能导致组织解离不充分。因此，优化酶浓度对于实现有效的心脏组织消化并同时维持心肌细胞活性至关重要。在某些心肌细胞分离方案12中，使用蛋白酶混合物（胶原酶和蛋白酶XIV）已被证明会降低心肌细胞的长期培养存活率，这可能是由于过度消化或去除了关键的细胞表面蛋白及细胞外基质成分所致。在我们优化的方案中，去除了蛋白酶XIV和IV型胶原酶，仅使用浓度为1.2 mg/mL的II型胶原酶。这一改进有效平衡了组织消化效率与心肌细胞活性的保持。

实验过程中偶尔可能会遇到技术难题。为促进细胞成功分离，我们提供以下故障排除建议：若发生插管不当，可降低蛇形管位置，使心脏...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金委员会（编号：82400312）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BDMAladdin Scientific Corporation，中国上海D111028
BSAAladdin Scientific Corporation，中国上海B265994
C57BL/6小鼠 GemPharmatech有限公司8–12周龄雄性 
CaCl2Aladdin Scientific Corporation，中国上海C431202
II型胶原酶Worthington Biochemical Corporation（美国）LS004176批号：43D23502   酶活性单位：270单位/毫克干重
FBS碧云天生物技术，中国C0226
葡萄糖Aladdin Scientific Corporation，中国上海D639737
HEPESSigma-AldrichH7006
KClAladdin Scientific Corporation，中国上海P112134
KH2PO4Aladdin Scientific Corporation，中国上海P104075
L-谷氨酰胺赛默飞世尔科技25030081
MEM赛默飞世尔科技11095080
MgSO4Aladdin Scientific Corporation，中国上海M116444
Na2HPO4Aladdin Scientific Corporation，中国上海S274390
NaClAladdin Scientific Corporation，中国上海C111547
NaH2PO4Aladdin Scientific Corporation，中国上海S108339
NaHCO3Aladdin Scientific Corporation，中国上海S112338
青霉素-链霉素（100倍浓度）碧云天生物技术，中国C0222
Primovert倒置细胞培养显微镜 卡尔·蔡司公司
牛磺酸Aladdin Scientific Corporation，中国上海T103829

参考文献

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