动物组织测定法利用核闪烁检测技术，通过测量放射性标记的葡萄糖掺入糖原的情况，来确定糖原合酶的酶活性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
糖原对许多真核细胞而言是一种重要的代谢物，在能量储存和快速能量释放中起关键作用。糖原分子的合成依赖于糖原合酶，这是一种高度调控的酶，其主要功能是促进葡萄糖单元依次连接到正在延长的糖原聚合物上。该酶可被葡萄糖-6-磷酸变构激活，并通过多部位磷酸化作用受到抑制。了解糖原合酶的酶活性对于理解糖原代谢、肌肉能量水平以及糖尿病和糖原累积病等代谢性疾病至关重要。本文介绍一种高灵敏度且有效的方法，通过测定放射性标记的[14C]-UDP-葡萄糖中的葡萄糖整合到糖原分子中的量，来检测动物肌肉组织中糖原合酶的活性。该实验过程使用放射性14C，因此需要获得相应的使用与处置许可，并具备合适的实验空间。此外，本实验还需要使用液体闪烁计数器。
引言
糖原是一种由葡萄糖单元组成的高度分支的多糖，在多种组织（包括肌肉、肝脏和大脑）中作为重要的能量储备1。其合成与降解由一系列特异性酶和调节蛋白构成的复杂系统协同调控。在糖原生物合成中起关键作用的是糖原合酶（glycogen synthase, GYS），该酶有两种同工型（GYS1 和 GYS2）。GYS1 是一种调节酶，直接负责在非肝脏细胞中由葡萄糖合成糖原，而 GYS2 则在肝脏中发挥作用。这一过程称为糖原生成（glycogenesis），即逐个将葡萄糖单元添加到不断延长的糖原链上。GYS 催化葡萄糖从中间产物尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）转移至糖原链的末端，形成α-1,4-糖苷键2。该反应与糖原分支酶协同进行，使糖原分子不断延伸，从而实现高效的能量储存与释放。
已有多种检测技术可用于测定酶活性，其中较为常见的一类方法为分光光度法3,4。这类检测通常依赖于间接偶联反应系统，并在340 nm处测定下游产物NADH的吸光度。每释放一个由糖原合酶从UDP-葡萄糖中释放出的UDP分子，就会消耗一单位的NADH ，从而产生可测量的激发信号，该信号与糖原合酶活性直接相关5,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验程序均经鲍尔州立大学动物护理与使用委员会批准。本研究中以3月龄的雄性和雌性B6;129-Gaatm1Rabn/J 野生型小鼠群体作为代表性示例。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 测定前的准备
- 通过颈椎脱位法处死动物并取出组织16，立即在液氮中速冻以保存糖原，随后保存于液氮或超低温冰箱中，直至开始检测。
- 在开始糖原合酶活性检测前配制好储备溶液（表1）。
- 确定实验所需的重复小鼠样本数和对照组数量。每个小鼠样本需设四个重复孔，每种反应条件（有或无G6P）各两个重复（参见 图1 和 表2）。
- 将层析纸裁剪成4 cm长的纸条。糖原可结合于该纸条上，并在洗涤过程中保持结合状态。使用碎纸机的宽度（6 mm），将层析纸切成细条状单个片段。
- 使用铅笔在指定的纸条上标记小鼠编号、空白孔和总活性孔。避免使用墨水笔。
- 将层析纸条装入木质模板中。每个模板最多可容纳12张纸条，对应96孔板的一行。
- 准备层析纸夹（文件夹盖板）。
- 为每一行反应准备一个夹子，将层析纸边缘夹住，使纸条大部分表面暴露在外....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
按照方案，由闪烁探测器生成的打印结果将包含来自每个含有小瓶的色谱纸所释放的电离辐射测量值，该值直接对应糖原合酶的活性水平。闪烁探测器将在设定的时间内计算每个样品、空白对照和总量的每分钟计数（CPM）。首先将CPM转换为DPM（每分钟衰变数），该转换基于所用闪烁计数器的效率（DPM = CPM / 效率）。效率通过测定一个已知DPM的标准源来确定。计算酶活性的公式如下：
[样本平均 DPM/2.2 × 10⁶] × [总测定体积（75 µL）/点样于层析纸的体积（55 µL）] × (1/比活性) × (1/测定孵育时间（分钟）) × (1/蛋白质量（mg）) × (1000 nmol/µmol)
通过将每孔的 µCi 除以每孔的 µmol UDP-葡萄糖来计算比活性。使用 Bradford 法测定蛋白质的毫克数。
图1 显示了来自小鼠骨骼肌的代表性数据集。所获得的数据与他人使用GYS酶活性放射化学测定法的研究结果.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
测定糖原合酶酶活性是监测各种代谢状态和疾病状态下糖原代谢的有力工具。在有或无葡萄糖-6-磷酸（G6P）的条件下进行测定，可揭示该酶的调控状态，并间接反映其磷酸化水平。[U-14C]-UDP-葡萄糖掺入法是一种高效且文献记载充分的技术，用于测定糖原合酶的酶活性，具有高灵敏度、底物特异性强以及适用于小量组织样本（如小鼠骨骼肌）的优点。本文所述实验方案经过优化，用于定量小鼠肌肉裂解液中的GYS1活性，同时强调了该方法相较于其他酶学检测技术的技术优势，以及在更广泛应用中需注意的相关事项。
该技术的成功实施需要注意多个方面。组织匀浆必须经过仔细标准化，因为裂解不完全或蛋白产量不一致可能导致酶活性标准化时引入人为误差。为避免这一问题，建议将本检测方法与Bradford法结合使用，后者是一种用于定量小样本中蛋白质含量的实验步骤19。同样，孵育时间和温度必须优化，以确保产物生成处于线性范围内。外源性糖原的存在对于GYS1介导的链延伸至关重要，尤其是在内源性糖原水平较低或耗竭程度不一的情况下（例如禁食后或基因敲除模型中）。
.......访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
部分资金由鲍尔州立大学、印第安纳大学医学院-芒西分校以及Aro Biotherapeutics提供。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| [14C] 尿苷二磷酸葡萄糖 | 美国放射性标记化学品公司 | ARC 0154 | |
| 31 ETCHR 层析纸 | 沃特曼 | 3031 915 | |
| 盐酸苯甲脒水合物 | 西格玛 | B6506 | |
| β-巯基乙醇 | 西格玛 | M3148 | |
| 干浴仪 | 托里松林科学公司 | SC25 | |
| 乙醇（200度） | PharmcoAaper | 111000200 | |
| 乙二醇四乙酸（EGTA） | 西格玛 | E4378 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | 西格玛 | E5134 | |
| 葡萄糖-6-磷酸钠盐 | 西格玛 | G7879 | |
| 兔肝糖原（III型） | 西格玛 | G8876 | |
| 平底96孔微孔板 | 格雷纳 | 655101 | |
| PCR用96孔微孔板 | DOT Scientific | 951-PCR | |
| 多功能液体闪烁计数仪 | 贝克曼库尔特 | LS 6500 | |
| 氟化钾二水合物 | 西格玛 | 221872 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | GoldBio | GB-108-2 | |
| 闪烁液 | Research Products International | 111195 | |
| 闪烁瓶 | Research Products International | 125509 | |
| 氟化钠 | 西格玛 | S7920 | |
| 组织撕裂器 | Biospec Products | Model 398 | |
| 甲苯磺酰赖氨酸氯甲基酮（TLCK） | 西格玛 | T7254 | |
| Trizma碱（99.9%） | 西格玛 | T1503 | |
| Trizma盐酸盐 | 西格玛 | T3253 | |
| 尿苷二磷酸葡萄糖 | 西格玛 | U-4625 |
参考文献
- Preiss, J., Walsh, D. A. Biology of Carbohydrates. Ginsburg, V., Robbins, P. 1, John Wiley. 199-314 (1981).
- Pederson, B. A. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. 84-137 (2021).
- Wayllace, N. Z., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
