体外 利用上皮类器官-T细胞共培养系统进行驻留记忆CD8 T细胞分化

摘要

为了在 体外研究CD8 T细胞的分化和功能，可以从小鼠中分离出CD8 T细胞，与预先形成的感染小鼠阴道上皮类器官长期共培养。本文描述该过程，并评估共培养后常驻记忆T细胞标记的获得情况。

摘要

屏障黏膜组织在驻留T细胞的分化和功能中起着重要作用。在这些组织中多样的细胞群体中，上皮细胞是T细胞分化的关键驱动力。然而，我们对塑造黏膜环境中T细胞生物学的上皮来源信号的理解仍然有限，主要原因是缺乏专门工具和现有模型系统的复杂性。本文介绍了一种小鼠阴道上皮类器官-CD8 T细胞共培养系统，模拟感染上皮与病毒特异性CD8 T细胞之间的动态相互作用。该方案能够在生理相关的三维上皮微环境中，对T细胞反应进行表型和功能分析。利用该系统，我们展示了效应CD8 T细胞分化为组织驻留记忆T细胞（TRM）的过程。这一多功能体 外 培养系统为研究CD8 T细胞分化背后的上皮线索的分子细节提供了机会，这些线索决定屏障器官中的保护性免疫和免疫病理。

引言

CD8常驻记忆T细胞（TRMs）代表了一类独特的记忆CD8 T细胞群体，它们永久保留在外周组织中，不会常规地通过血液和淋巴组织循环。这些TRM细胞被战略性地安置在屏障器官中，包括皮肤、肺、肠道和生殖道，作为对抗病原体和新生肿瘤的哨兵^1,2。检测到病原体后，CD8 TRM细胞迅速释放细胞毒性颗粒，直接消灭感染细胞，同时分泌炎症性细胞因子，提醒周围组织细胞并招募循环免疫因子以控制病原体传播 ^3,4。CD8 TRMs在抗病原体免疫和癌症免疫治疗中的疗效已被证明^5,6。因此，在屏障黏膜组织中大量定位功能正常的CD8 TRM是疫苗和免疫治疗策略的关键目标。

CD8 TRM在外周器官的形成和维持关键依赖于局部组织特异性编程。这些局部环境线索包括独特的组织来源细胞因子和代谢因子，以及共同强化组织特异性TRM身份^的细胞间相互作用^7,8,9。这种组织编程使TRM能够适应组织特异性需求，执行免疫监测任务。然而，由于缺乏能够忠实捕捉这些过程的稳健模型系统，我们对这些相互作用的本质理解尚不完整。小动物模型虽然信息量很大，但往往存在高度相互关联、复杂的相互作用网络，阻碍了快速的高通量研究。

本文介绍了一种体 外 替代小鼠模型的方法，旨在研究CD8 TRM分化背后上皮细胞来源线索的分子细节。通过将预形成的阴道上皮类器官（VEOs）与活化的CD8 T细胞共培养，我们在 体外产生了CD8 TRM。对CD8 T细胞激活与共培养过程的详细描述，将有助于该过程在各组织中更广泛地应用，进而加深对前线组织中塑造CD8 T细胞记忆的细胞相互作用的理解。

方案

所有涉及动物的程序均由布朗大学机构动物护理与使用委员会审查并批准（协议编号22-10-0001）。

1. 激活板的基本设置与准备

1. 实验开始前一天，准备一个未处理的组织培养板，用初生CD8 T细胞进行播种。制备一种活化抗体溶液，含无菌dPBS，最终浓度为1 μg/mL（抗CD3ε，2C11），B7-1 Fc为0.167 μg/mL。对于24孔板，每孔分配600微升该溶液。在4°C下孵育一夜，直到准备使用。
2. 在无菌dPBS中加入2%去除炭的FBS和1 mM EDTA到无菌dPBS中，制备淋巴细胞富集缓冲液。保存温度为4°C，直到准备使用。
3. 在ddH_2O中加入10 mM碳酸氢钾、155 mM氯化铵和0.1 mM EDTA，制备氨-氯-钾红细胞（ACK RBC）裂解缓冲液。过滤、消毒后保持室温。
4. 在RPMI中准备适当量的采集介质，加入5%去除炭的FBS。保存温度为4°C，直到准备使用。每只拟采集的小鼠建议使用50毫升采集培养基。
   注意：青霉素/链霉素和两性霉素B为可选，但最终浓度为100单位/毫升青霉素、100 μg/mL链霉素和0.2 μg/mL两性霉素B，可能有助于防止组织分离过程中T细胞培养的细菌和真菌污染，如果这会带来问题。
5. 通过加入10%活性炭剥离FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100 μg/mL链霉素、1x非必需氨基酸和1 mM丙酮酸，制备RPMI中的T细胞培养基。对于24孔板，每孔使用2毫升T细胞培养基，整板使用50毫升T细胞培养基。保存温度为4°C，直到准备使用。
6. 准备解剖工具（0.4毫米微解剖剪刀和0.8毫米细弯曲微锯齿钳），方法是在灭菌袋中高压灭菌或浸泡在70%乙醇中。

2. 采集和解离成年小鼠次级淋巴器官

1. 用合适的适配器将离心机快冷至4°C，以容纳15毫升锥形管。
2. 准备冰块以运输组织和淋巴细胞，用于收获和孵化期。
3. 准备一个无菌的15毫升锥形管，每只待解剖的小鼠至少含有5毫升采集介质。
4. 按照机构规范，在层流罩内麻醉并安乐死一只成年CD8 T细胞转基因小鼠（~8周龄）。
5. 用任意大小的针头将老鼠的四肢固定在干净的聚苯乙烯泡沫表面上，并喷洒70%乙醇，防止毛发阻碍切口并粘附工具。
6. 使用干净的微解剖剪刀和产钳，在腹部竖直切开，将皮肤与下方薄薄的结缔组织分离。用任意尺寸的针将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫表面，切开剩余的结缔组织，露出躯干内的器官。
7. 仔细定位并切除脾脏，使用弯曲产钳去除多余脂肪，并将其转移到装有采集培养基的15毫升锥形管内。将脾脏冰敷，尽可能多地隔离淋巴结（如髂痛和腹股沟），与脾脏结合在同一根锥形管中，放入冰上。
   注意：髂静脉淋巴结位于胃肠道下方下腹部尾静脉两侧，腹股沟淋巴结位于躯干下腹部皮肤两侧浅腹静脉分支附近。富集后分离更多淋巴结以提升CD8 T细胞的产量;但仅分离脾脏通常足以产生数百万个CD8 T细胞。
8. 将脾脏和淋巴结转移到刻痕的60毫米盘子上，使用3毫升注射器活塞的平头，通过研磨组织机械性地将脾脏和淋巴结分离，直到无大块碎片残留。
9. 通过无菌70微米细胞滤网收集悬浮液，进入新的无菌15毫升锥形管中。用5毫升采集培养基清洗60毫米的培养皿，确保分解细胞完全转移，并过滤到同一15毫升锥形管中。
10. 在584× 克 下离心，4摄氏度，离心5分钟。 丢弃上清液，然后通过快速有力地将管底快速且有力地滑过离心管支架的网格，以松动沉淀。
11. 通过将松散沉淀重新悬浮于2毫升ACK红细胞溶解缓冲液中，溶解红细胞。漩涡后在室温下孵育2分钟。
12. 2分钟后，加入2毫升采集培养基中和裂解缓冲液。用5毫升血清学移液管抽取悬浮液，并通过无菌70微米滤器过滤回同一个15毫升锥形管。
    注意：这种过滤对于确保所有结块的去除非常重要。
13. 在584× 克 下离心，4°C离心5分钟。 丢弃上清液，将沉淀重新悬浮于950微升淋巴细胞富集缓冲液中。

3. CD8 T细胞富集与活化

1. 使用市售分离试剂盒从淋巴细胞中富集新生CD8 T细胞。请遵循制造商的规范。
2. CD8 T细胞富集后，将富集悬浮液转移到新的无菌15毫升锥形管，并用采集培养基填充最多10毫升的容量。
3. 用血细胞计计数。
   注：从一只成年小鼠中，可以分离出至少500万到1000万个纯净度>95%的CD8 T细胞。
4. 每孔24孔板中，至少在2毫升T细胞培养基中进行50万个细胞板。在装甲前充分混合T细胞，以确保单细胞悬浮液均匀。在T细胞培养基中补充最终浓度为100单位/mL的IL-2、2.5 ng/mL的IL-12和55微M的β-巰吶二醇。
5. 将先前被抗体包覆的组织培养板从4°C取出，小心地吸取涂层溶液，避免触及孔底。
6. 立即对T细胞进行板化。在37°C与5%二氧化碳的温度下孵育2天。

4. 去除激活信号并静置激活的CD8 T细胞

1. 用光学显微镜观察活化阱。活化2天后，观察孔中是否有小簇T细胞。更大的簇类表示激活度较高。如果没有或少量簇，则在37°C下再培养1天，含5%二氧化碳，然后再进行静置。
2. 在培养期和未使用时准备冰块以储存T细胞悬浮液。
3. 使用P1000移液器在孔的每个角落多次上下移液，重新悬浮T细胞。当T细胞被抬起后，将孔中内容物转移到无菌的50毫升锥形管中并计数。
   注意：每孔用1毫升dPBS清洗是可选的，但将dPBS洗涤液与T细胞悬浮液合并可能增加T细胞产量。
4. 以与步骤3.4相同的浓度重新镀基T细胞，每孔250,000个细胞。制备适当量的T细胞培养基，补充100单位/mL的IL-2和55微M的β-巰哰乙醇。
5. 将悬浮液在584× 克 离心，4°C下5分钟，丢弃上清液，并将沉淀重新悬浮在前一步准备的相应容量T细胞培养基中，以匹配需电镀孔数。充分混合以确保单细胞悬浮均匀。
6. 在未处理的无抗体涂层新组织培养板中，将2毫升T细胞悬浮液（500,000细胞/孔）置于平板。在37°C与5%二氧化碳的温度下孵育2天。

5. 用病毒感染预先形成的小鼠阴道上皮类器官

注：我们使用了单纯疱疹病毒-2（HSV-2）和淋巴细胞绒毛膜膜炎病毒（LCMV）进行类器官病毒感染。两者均被视为生物安全二级（BSL-2）病原体。所有涉及感染因子的程序均应在认证的BSL-2生物安全柜内进行。工作区域在使用前后均含70%乙醇清洁，并按照机构生物安全指南丢弃所有材料。在该方案中，我们从C57BL/6雌性小鼠阴道上皮细胞中采集的阴道上皮细胞建立了VEO，这些细胞描述在¹⁰之前描述。

1. 在感染前7-10天，每孔24孔板的20微升基底膜提取物（BME）中，以10,000个细胞密度进行板块VEO。
2. 共培养前一天，预留一口VEO进行胰蛋白酶化并计数，以获得准确的感染倍数（MOI）。将0.25%的Trypsin-EDTA预热，浸泡在37°C的水浴中5分钟。
   注意：感染期间不使用0.25%胰蛋白酶-EDTA;它仅用于在MOI计算中解离VEO。在此阶段，在塑料器具（如移液器尖端、锥形管）上涂覆2.5% BSA的dPBS是可选的，但可能有助于减少类器官和细胞的损失，从而实现更准确的计数。
3. 从指定孔中抽取细胞培养基，并用dPBS洗涤。
4. 向井内注入600微升预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并用BSA涂层的P1000移液器彻底重悬，机械性地破坏生物医学工程。将井内内容物转移到涂有BSA涂层的无菌15毫升锥形管中。
5. 在37°C的水浴中孵育5分钟。5分钟后，加入10毫升10% FBS在RPMI中以抑制胰蛋白酶化。
6. 以500 x g 离心，4°C离心5分钟。 丢弃上清液，并用BSA涂层移液器头在100-300微升T细胞类器官培养基或普通DMEM/F12中重新悬浮。
   注意：体积取决于颗粒的大小。如果沉淀几乎看不见，则用较低体积的重新浮悬。
7. 用血细胞计计数。利用已知的病毒滴度和每场VEO孔细胞密度，计算达到0.1 MOI所需的适当病毒量，公式如下：
   
8. 从待感染的VEO孔中抽取细胞培养基，并用500微升预热（37°C）dPBS清洗。在37°C下用dPBS孵育孔5分钟。
9. 5分钟后，丢弃dPBS，每孔加入500微升类器官培养基，含有足够病毒颗粒以达到0.1的MOI。在37°C与5%_CO2 温度下孵育1小时，每20-30分钟轻柔地手动旋转组织培养板。
10. 孵育1小时后，抽取病毒类器官培养基，并用500微升预热（37°C）dPBS洗涤。抽取dPBS，并更换为新的类器官培养基。

6. 与病毒感染的预制小鼠阴道上皮类器官共培养CD8 T细胞

1. 在共培养前（理想提前4-24小时），将生物体气温从-80°C转移到4°C进行解冻。根据共培养实验设计，预测适当的BME解冻量：计划在96孔板中每孔镀膜8微升BME，24孔板每孔镀20微升BME。
   注意：BME粘度较高，4°C的解冻时间延长可降低粘度并提升机动性。
2. 在dPBS中制备2.5%BSA并进行过滤消毒。使用这种BSA溶液，涂抹所有接触VEO的塑料表面（如移液器尖端、锥形管）。
   注意：这种涂层可以防止VEO粘附在塑料表面，避免在搬运过程中丢失。
3. 用光学显微镜检查VEO的大小和整体健康状况。确认VEOs是在培养后7-10天，平均直径约100微米。健康的VEO细胞几乎没有单细胞，形态均匀且圆形。
   注意：如果在24孔板中生长，并在24孔板中重新板基，则在共培养中重新板育VEOs（即一孔VEOs会重新播种一孔T细胞-类器官共培养孔）。如果从24孔板重新板上96孔板，则VEOs按1：2重板（即一孔VEOs可重新播种两个T细胞-类器官共培养孔）。
4. 将用于共培养所需的无菌96孔或24孔组织培养板放入37°C培养箱中。
   注意：加热的板能加快BME的粘附和凝固。
5. 在DMEM/F12中加入2%B-27补充剂、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100 μg/mL链霉素、1x非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和0.2 μg/mL两性霉素B，制备T细胞类器官培养基。保存于4°C，待使用。
6. 从VEO孔中抽取细胞培养基，并用500微升冷（2-8°C）无菌dPBS清洗每个孔。
7. 抽取dPBS，加入200-500微升冷（2-8°C）类器官采集液（至少10倍体积的类器官BME液滴）。用涂有BSA涂层的P200移液器上下移液器，机械地干扰生物医学工程。
8. 在轨道摇动器中以4°C温和摇晃（~100转/分钟）孵育板20分钟。如果没有冷的轨道振动器，可以在冰上孵化盘子，并每5分钟手动摇晃一次。如果生物医学工程在20分钟内仍未解聚，则根据需要延长孵育时间。
9. 使用BSA涂层移液器尖端将孔内内容物转移到BSA涂层的无菌15毫升或50毫升锥形冰管中。在500× 克 下离心，4°C下离心5分钟。
10. 丢弃上清液，用5-10毫升冷（2-8°C）dPBS（至少10倍体积的合成类器官BME液滴）清洗VEO。在500× 克 下离心，4°C下离心5分钟。
11. 丢弃dPBS，并用BSA涂层的P1000移液器尖端将沉淀重新悬浮于1毫升T细胞类器官培养基中。将VEO悬浮液冰藏保存，直到T细胞准备好进行共培养。
12. 开始收集T细胞进行共培养。用光学显微镜检查静息T细胞的大小和整体健康状况。如果不激活信号，T细胞会减缓增殖速度，但仍应形成一些簇。确认没有细胞碎片或碎片，T细胞形态增大。使用P1000移液器在孔的每个角落多次移液，重新悬浮T细胞，并计数活体CD8 T细胞的总数。
    注意：在96孔板的孔中，每个共培养对应100,000特斯拉细胞，8微升生物医学生成。每孔24孔板，每个共培养200,000 T细胞，20微升生物医学工程。
13. 在584× 克 下离心，4摄氏度，离心5分钟。 丢弃上清液，将沉淀重新悬浮在10毫升T细胞类器官培养基中。通过转移适当数量的T细胞，将T细胞与VEO结合，以便将孔板到含有VEO的锥形管中。
14. 离心机在584× 克 ，4摄氏度下5分钟。 丢弃上清液，重新以适当量的生物医学成分（BME）中复悬VEO细胞和T细胞。使用BSA涂层的移液器尖端彻底混合，并将24孔板每孔20微升或96孔板8微升液量板上放入预热的组织培养板上。
    注意：在电镀期间，将生物墨法冰藏或冷却块保存在4°C的冷却块中。在电镀前将移液器尖端放入4°C冰箱30分钟，有助于防止生物医学工程过早凝固。
15. 将平板倒置放入37°C的培养箱中，等待30分钟以实现生物医学生完全粘附和凝固。
16. 在该培养期内，将100 ng/mL小鼠EGF、55 μM的β-巰基乙醇和10单位/mL小鼠IL-2加入预制的T细胞类器官培养基，制备完整的T细胞类器官培养基。
17. 培养期结束后，每孔24孔板小心添加500微升完整T细胞类器官培养基，或每孔加入250微升完整T细胞类器官培养基。将培养基喷洒在井壁，以避免破坏生物体微滴。采集前每两天更换培养基进行分析。

7. 收集共培养的CD8 T细胞进行流式细胞分析

1. 一旦共培养达到至少第7天，便采集进行分析。如果T细胞在第7天前在共培养中未表达类似TRM的标记，应根据表型获得以及VEO和T细胞存活率，优化采集日期在第7至14天之间。
2. 在dPBS中加入0.2% w/v 牛血清白蛋白和0.1% w/v 叠氮化钠，准备用于流式细胞术染色和分析的荧光活化细胞分选（FACS）缓冲液。
   注意：叠氮化钠是一种急性毒性化学物质。遵循机构建议，处理和处置所有废物，遵守机构生物安全法规。
3. 根据分析所需标记物，在FACS缓冲液中准备荧光抗体混合物进行表面染色。每个孔至少含有50微升抗体混合物。
4. 在dPBS中制备荧光活性染料。每个孔至少含有50微升的可活染料。
5. 小心取出每个孔中的培养基，彻底重新悬浮在冷（2-8°C）FACS缓冲液中，上下移液10-20次，机械性地破坏生物气工程。将每口井中的内容物转移到标有96孔圆底板的板上。
6. 离心机在859× 克 ，4摄氏度下2分钟。 所有离心步骤后降低减速坡道，以防止颗粒重混导致样品损失。
7. 通过倒置板子，用一次有力的向下运动排出液体，去除上清液。再悬浮于50微升抗体混合物中。使用多通道移液器上下移液至少5次，以确保细胞沉淀的彻底悬浮。
8. 在4°C或室温下孵育30分钟，视情况而定，并避免光照。在孵育期结束时，使用多通道移液器和离心机在4°C下以859× g 向每个井添加150微升dPBS，持续2分钟。
9. 将上清液倒置，连续向下拨动一次。再悬浮于50微升的活性染料中。使用多通道移液器上下移液至少5次，以确保细胞沉淀的彻底悬浮。
10. 在室温下孵育15分钟，避免光照。孵育期结束时，使用多通道移液器和离心机在859 × g 下，在4°C下向每孔添加150微升FACS缓冲液，持续2分钟。
11. 如需立即用流式细胞仪检测样品，则将上清液倒置，并重新悬浮于150微升FACS缓冲液中，若需立即用流式细胞仪检测，或定型于150微升0.5%对甲醛并留在4°C。 使用多通道移液器上下移液至少5次，以确保细胞沉淀的彻底悬浮。滤光固定样品以防止仪器堵塞，并在12-36小时内使用流式细胞仪运行，防止荧光损失。
    注意：对甲醛被认为是有害化学品。遵循机构生物安全法规的处理和处置。

结果

CD8 T细胞感染类器官共培养的显微镜可视化
预先形成的小鼠VEOs感染了LCMV，并与LCMV特异性CD8 T细胞共培养。我们还进行了与HSV-2感染模型的共培养，以验证该方案的多样性，但LCMV模型仅展示显微镜数据，并在下方HSV-2模型中包含了T细胞分化数据。LCMV表达黄色荧光蛋白（YFP），因此可以通过常规的荧光显微镜观察感染细胞。为此，7天大VEOs在CD8 T细胞孵育前24小时感染LCMV-YFP（见图1A）。另外，LCMV特异性转基因P14 CD8 T细胞也通过上述激活和静息协议被激活。共培养当天，感染类器官从BME基质中释放，并与前述适当数量的活化CD8 T细胞混合。该混合种群被重新封入新的生物医学生基质中，并被镀入96孔板进行成像（见图1B）。类器官中病毒复制量可早在共培养后4小时内观察到，并表现出绿色荧光。然而，CD8 T细胞在感染类器官附近的积累变得较为明显。我们还注意到类器官完整性在后期...

讨论

CD8 的TRM依赖局部环境线索来区分和维持。这些线索注入组织特异性编程，使CD8 TRM能够适应环境并根据需要执行免疫监测任务。遗憾的是，TRMs在从组织中提取后未能在体外存活，这限制了他们的详细分析^12,13。在本方案中，我们提供了一种方法，使CD8 T细胞与上皮细胞共培养，发展成具有类似体内TRM表型特征的TRMs。该方法可用于长期研究TRM，同时也易于控以适应其他组织、病毒和基因修饰。

该方案最关键的部分与细胞健康有关。共培养前，T细胞必须在增殖并存活状态。未被充分激活并持续提供IL-2的T细胞，除非提供其他生存信号，包括IL-7和IL-15，否则仍无法通过长期培养存活;尽管我们已经看到VEO本身可以部分支持T细胞的存活率¹⁰。如果共培养时T细胞的存活率未超过80%，则共培养不应继续，新分离的T细胞应被激活以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16%对甲醛水溶液	电子显微镜科学	15710-S
24孔聚苯乙烯非处理多孔Tissuce培养板	VWR国际	10861-558
2-巯基乙醇	吉布科	21985023
3毫升无菌注射器	费舍尔科学	14-955-457
5毫升，nbsp;卡扣盖，nbsp;无菌圆底聚苯乙烯试管	猎鹰	352058
60毫米培养皿	费舍尔科学	FB0875713A
70 & mu;m 无菌细胞滤断器	费舍尔科学	22-363-548
96孔未处理聚苯乙烯圆底微板	格赖纳生物一号	650101
96孔聚苯乙烯非处理多孔组织培养板	VWR国际	10861-562
牛蛋白/分数V型	热力科学化学	J6465518
氯化铵	费舍尔科学	A661-500
两性他素B	西格玛-奥尔德里奇	A9528-100MG
B-27补充	吉布科	17504044
ioTek 细胞培养5细胞成像多模式读取器
DMEM/F12 1：1中等比例	西提瓦	SH30271。FS
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐溶液 1 次	科宁	21031CV
乙二胺四乙酸（0.5 M溶液/pH 8.0）	费舍尔科学	BP2482-500
超细微解剖剪刀	罗博兹外科器械公司	RS-5882
胎牛血清——活性炭/四旋蛋白处理	R&D系统	S11650
Flowjo v10 软件	贝克顿、迪金森公司	FlowJo（RRID：SCR_008520）
格拉夫产钳	罗博兹外科器械公司	RS-5135
HEPES解决方案	西提瓦	SH30237.01
左旋谷氨酰胺（200 mM）	吉布科	A2916801
磁铁 5毫升	生物传说	480019
鼠标CD8 Naïve T细胞分离套件	生物传说	480044
小鼠EGF重组蛋白	吉布科	315091MG
非必需氨基酸溶液（100倍）	吉布科	11140050
青霉素-链霉素溶液	西提瓦	SV30010
碳酸氢钾	MP生物医学	0215255780
纯化抗小鼠CD3ε抗体	生物传说	100360
重组鼠B7.1（CD80）-Fc Chimera（无载流子）	生物传说	555406
重组小鼠IL-12（第70页）（无载流子）	生物传说	577004
重组小鼠IL-2（无载流子）	生物传说	575406
低生长因子基底膜提取物	R&D系统	BME001-10
RPMI 1640 媒体	西提瓦	SH30027.LS
叠氮化钠	费舍尔科学	S227I-25
丙酮酸钠（100 mM）	吉布科	11360070
胰蛋白酶0.25%蛋白酶与猪胰蛋白酶	西提瓦	SH30042.02
可行染料（红色780）	Cytek生物科学	13-0865-T100