研究CD8 T细胞的分化与功能 体外，可从 小鼠 中分离 CD8 T 细胞，并与已形成的感染性 小鼠 阴道上皮类器官进行长期共培养。本文描述了该过程，并评估共培养过程中组织驻留记忆 T 细胞标志物的获得情况。
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方法文章
体外 使用上皮类器官-T细胞共培养系统诱导组织驻留记忆性CD8 T细胞分化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
屏障黏膜组织在定居T细胞的分化与功能中发挥重要作用。在这些组织的多种细胞群体中，上皮细胞是驱动T细胞分化的关键因素。然而，由于缺乏特异性工具以及现有模型系统的复杂性，我们对塑造黏膜环境中T细胞生物学特性的上皮来源信号仍知之甚少。本文介绍了一种小鼠阴道上皮类器官与CD8 T细胞共培养体系，用于模拟感染的上皮细胞与病毒特异性CD8 T细胞之间的动态相互作用。该方案可在生理相关的三维上皮微环境中实现对T细胞应答的表型和功能分析。利用该系统，我们证实了效应CD8 T细胞可分化为组织驻留记忆T细胞（TRM）。这一多功能的in vitro培养体系为深入研究上皮信号在CD8 T细胞分化中所起的分子机制提供了简化的研究平台，有助于阐明屏障器官中保护性免疫及免疫病理过程的调控机制。
引言
CD8 组织驻留记忆性 T 细胞（TRMs）是一类独特的记忆性 CD8 T 细胞亚群，可长期驻留于外周组织中，通常不进入血液循环或淋巴组织。这些 TRM 细胞战略性地定位于屏障器官，包括皮肤、肺、肠道和生殖道，在这些部位它们作为哨兵细胞抵御病原体和早期肿瘤1,2。当检测到病原体时，CD8 TRM 细胞迅速释放细胞毒性颗粒，直接清除被感染的细胞，同时分泌促炎性细胞因子，以激活周围组织细胞并募集循环中的免疫效应细胞，从而控制病原体的扩散3,4。CD8 TRM 细胞在抗病原体免疫以及癌症免疫治疗中的有效性已得到证实5,6。因此，在屏障黏膜组织中建立数量充足且功能健全的 CD8 TRM 细胞群，是当前疫苗开发和免疫治疗策略的关键目标。
外周器官中 CD8 TRM 的形成与维持在很大程度上依赖于局部组织特异性的程序化调控。这些局部微环境信号包括独特的组织来源的细胞因子和代谢因子，以及多种细胞间相互作用，共同确立了组织特异性的 TRM 表型7,
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方案
所有涉及动物的实验程序均经布朗大学机构动物护理和使用委员会审查并批准（方案编号 22-10-0001）。
1. 活化板的基本设置与准备
- 实验开始前一天，准备一个未经处理的组织培养板，用于接种初始CD8 T细胞。用无菌dPBS配制激活抗体溶液，抗CD3ε（2C11）终浓度为1 µg/mL，B7-1 Fc终浓度为0.167 µg/mL。对于24孔板，每孔加入600 µL该溶液。4 °C孵育过夜，直至使用。
- 通过向无菌dPBS中加入2%活性炭处理的胎牛血清（FBS）和1 mM EDTA，配制淋巴细胞富集缓冲液。4 °C保存，直至使用。
- 通过向ddH2O中加入10 mM碳酸氢钾、155 mM氯化铵和0.1 mM EDTA，配制氯化铵-氯化钾红细胞裂解缓冲液（ACK RBC裂解液）。过滤除菌后，室温保存。
- 通过向RPMI培养基中加入5%活性炭处理的FBS，配制适量收获培养基。4 °C保存，直至使用。每只待收获小鼠建议使用50 mL收获培养基。
注意：青霉素/链霉素和两性霉素B为可选添加物，但如果在组织分离过程中存在污染风险，添加终浓度为100单位/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.2 µg/mL两性霉素B可能有助于防止T细胞培养中的细菌和真菌污染。 - 通过向RPMI培养基中加入10%活性炭处理的FBS、2 mM ....
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结果
CD8 T细胞感染类器官共培养的显微观察
预先形成的鼠源VEO用LCMV感染，并与LCMV特异性的CD8 T细胞进行共培养。我们还使用HSV-2感染模型进行了类似的共培养实验，以验证本方案的通用性；但此处仅展示LCMV模型的显微图像数据，HSV-2模型的相关T细胞分化数据则在下文提供。LCMV表达黄色荧光蛋白（YFP），因此可通过常规落射荧光显微镜观察被感染的细胞。具体操作中，7日龄VEO在与CD8 T细胞共孵育前24小时接种LCMV-YFP（图1A）。另取LCMV特异性的转基因P14 CD8 T细胞，按照前述激活与静息方案进行活化处理。在共培养当天，将感染后的类器官从BME基质中释放出来，并与前述适当数量的活化CD8 T细胞混合。该混合群体被重悬于新的BME基质中，并接种至96孔板用于成像分析（图1B）。共培养后4小时即可观察到类器官中存在大量病毒复制，表现为绿色荧光信号。然而，CD8 T细胞在感染类器官周围的聚集现象则在较晚时间点才变得明显。我们还注意到，在后期时间点类器官.......
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讨论
CD8 TRMs 依赖局部微环境信号进行分化和维持。这些信号赋予 CD8 TRMs 组织特异性的程序化特征，使其能够适应所处环境并按需执行免疫监视功能。然而，TRMs 未能存活下来 体外 一旦从组织中提取出来，这限制了对其的详细分析12,13在此方案中，我们提供了一种将CD8 T细胞与上皮细胞共培养的方法，使其发育为具有类似组织驻留记忆性T细胞（TRM）表型特征的细胞 体内 组织驻留记忆T细胞（TRMs）。该方法可用于长期研究TRMs，且易于调整以适用于其他组织、病毒及遗传修饰。
本方案最关键的要素与细胞健康有关。T细胞在共培养之前必须处于增殖状态且存活良好。若T细胞未得到充分激活，并缺乏持续的IL-2供给，则除非提供其他生存信号（包括IL-7和IL-15），否则仍无法长期存活；尽管我们已发现VEO本身可在一定程度上支持T细胞的存活10。若在共培养时T细胞的存活率未达到80%以上，则.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目R01AI177704-01A1、R21AI183017-01、布朗大学种子基金（资助L.K.B.）以及F31AI186444（资助Y.L.）的支持。我们感谢美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS，NIH）的Dorian B. McGavern博士提供了表达黄色荧光蛋白（YFP）的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。我们感谢Sanghyun Lee博士及其实验室在Cytation-5成像方面的协助，以及布朗大学流式细胞术核心设施在基于流式的检测实验中提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 甲醛水溶液 | 电子显微镜科学公司 | 15710-S | |
| 24孔未处理聚苯乙烯组织培养板 | VWR International | 10861-558 | |
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 3 mL 无菌注射器 | Fisher Scientific | 14-955-457 | |
| 5 mL Snap Cap 无菌圆底聚苯乙烯试管 | Falcon | 352058 | |
| 60 mm 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 70 μm 无菌细胞筛 | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 96孔未处理聚苯乙烯圆底微孔板 | Greiner Bio-One | 650101 | |
| 96孔未处理聚苯乙烯细胞培养板 | VWR International | 10861-562 | |
| 牛血清白蛋白/第五组分 | 赛默飞世尔科技化学品 | J6465518 | |
| 氯化铵 | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 两性霉素B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | |
| B-27 补充剂 | Gibco | 17504044 | |
| ioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪 | |||
| DMEM/F12 1:1 培养基 | Cytiva | SH30271.FS | |
| 杜氏磷酸盐缓冲盐溶液 1x | 康宁 | 21031CV | |
| 乙二胺四乙酸（0.5 M 溶液/pH 8.0） | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
| 超精细显微解剖剪 | Roboz 外科器械公司 | RS-5882 | |
| 胎牛血清 - 活性炭/葡聚糖处理 | R&D Systems | S11650 | |
| Flowjo v10 软件 | Becton, Dickinson and Company | FlowJo (RRID:SCR_008520) | |
| 格拉夫镊子 | Roboz外科器械公司 | RS-5135 | |
| HEPES 溶液 | Cytiva | SH30237.01 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco | A2916801 | |
| 磁铁 5 mL | Biolegend | 480019 | |
| 小鼠 CD8 Naïve T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480044 | |
| 小鼠 EGF 重组蛋白 | Gibco | 315091MG | |
| 非必需氨基酸溶液（100倍浓缩液） | Gibco | 11140050 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Cytiva | SV30010 | |
| 碳酸氢钾 | MP Biomedicals | 0215255780 | |
| 纯化的抗小鼠 CD3 抗体ε 抗体 | Biolegend | 100360 | |
| 重组小鼠 B7.1 (CD80)-Fc 融合蛋白（无载体） | Biolegend | 555406 | |
| 重组小鼠 IL-12 (p70)（无载体） | Biolegend | 577004 | |
| 重组小鼠 IL-2（无载体） | Biolegend | 575406 | |
| 生长因子减少型基底膜提取物 | R&D Systems | BME001-10 | |
| RPMI 1640培养基 | Cytiva | SH30027.LS | |
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | S227I-25 | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 11360070 | |
| 含0.25% 胰蛋白酶的蛋白酶（猪源胰蛋白酶） | Cytiva | SH30042.02 | |
| 活力染料（红色 780） | Cytek 生物科学 | 13-0865-T100 |
参考文献
- Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. Tissue resident memory T cells and viral immunity. Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nat Med.
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