动物组织中糖原合酶酶活性的放射化学评估

摘要

动物组织测定法利用核闪烁检测技术，通过测量放射性标记的葡萄糖掺入糖原的情况，来确定糖原合酶的酶活性。

摘要

糖原对许多真核细胞而言是一种重要的代谢物，在能量储存和快速能量释放中起关键作用。糖原分子的合成依赖于糖原合酶，这是一种高度调控的酶，其主要功能是促进葡萄糖单元依次连接到正在延长的糖原聚合物上。该酶可被葡萄糖-6-磷酸变构激活，并通过多部位磷酸化作用受到抑制。了解糖原合酶的酶活性对于理解糖原代谢、肌肉能量水平以及糖尿病和糖原累积病等代谢性疾病至关重要。本文介绍一种高灵敏度且有效的方法，通过测定放射性标记的[14C]-UDP-葡萄糖中的葡萄糖整合到糖原分子中的量，来检测动物肌肉组织中糖原合酶的活性。该实验过程使用放射性¹⁴C，因此需要获得相应的使用与处置许可，并具备合适的实验空间。此外，本实验还需要使用液体闪烁计数器。

引言

糖原是一种由葡萄糖单元组成的高度分支的多糖，在多种组织（包括肌肉、肝脏和大脑）中作为重要的能量储备¹。其合成与降解由一系列特异性酶和调节蛋白构成的复杂系统协同调控。在糖原生物合成中起关键作用的是糖原合酶（glycogen synthase, GYS），该酶有两种同工型（GYS1 和 GYS2）。GYS1 是一种调节酶，直接负责在非肝脏细胞中由葡萄糖合成糖原，而 GYS2 则在肝脏中发挥作用。这一过程称为糖原生成（glycogenesis），即逐个将葡萄糖单元添加到不断延长的糖原链上。GYS 催化葡萄糖从中间产物尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）转移至糖原链的末端，形成α-1,4-糖苷键²。该反应与糖原分支酶协同进行，使糖原分子不断延伸，从而实现高效的能量储存与释放。

已有多种检测技术可用于测定酶活性，其中较为常见的一类方法为分光光度法^3,4。这类检测通常依赖于间接偶联反应系统，并在340 nm处测定下游产物NADH的吸光度。每释放一个由糖原合酶从UDP-葡萄糖中释放出的UDP分子，就会消耗一单位的NADH ，从而产生可测量的激发信号，该信号与糖原合酶活性直接相关^5,6。尽管分光光度法检测相对经济且易于实施，但其存在一些局限性：一方面依赖于间接反应，另一方面易受样品浊度干扰，且灵敏度较低，尤其在样品量较少或糖原合酶含量低或高度磷酸化的情况下更为显著。为提高检测灵敏度，已开发出基于上述偶联反应的荧光检测法，适用于人⁷和小鼠⁸肌肉组织。此外，还有其他用于定量糖原合酶的技术，如免疫印迹⁹和免疫组织化学¹⁰；然而，这些技术仅能测定酶的物理含量，最多可通过磷酸化状态间接推断其活性，而无法直接量化酶活性¹¹。

在这些酶活性检测技术中，放射化学方法仍然是测定哺乳动物组织中糖原合酶活性应用最广泛的方法，因其不受样品浊度的干扰，且具有高灵敏度^8,9这些实验利用了带有14C标记的UDP-葡萄糖中的放射性标记葡萄糖¹² 或 3H¹³ 转化为糖原，从而可在设定的时间内直接测定酶活性。在以下实验步骤中，将含有糖原合酶的组织样本与UDP-葡萄糖和糖原引物共同孵育。糖原合酶催化如下方程式所示的反应：

UDP-[¹⁴C]葡萄糖 + (糖原)_n → (糖原)_n+1[14C] + UDP

经过设定的时间后，终止反应，并将含有放射性标记葡萄糖的糖原通过滤纸沉淀法¹²（如下所述）或采用Niederwanger等¹⁴所述的凝胶过滤法进行分离，随后使用闪烁探测器进行测量。该方法还包括一个独立但相同的反应体系，其中加入葡萄糖-6-磷酸（G6P），即糖原合酶的别构激活剂。在G6P浓度充足的条件下，糖原合酶活性被最大程度激活，从而反映给定样本中糖原合酶活性的绝对潜力。此处描述的方法由Suzuki及其同事¹⁵的方法修改而来，适配为96孔板格式，并针对小鼠肌肉组织的使用进行了优化；然而，该方案也可根据其他组织和动物物种进行相应调整。

尽管放射性材料存在固有的成本和安全考虑，但只要具备相应的仪器，放射性化学测定法相较于非放射性替代方法仍具有显著优势。以下方案详细描述了一种高灵敏度且稳健的方法，用于测定动物肌肉组织中糖原代谢关键酶——糖原合成酶的活性。

方案

所有实验程序均经鲍尔州立大学动物护理与使用委员会批准。本研究中以3月龄的雄性和雌性B6;129-Gaa^tm1Rabn/J 野生型小鼠群体作为代表性示例。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 测定前的准备

1. 通过颈椎脱位法处死动物并取出组织¹⁶，立即在液氮中速冻以保存糖原，随后保存于液氮或超低温冰箱中，直至开始检测。
2. 在开始糖原合酶活性检测前配制好储备溶液（表1）。
3. 确定实验所需的重复小鼠样本数和对照组数量。每个小鼠样本需设四个重复孔，每种反应条件（有或无G6P）各两个重复（参见 图1 和 表2）。
4. 将层析纸裁剪成4 cm长的纸条。糖原可结合于该纸条上，并在洗涤过程中保持结合状态。使用碎纸机的宽度（6 mm），将层析纸切成细条状单个片段。
5. 使用铅笔在指定的纸条上标记小鼠编号、空白孔和总活性孔。避免使用墨水笔。
6. 将层析纸条装入木质模板中。每个模板最多可容纳12张纸条，对应96孔板的一行。
7. 准备层析纸夹（文件夹盖板）。
8. 为每一行反应准备一个夹子，将层析纸边缘夹住，使纸条大部分表面暴露在外。确保标记的边缘清晰可见。
9. 用样本编号标记1.7 mL微量离心管。每个样本需准备两管：一管用于匀浆液，另一管用于上清液。
10. 在检测开始前，分别配制含G6P（+G6P）和不含G6P（-G6P）的反应混合液，具体配方见 表3。每种反应混合液配制2,400 µL分装液。

2. 放射化学糖原合酶活性反应

注意：此步骤使用 [14C]-UDP-葡萄糖，其为放射性物质。操作、储存和处置必须遵循核管理委员会（NRC）批准的方式进行。

1. 加入30 µL of [14C]-UDP-葡萄糖（0.1 µCi/ µ升至 2,400 µL 两种（±G6P）反应混合物的等分试样，以获得终浓度为 0.0012 µCi/ µL. 此配方适用于18个样品。
   注意：[14C]-UDP-葡萄糖的用量可根据需要调整，以节约试剂并确保足够的检测灵敏度。例如，可使用50 µ小鼠脑组织的 L 和 25 µ小鼠心脏的 L。
2. 涡旋反应混合物并分装50 µL 至将用于盛放样品、空白和总量的 96 孔板的每个孔中（表 2随后，用封板膜覆盖，并置于4°C。
3. 将蛋白酶抑制剂置于室温下解冻。这些抑制剂的清单如下所列： 表 4 并附有额外信息。
4. 称取30-50 mg冷冻组织。骨骼肌和心脏样本以约30 mg为宜，脑组织样本以约50 mg为宜。将组织和微量离心管置于液氮中，迅速称重以确保组织保持冷冻状态。使用预冷的研钵杵进一步研磨组织。
5. 在冰上制备含有蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液。
6. 每次处理一个样本，将装有组织的离心管从液氮中转移至冰上，并用预冷的管盖（在液氮中冷却的带三个小孔的管盖）盖住，保持1分钟。在样本仍处于液氮中时，将冷盖加至样本管上，以防止管内残留的液氮蒸发导致组织损失。一旦离开液氮，样本应始终保持在冰上。
7. 置于冰上后，加入体积（10–30） µL/mg 组织）的匀浆缓冲液加入样品中，并使用 Tissue-Tearor 匀浆器对样品进行匀浆。完成这两个步骤后，继续处理下一个样品。
   注意：加入样本的缓冲液体积可根据组织来源进行优化。例如：30 µL/mg 用于骨骼肌，15 µL/mg 用于心脏，以及 10 µL/mg 脑组织
8. 4℃下离心样品5分钟 ˚3,600 × g，4 °C g 并将上清液转移至干净的微量离心管中。注意不要触碰沉淀。涡旋混匀后加入约150 µ将 L 加入置于冰上的 v 底 96 孔板的相应孔中。剩余上清液留作 Bradford 测定用（见步骤 2.15）
   注意：如有需要，可保存额外的样品等分试样，用于后续实验，如免疫印迹分析。
   警告：步骤 2.9 至 2.14 需要操作 ¹⁴C. 以符合美国核管会（NRC）规定的方式处理所有受污染材料。
9. 从4℃取出反应混合板 ˚C，并加热至30℃ ˚C，移除封膜。在此期间，取1 L的-20 ˚C 66% 乙醇并加入装有搅拌棒的洗涤烧杯中 搅拌板
10. 通过加入25微升样品上清液启动反应 µL 样品上清液加入反应孔，25 µ向空白孔和总量孔中加入 L 匀浆缓冲液。每次使用多通道移液器向反应板的一行加样，每行之间至少等待 1 分钟。记录每行反应开始的准确时间。参见 表 2 有关更多信息，请使用多通道移液器，并确保添加等体积的液体。
11. 让反应进行10-15分钟；然而，各排之间的反应时间应完全相同。
12. 吸取55 µ使用多通道移液器从每个孔中吸取L，并转移至先前准备好的相应层析滤纸上。在吸取前，通过反复吹打混匀反应液。将液体小心点样于层析滤纸的中心位置。
13. 用镊子将加样后的总样层析纸从夹子上取下，可安全地平铺在铝箔上晾干。将所有其他层析纸放入正在搅拌的66%乙醇溶液中。糖原在66%乙醇中不溶解，而[14C]-UDP-葡萄糖可溶，会从层析纸上被洗脱。
14. 对反应板上的每一行重复步骤 2.11 和 2.12。通过记录每行反应的起始和终止时间，确保各反应时间一致。
15. 将所有行加入搅拌中的66%乙醇后，洗涤15分钟。
    注意：在此步骤及后续洗涤步骤中，可同时制备样品等分试样用于其他辅助检测，例如用于测定总蛋白量以进行归一化处理的布拉德福法（Bradford assay），该数据在计算酶活性时是必需的。
16. 弃去66%乙醇，注意勿丢失层析滤纸。用1 L新鲜的66%乙醇室温洗涤30分钟。
17. 重复上一步，共进行三次30分钟的66%乙醇洗涤。
    注意：如有需要，可将最后洗涤步骤中的66%乙醇保存并于-20℃储存。 ˚用于后续检测。
18. 去除66%乙醇后，将所有层析滤纸浸入盛有丙酮的洗涤烧杯中。丙酮有助于加快干燥过程。
19. 将层析纸从丙酮中取出，平铺在铝箔上。保留或处理掉丙酮。
20. 在热源灯下干燥层析纸15分钟。
    注意：干燥后的滤纸可无限期保存。滤纸可安全存放，直至准备进行闪烁检测。

3. 使用闪烁检测法测定活性

1. 使用镊子将层析纸转移至放置在闪烁计数架中的闪烁瓶内。记录样品纸的摆放方向。
2. 使用瓶盖泵向每个闪烁瓶中加入 5 mL 闪烁液。拧紧每个闪烁瓶的瓶盖。
3. 将样品装入闪烁计数器中，并将屏蔽架置于样品后方。确保选择用于监测 ¹⁴C 的程序，然后选择自动计数以开始检测。
4. 打印结果
5. 按照美国核管会（NRC）批准的方式处理闪烁管及其内容物。

结果

按照方案，由闪烁探测器生成的打印结果将包含来自每个含有小瓶的色谱纸所释放的电离辐射测量值，该值直接对应糖原合酶的活性水平。闪烁探测器将在设定的时间内计算每个样品、空白对照和总量的每分钟计数（CPM）。首先将CPM转换为DPM（每分钟衰变数），该转换基于所用闪烁计数器的效率（DPM = CPM / 效率）。效率通过测定一个已知DPM的标准源来确定。计算酶活性的公式如下：

[样本平均 DPM/2.2 × 10⁶] × [总测定体积（75 µL）/点样于层析纸的体积（55 µL）] × (1/比活性) × (1/测定孵育时间（分钟）) × (1/蛋白质量（mg）) × (1000 nmol/µmol)

通过将每孔的 µCi 除以每孔的 µmol UDP-葡萄糖来计算比活性。使用 Bradford 法测定蛋白质的毫克数。

图1 显示了来自小鼠骨骼肌的代表性数据集。所获得的数据与他人使用GYS酶活性放射化学测定法的研究结果...

讨论

测定糖原合酶酶活性是监测各种代谢状态和疾病状态下糖原代谢的有力工具。在有或无葡萄糖-6-磷酸（G6P）的条件下进行测定，可揭示该酶的调控状态，并间接反映其磷酸化水平。[U-¹⁴C]-UDP-葡萄糖掺入法是一种高效且文献记载充分的技术，用于测定糖原合酶的酶活性，具有高灵敏度、底物特异性强以及适用于小量组织样本（如小鼠骨骼肌）的优点。本文所述实验方案经过优化，用于定量小鼠肌肉裂解液中的GYS1活性，同时强调了该方法相较于其他酶学检测技术的技术优势，以及在更广泛应用中需注意的相关事项。

该技术的成功实施需要注意多个方面。组织匀浆必须经过仔细标准化，因为裂解不完全或蛋白产量不一致可能导致酶活性标准化时引入人为误差。为避免这一问题，建议将本检测方法与Bradford法结合使用，后者是一种用于定量小样本中蛋白质含量的实验步骤¹⁹。同样，孵育时间和温度必须优化，以确保产物生成处于线性范围内。外源性糖原的存在对于GYS1介导的链延伸至关重要，尤其是在内源性糖原水平较低或耗竭程度不一的情况下（例如禁食后或基因敲除模型中）。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[14C] 尿苷二磷酸葡萄糖	美国放射性标记化学品公司	ARC 0154
31 ETCHR 层析纸	沃特曼	3031 915
盐酸苯甲脒水合物	西格玛	B6506
β-巯基乙醇	西格玛	M3148
干浴仪	托里松林科学公司	SC25
乙醇（200度）	PharmcoAaper	111000200
乙二醇四乙酸（EGTA）	西格玛	E4378
乙二胺四乙酸（EDTA）	西格玛	E5134
葡萄糖-6-磷酸钠盐	西格玛	G7879
兔肝糖原（III型）	西格玛	G8876
平底96孔微孔板	格雷纳	655101
PCR用96孔微孔板	DOT Scientific	951-PCR
多功能液体闪烁计数仪	贝克曼库尔特	LS 6500
氟化钾二水合物	西格玛	221872
蛋白酶抑制剂混合物	GoldBio	GB-108-2
闪烁液	Research Products International	111195
闪烁瓶	Research Products International	125509
氟化钠	西格玛	S7920
组织撕裂器	Biospec Products	Model 398
甲苯磺酰赖氨酸氯甲基酮（TLCK）	西格玛	T7254
Trizma碱（99.9%）	西格玛	T1503
Trizma盐酸盐	西格玛	T3253
尿苷二磷酸葡萄糖	西格玛	U-4625