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方法文章

Mettl3/Nrf2 轴通过抑制5-羟色胺神经元中NLRP3诱导的细胞焦亡抑制帕金森病进展

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DOI：

10.3791/69124

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2025年11月7日

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究Mettl3如何通过m6A修饰调控Nrf2，从而抑制小胶质细胞焦亡并保护帕金森病模型中5-羟色胺神经元的实验方案，该方法可应用于表观转录组学与神经炎症研究领域。

摘要

帕金森病（Parkinson's disease, PD）发病机制的精确细节尚未完全阐明，尤其是在小胶质细胞炎症反应与5-羟色胺能神经元存活方面。本实验方案系统阐述了甲基转移酶样蛋白3（Mettl3）如何通过N6-甲基腺苷（m6A）修饰调控核因子红系2相关因子2（Nrf2），从而减轻小胶质细胞焦亡并保护5-羟色胺能神经元的完整研究框架，涵盖体外和体内模型 体外 和 体内 PD模型。主要目标是为研究人员提供可重复的方法，用于解析表观转录组对神经炎症通路的调控机制，首先通过脂多糖（LPS）诱导BV2细胞中小胶质细胞的活化以模拟炎症级联反应，随后采用甲基化RNA免疫沉淀定量PCR（MeRIP-qPCR）进行m6A分析。 体内我们详细阐述了建立MPTP诱导的帕金森病（PD）小鼠模型的方法，并结合立体定位注射腺相关病毒9型（AAV9）载体，实现对纹状体中Nrf2的靶向调控。行为学评估包括前肢放置实验、加速转棒实验和开放场实验，用于量化运动功能缺陷；分子检测则包括针对焦亡标志物（如NLRP3、cleaved-caspase-1）的Western blot分析、细胞因子的酶联免疫吸附测定（ELISA），以及利用二氢乙啶（DHE）染色检测5-羟色胺神经元中的活性氧（ROS）。通过免疫组织化学等先进显微技术对Iba1和TPH2进行染色，可实现小胶质细胞动态变化及5-羟色胺能系统完整性的可视化观察。结果证实，Mettl3缺失会加剧Nrf2下调、NLRP3炎症小体过度激活、焦亡性细胞死亡以及随之而来的5-羟色胺神经元退变。该方法不仅为探究m6A介导的神经保护机制提供了可靠的实验框架，也提示在神经退行性病变背景下，靶向调控Mettl3/Nrf2轴可能成为延缓PD进展的潜在治疗策略。

引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是老年人群中第二常见的神经退行性疾病，影响约65岁及以上人群的2%至3%，给家庭和社会带来沉重负担1。尽管PD的确切发病机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明，PD的发生发展与神经元传导障碍以及小胶质细胞驱动的神经炎症密切相关；后者是衰老大脑及包括PD在内的多种神经退行性疾病中的常见特征2,3,4,5。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的固有免疫细胞，在维持大脑稳态中发挥关键作用6。然而，小胶质细胞的持续过度活化可引发慢性神经炎症反应，最终促进神经退行性疾病的进展。

中枢和外周的炎症过程均显著影响帕金森病（PD）的病理过程7,8。小胶质细胞的活化可引发影响神经元存活的炎症反应9，越来越多的证据表明泛素连接酶可促进其活化10。在多种炎症通路中，含NOD样受体、富含亮氨酸重复序列和pyrin结构域的蛋白3（NLRP3）炎性小体的活化是调控小胶质细胞炎症反应的主要因素11。NLRP3活化可导致其表达上调，并随后组装炎性小体复合物，该复合物由半胱天冬酶活化和募集结构域（CARD）衔接蛋白和前体半胱天冬酶-1组成，最终导致蛋白质切割和细胞因子释放12。在帕金森病患者及多种疾病动物模型中均观察到NLRP3活化水平升高，进而导致神经元死亡。值得注意的是，在小鼠模型中抑制NLRP3可对帕金森病病理产生保护作用，凸显了NLRP3炎性小体在帕金森病发病机制中的关键作用13,14。

5-羟色胺（5-HT）信号传导是神经系统调节的重要机制，通过与至少14种突触后受体亚型相互作用，影响多种行为和生理功能15,16，其在中枢神经系统病理中的作用已在多项综述中详细阐述17。5-HT系统广泛的神经调节作用由啮齿类动物大脑中约26,000个神经元调控18。尽管大量文献将帕金森病（PD）主要归因于多巴胺能神经元的丧失，但5-HT神经元与PD之间的关系尚未得到充分研究。

N6-甲基腺苷（m6A）修饰是真核细胞中最常见的mRNA修饰，对调控mRNA剪接、稳定性和出核转运具有关键作用，从而影响多种细胞活动19。m6A水平由甲基转移酶和去甲基化酶共同调控。脑内m6A修饰水平的升高与神经发育密切相关，其失调也与多种神经退行性疾病紧密关联20,21，例如在阿尔茨海默病模型中观察到METTL3表达的改变22。例如，在阿尔茨海默病患者死后脑组织的不溶性组分中，甲基转移酶样蛋白3（METTL3）的累积与不溶性Tau蛋白水平呈正相关23。此外，纹状体中m6A水平的显著降低可导致多巴胺神经递质水平大幅下降24。值得注意的是，已有12个与m6A相关的单核苷酸多态性位点被发现与帕金森病（PD）易感性显著相关25。本实验方案建立了系统的方法，用于研究METTL3介导的m6A修饰如何通过Nrf2/NLRP3轴调控小胶质细胞焦亡，最终影响帕金森病模型中5-羟色胺能神经元的存活。本研究选用急性MPTP 体内 模型和LPS 体外 模型，因其可有效诱导神经炎症反应；不过，如后文所述，慢性模型可作为未来研究的补充。

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方案

所有动物实验均在肥城市人民医院 Institutional Animal Care and Use Committee 的批准下进行（批准编号 IACUC-2024-118），并严格遵循机构指南和实验室动物研究的既定伦理原则。研究方案确保对所有动物实施人道护理和处理，特别强调尽量减少动物的痛苦和应激，同时遵守机构标准以及 ARRIVE 指南中关于负责任动物研究实践的要求。

1. 细胞培养与小胶质细胞激活模型

  1. BV2 细胞的制备与培养
    1. 将冻存的 BV2 小胶质细胞在 37 °C 水浴中快速解冻 2 分钟，期间轻柔摇晃以避免热休克。
    2. 将解冻后的细胞悬液在室温（RT）下以 300 × g 离心 5 分钟，以去除冷冻保护剂。
    3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全高糖 DMEM 培养基中，该培养基需添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。
    4. 采用台盼蓝排斥法进行细胞活力检测（将 10 µL 细胞悬液与 10 µL 0.4% 台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数），确保细胞活力>95% 后再进行后续操作。
    5. 以每瓶 1 × 106 个细胞的密度将细胞接种于 T75 培养瓶中，并置于 37°C、5% CO2 的加湿细胞培养箱中培养。
    6. 当细胞融合度达到 80–85% 时，每 48 小时传代一次，采用标准胰酶消化法进行传代。
      注：为确保炎症反应的可重复性，应保持一致的传代次数（第 3–8 代）。所有细胞培养实验均独立重复至少三次，每种条件设置三个技术重复，以尽量减少实验变异性。
  2. LPS 诱导的小胶质细胞活化
    1. 在处理前 24 小时，将 BV2 细胞以每孔 2 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔板中，每孔加入 2 mL 完全培养基。
    2. 用无菌 PBS 配制浓度为 1 mg/mL 的 LPS 储存液，经 0.22 µm 滤器过滤除菌后，分装为单次使用量，于 -20 °C 保存。
    3. 每次实验前使用鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）检测 LPS 活性，以确认内毒素浓度26。
    4. 使用前立即用无血清 DMEM 将 LPS 储存液稀释至工作浓度 1 µg/mL。
    5. 吸除孔内培养基，用无菌 PBS 洗涤细胞两次。
    6. 向处理组孔中加入含 LPS 的培养基（终浓度为 1 µg/mL）2 mL，对照组孔中加入等量无血清 DMEM。
    7. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时，以诱导炎症活化。
    8. 设置阳性对照组（加入 100 ng/mL 肿瘤坏死因子（TNF）-α）和阴性对照组（仅加入 PBS 溶剂），以验证炎症反应。
      注：每次实验均需新鲜配制 LPS 溶液，以维持其稳定的生物活性。若炎症反应较弱（例如细胞因子升高<2 倍），应检查试剂稳定性或延长孵育时间至 48 小时。
  3. Mettl3 的过表达与敲低
    1. 根据标准寡核苷酸合成方法，设计并合成靶向 Mettl3 的小干扰 RNA（siRNA）序列及乱序对照序列。从 Mettl3 mRNA 编码区（GenBank 登录号：NM_019721）选择长度为 19–21 个核苷酸的靶序列，确保 GC 含量为 40–60%27。
    2. 使用 BLAST 分析验证 siRNA 序列的特异性，避免脱靶效应（确保与非靶基因的同源性<70%）。
    3. 构建过表达载体，将全长 Mettl3 cDNA 克隆至 pcDNA3.1 载体中，使用 EcoRI 和 XhoI 限制性酶切位点。
    4. 当细胞融合度达 70–80% 时，使用阳离子脂质转染试剂进行转染：
      1. 将 2 µL 阳离子脂质转染试剂与 50 pmol siRNA 或 2 µg 质粒 DNA 混合于 100 µL Opti-MEM 培养基中。
      2. 室温孵育 15 分钟。
      3. 将转染复合物逐滴加入细胞中，转染 4–6 小时后更换为新鲜完全培养基。
    5. 转染后继续培养 48 小时，再进行 LPS 处理，以确保蛋白表达发生充分改变。
    6. 通过共转染荧光报告基因（每孔 100 ng pEGFP-C1）评估转染效率，在荧光显微镜下确认转染效率>70% 后再进行后续实验。

2. 动物模型构建与实验设计

  1. 动物准备与随机分组
    1. 从维通利华实验动物中心获取 C57BL/6J 小鼠，确保性别比例均衡，年龄为 8 周，体重为 19–26 g。
    2. 将动物饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，光照周期为 12:12 小时明暗循环，温度控制在（22 ± 2）°C，湿度维持在 50–60%。
    3. 给予 7 天的适应性饲养期，自由摄取标准饲料和饮水。
    4. 在适应期期间进行基线行为学评估：开展全面的行为测试，包括前肢放置试验（每侧 10 次试验）、加速转棒试验（5 分钟内从 4 rpm 加速至 40 rpm）以及开放场运动活动分析（在 50 cm × 50 cm × 50 cm 的装置中进行 10 分钟测试）28,29,30。
    5. 采用计算机随机化方法将动物随机分配至实验组（每组 n = 6），以减少偏倚：假手术组（sham）、模型组（Model）、模型+Nrf2-KD 组、模型+oe-Nrf2 组。
    6. 实施盲法实验设计，执行行为学评估的研究人员对分组情况保持盲态。
  2. 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病模型
    1. 在注射前立即用无菌生理盐水配制 MPTP 溶液至 30 mg/kg，即将 15 mg 盐酸 MPTP 溶解于 5 mL 无菌生理盐水中，并根据动物体重调整注射体积。
      ​注意：MPTP 具有高度神经毒性。操作时须在化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备，包括双层手套和实验服。
    2. 以 30 mg/kg 体重剂量（注射体积为 10 mL/kg）经腹腔注射 MPTP，连续给药三天，每天在同一时间点（09:00 ± 30 分钟）进行。
    3. 假手术组动物按照相同的注射方案给予等体积的无菌生理盐水。
    4. 在 MPTP 给药期间，每日监测动物是否出现痛苦表现、体重减轻（>15% 视为终点）或其他不良反应，并使用标准化评分表记录。
    5. 末次注射后继续饲养 8 天，以允许神经退行性病变的发展。
      备注：在此期间动物可正常饲养，但仍需持续监测。
  3. 立体定位病毒注射
    1. 通过三重转染法在 HEK293T 细胞中制备 AAV9 病毒载体，使用聚乙烯亚胺（PEI；DNA:PEI 质量比为 1:3），转染后 72 小时收获病毒，采用碘克沙醇梯度超速离心法纯化（177,000 × g，2 小时），再使用离心过滤装置浓缩至 1 × 1012 基因组拷贝/mL。
    2. 使用靶向 ITR 区域的引物，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）验证病毒滴度，确保滴度达到 1 × 10¹² 基因组拷贝/mL，并通过标准曲线分析确认。
    3. 采用 SYBR Green 法定量 PCR 结合 ITR 特异性引物验证病毒滴度，对已知浓度的标准品进行系列稀释，利用标准曲线分析计算基因组拷贝数。通过 p24 ELISA 检测确认无复制型病毒污染。
    4. 通过鼻罩给予异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度 3%，维持浓度 1.5–2%），氧气流速控制在 0.8–1.0 L/min，全程监测呼吸频率（60–100 次/分钟）及脚趾夹捏反射。将小鼠固定于立体定位仪上，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。
    5. 将小鼠固定于立体定位仪上，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。
    6. 使用无菌手术刀片沿颅顶正中做 1.5 cm 切口，利用立体定位坐标系统精确定位前囟（bregma），精度达 0.1 mm。
    7. 计算纹状体注射坐标：以前囟为参考点，前后向 -0.5 mm，内外向 ±2.0 mm，背腹向 -3.0 mm。
    8. 在正式实验注射前，使用荧光示踪剂（如绿色荧光蛋白 [GFP]）进行预实验注射，以验证靶向准确性，通过免疫组织化学检测确认荧光信号与小胶质细胞标志物（Iba1）共定位率超过 >80%。
    9. 以 1 mm/min 的速度将注射针（33 号）缓慢降至目标深度，使用配备自动控制器的微量注射泵以 0.2 µL/min 的速度注入 2 µL 病毒悬液。将注射针缓慢降至目标深度后，以 0.2 µL/min 的速率注入 2 µL 病毒悬液。
    10. 注射完成后保持针头在原位 5 分钟，以防液体回流。
    11. 以 0.5 mm/min 的速度缓慢撤出针头，使用 4-0 丝线间断缝合切口，并将动物置于加热恢复垫上苏醒。
    12. 术后给予镇痛处理（卡洛芬 5 mg/kg，皮下注射，每日一次，连续 3 天），并在术后 24 小时内密切观察恢复情况，详细记录观察结果。

3. 分子生物学技术与验证

  1. RNA提取与质量控制
    1. 在实验终点后立即通过二氧化碳安乐死动物，收集细胞或纹状体脑组织样本2 吸入麻醉后行颈椎脱位；在冰上解剖组织，充分剪碎，并用0.25%胰蛋白酶在37℃下酶解消化10分钟 °若收获细胞。
    2. 使用TRIzol试剂（每1×10⁶细胞加入1 mL）提取总RNA6 细胞或100 mg组织）进行机械匀浆（在Dounce匀浆器中研磨20-25次）和氯仿相分离（每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿）。
    3. 使用分光光度法（A260/A280 比值为 1.8–2.0）和凝胶电泳（1% 琼脂糖）评估 RNA 质量，以确认 28S 和 18S 核糖体条带。
    4. 使用分光光度计测定RNA浓度。
    5. 将RNA样本储存于-80 °在无核酸酶水中于 -80 ℃保存 °C，并添加RNase抑制剂（40单位/μL）µL）直至分析。
  2. 细胞核-细胞质分离
    1. 收集细胞（2 × 106 最小量）并用预冷的 PBS 洗涤两次（每次 5 mL，300 ×g 离心 5 分钟） × g).
    2. 使用商业细胞分馏试剂盒，按照以下方案操作。
      1. 将细胞沉淀重悬于 200 µ含蛋白酶抑制剂的细胞质提取缓冲液 L。
      2. 冰上孵育10分钟，每3分钟涡旋振荡一次。
      3. 以16,000离心 × g 4℃下离心5分钟 °C并收集上清液（胞质组分）。
      4. 用细胞质提取缓冲液洗涤沉淀物两次。
      5. 将沉淀重悬于100 μL中 µ核提取缓冲液 L。
      6. 冰上孵育40分钟，每10分钟涡旋振荡一次。
      7. 在16,000 × g下离心 × g 4℃下离心10分钟 °C并收集上清液（核组分）
    3. 通过Western blot分析核标记（U6）和胞质标记（GAPDH）的分布，验证分馏效率。
    4. 分别提取细胞核和细胞质组分中的RNA。
    5. 使用针对各组分的特异性参考基因，通过RT-qPCR分析每个组分中的Nrf2 mRNA水平。
  3. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）
    1. 从1 µ使用随机引物和逆转录试剂盒对总RNA进行反转录。
    2. 使用 Premix Ex Taq II 试剂盒，在实时荧光定量 PCR 系统上用基因特异性引物进行 qPCR。
    3. 使用熔解曲线分析验证引物特异性，并通过凝胶电泳确认单一扩增产物。
    4. 使用以下热循环条件：95℃初始变性 °C，10 分钟，随后进行 40 个循环的 95 °C，15 秒，60 °℃ 30 秒，72 ℃ °30 秒，60°C
    5. 使用2⁻ΔΔCt法计算相对mRNA表达水平-ΔΔCt 方法与 β-actin 作为内参
    6. 包括无模板对照，并通过geNorm分析验证参考基因在不同实验条件下的稳定性（稳定性值M） < 0.5).
      注：可重复性评分：组内检测变异系数（CV） <三次独立实验中差异在10%以内。
  4. 用于m6A修饰分析的MeRIP-qPCR
    1. 提取总RNA（至少20） µg）使用RNA片段化试剂（10 mM ZnCl₂）将RNA片段化至100–200个核苷酸长度2，10 mM Tris-HCl，pH 7.0）中于70℃ °5 分钟，4°C
    2. 使用 m6A 特异性抗体进行免疫沉淀（2 µ克每20 µ4℃过夜（每微克RNA） °在免疫沉淀缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，750 mM NaCl，0.5% NP-40）中以10 rpm旋转。
    3. 使用已知的m6A修饰和非修饰RNA对照验证抗体特异性。
    4. 用洗涤缓冲液洗涤免疫沉淀复合物五次。
    5. 洗脱结合的RNA，并使用随机引物进行逆转录。
    6. 使用随机引物对洗脱的RNA进行逆转录，并利用覆盖潜在m6A位点的Nrf2特异性引物进行qPCR分析。
    7. 使用 Nrf2 特异性引物进行 qPCR 分析，并相对于输入 RNA 计算富集度。
      注意：若检测结果不一致，可优化片段化时间（4-6 分钟）以提高重复性；定量基准：信噪比 >15:1，与IgG对照组相比。

4. 蛋白质分析与验证

  1. 蛋白质提取与定量
    1. 使用含蛋白酶抑制剂（1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 µg/mL 亮抑蛋白酶肽、1 µg/mL 胃蛋白酶抑制剂A）和磷酸酶抑制剂（1 mM 原钒酸钠、5 mM 氟化钠）的200 µL 放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液裂解细胞（1 × 106 个细胞）或匀浆组织样本（100 mg 纹状体组织）。
    2. 将裂解物在冰上孵育30分钟，期间每10分钟涡旋振荡10秒。
    3. 在4 °C下以12,000 × g 离心15分钟，去除细胞碎片，收集上清液。
    4. 采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度，使用牛血清白蛋白标准品（0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 µg/mL）进行三份重复测定。
    5. 通过Western blot检测所有样本中管家蛋白（GAPDH，预期分子量：36 kDa）的水平，验证蛋白完整性。
  2. Western blot分析
    1. 将蛋白样品（上样量相等，30–50 µg）与SDS-PAGE上样缓冲液混合（终浓度：62.5 mM Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，10%甘油，5% β-巯基乙醇，0.003% 溴酚蓝），在95 °C变性5分钟。
    2. 使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳，在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液中先以80 V运行30分钟，再以120 V运行90分钟。
    3. 采用半干转系统在转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20%甲醇）中将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，400 mA恒流转膜90分钟。
    4. 在进行抗体孵育前，使用可逆蛋白染色（Ponceau S：5%乙酸溶液中0.1%，染色5分钟）确认转膜效率。
    5. 用含5%脱脂奶粉的TBST（TBS + 0.1% Tween-20）在室温下轻柔振荡封闭1小时。
    6. 加入用封闭液按1:1000稀释的一抗，在4 °C轻柔振荡孵育过夜。
    7. 用TBST洗涤膜三次，每次10分钟，随后加入HRP标记的二抗（1:5000稀释），室温孵育1小时。
    8. 采用增强型化学发光法检测蛋白条带，并通过密度测定进行定量。
    9. 将目标蛋白表达量归一化至上样对照（GAPDH），并通过适当的对照实验验证抗体特异性（如一抗的肽段阻断实验、仅加二抗的对照）。

5. 行为学评估与功能分析

  1. 前肢放置试验
    1. 在评估前，让小鼠在测试环境（安静的房间，22 °C，光线昏暗）中适应30分钟。
    2. 轻轻抓住小鼠背部皮肤，使其四肢悬空于桌面边缘上方约0.5 cm处，确保小鼠无法看到桌面表面。
    3. 将小鼠每侧的触须轻刷桌面边缘，以触发其放置反射，并记录2秒内前肢成功放置的反应。
    4. 每侧进行10次试验，每次试验间隔30秒，左右侧交替进行。
    5. 在恒定光照条件（50–100 lux）和固定时间段（13:00–17:00）进行测试，以尽量减少昼夜节律的影响。
    6. 计算成功率，即成功放置次数占总试验次数的百分比：（成功放置次数/总试验次数）× 100。
  2. 加速转棒试验
    1. 将转棒仪设定为初始转速4 rpm，在5分钟内线性加速至40 rpm。
    2. 测试前连续训练小鼠3天（每天3次试验，每次间隔15分钟），以减少学习效应的影响。
    3. 标准化测试条件，包括室温（22 ± 2 °C）、光照（100 lux）和背景噪音水平（<50 dB）。
    4. 将小鼠面朝前方置于旋转棒上，并立即启动加速程序。
    5. 记录每次试验中小鼠跌落的潜伏期（从开始到跌落或完成5分钟试验的时间），每只动物测试5次，每次间隔15分钟休息。
    6. 取最长的三次试验结果计算平均潜伏期，以减少动机因素引起的变异性。
  3. 旷场试验
    1. 使用旷场装置（50 cm × 50 cm × 50 cm透明丙烯酸箱），上方1 m处安装视频追踪系统。
    2. 每次更换小鼠后用70%乙醇清洁装置（喷洒并擦拭，静置风干5分钟），以消除气味线索。
    3. 将小鼠置于装置中央，在恒定光照（200 lux）条件下记录10分钟活动情况，视频采集帧率为30 fps。
    4. 使用自动化追踪软件分析多个参数：
      总移动距离（cm）
      中心区域停留时间（定义为距壁面10 cm以内区域，单位为s）
      移动速度（cm/s）
      在外周区与中心区停留时间的比较
  4. 将距壁面10 cm内的区域定义为中心区，量化小鼠在中心区与外周区的停留时间及移动距离。

6. 高级显微镜与成像

  1. DHE染色法检测活性氧
    1. 现配现用10 μM二氢乙啶（DHE）溶液 µ使用前立即用 PBS 配制 M 溶液（避光）。
    2. 使用二氢乙啶（DHE）与色氨酸羟化酶2（TPH2）抗体（1:500稀释）进行免疫荧光共染色，以特异性鉴定血清素能神经元。
      ​注意：该双标记方法基于以下原理，即二氢乙啶（DHE）被超氧阴离子氧化后形成不可透过细胞膜的荧光产物，并保留在其来源细胞内，从而可区分TPH2阳性神经元胞体内的活性氧（ROS）生成与周围胶质细胞中的氧化应激。
    3. 孵育组织切片（20 µm 厚度）切片与 DHE 溶液在 37℃ 孵育 30 分钟 °在湿润密闭的避光环境中，于 C 条件下孵育。
    4. 包括阴性对照（不加DHE）和阳性对照（100 µM H2O2 处理30分钟）以验证活性氧检测的特异性。
    5. 用 PBS 清洗切片三次，然后使用抗荧光淬灭封片剂封片。
    6. 使用荧光显微镜成像（DHE：518 nm 激发/605 nm 发射，TPH2：488 nm 激发/525 nm 发射），各样本曝光时间保持一致（200 ms）；每周使用标准荧光微球对成像系统进行校准（信噪比 > 20:1).
    7. 仅使用 ImageJ 软件并采用标准化分析方案对 TPH2 阳性细胞中的荧光强度进行定量分析（阈值：50-255，粒子大小：10-∞ 像素2）。根据TPH2免疫反应性划定ROI边界，以确保特异性测量5-羟色胺能神经元内的氧化应激水平，同时排除邻近小胶质细胞、星形胶质细胞或其他细胞类型的信号干扰。每只动物应分析多个组织切片中不少于50个TPH2阳性神经元。
  2. 免疫组织化学
    1. 在4℃下，用含4%多聚甲醛的PBS固定组织切片24小时 °C，轻柔振荡。
    2. 通过梯度乙醇系列（70%、80%、90%、95%、100%）脱水 × 2，每次1小时）并使用自动组织处理机进行石蜡包埋。
    3. 切5 µ使用切片机将组织切成 m 片，并置于带电荷的玻片上，每张玻片放置 3–4 片。
    4. 使用二甲苯脱蜡切片（2次） × 10 分钟）并通过梯度乙醇复水至水。
    5. 使用柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，pH 6.0）在微波炉中进行抗原修复（750 W，加热10分钟，每2分钟暂停冷却一次）。
    6. 使用适当的阴性对照（不加一抗）和阳性对照组织（已知表达目标蛋白的脑组织切片）验证抗体特异性。
    7. 用甲醇配制的3%过氧化氢在室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
    8. 4℃下孵育一抗过夜 °在加湿密闭室中。
    9. 使用HRP标记的二抗（1:500稀释，室温孵育1 h）和DAB显色剂（孵育至出现棕色，通常为2-5 min）进行检测。
    10. 用苏木精复染（30秒），脱水，透明，再用永久封片剂封片。
    11. 使用系统随机抽样法（每5张切片取1张，每张切片选取3个计数框，40倍镜下）通过体视学方法对阳性细胞进行定量分析。× 放大倍数）

7. 统计分析与数据验证

  1. 统计设计与分析
    1. 使用 G*Power 3.1.9.7 软件进行功效分析，以确定能够检测到具有生物学意义差异的足够样本量（效应量 ≥ 0.8，功效 ≥ 0.80，α = 0.05）。
    2. 在进行参数检验前，使用 Shapiro-Wilk 检验验证数据正态性，并使用 Levene 检验评估方差齐性。
    3. 根据实验设计和数据分布，使用适当的统计软件和相应的统计方法进行数据分析。
    4. 对于单因素比较采用单因素方差分析（ANOVA），对于析因设计（如处理 × 时间交互作用）采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。
    5. 当方差分析显示显著性（p < 0.05）时，使用 Tukey 法进行事后多重比较检验；必要时应用 Bonferroni 校正。
    6. 所有分析的统计学显著性阈值设定为 p < 0.05，并对 p < 0.01 和 p < 0.001 的结果额外标注。
    7. 报告效应量（Cohen's d 或 η2）和 95% 置信区间，连同 p 值一起提供全面的统计学解释。
    8. 数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）表示；当样本数 n ≤ 10 时，应显示单个数据点。
      注：所有细胞培养实验应独立重复至少三次，每次实验均需包含适当的对照组和多个技术重复，通过盲法操作和标准化时间安排将观察到的变异性（例如行为学数据的 CV <15%）降至最低。

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结果

该方案成功证明，在脂多糖（LPS）处理的小胶质细胞中，Mettl3 的表达水平下降（图1），在 mRNA 和蛋白水平上均较对照组显著降低（图1B、C）。ELISA 分析显示，培养上清液中 IL-6 和 TNF-α 水平升高，证实了 LPS 介导的炎症激活成功（图1A）。

MeRIP-qPCR 分析显示，Mettl3 过表达增强了 Nrf2 mRNA 的 m6A 甲基化，这反而增加了蛋白的稳定性与表达水平，而非促进其降解，这与近期研究证据一致：在特定细胞环境下，m6A 修饰可增强翻译效率（图 2A、B）。核质分离实验表明，尽管 Nrf2 mRNA 在细胞不同区室中的分布未发生改变，但其蛋白水平却受到 Mettl3 表达状态的显著调控（图 2C

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讨论

有几个关键步骤需要特别注意，以确保结果的可重复性。LPS激活的时间至关重要——炎症反应在处理后24小时达到峰值，我们强烈建议每次实验均新鲜配制LPS溶液，因为储存后的溶液可能丧失生物活性19,20。对于MeRIP-qPCR分析，抗体质量至关重要。我们发现，在处理实验样本之前，使用已知的阳性和阴性对照验证抗体，可避免后续许多故障问题。在立体定位病毒注射过程中，保持精确的坐标和注射速度（0.2 µL/min）对靶向准确性极为关键。注射后等待5分钟可防止回流，从而显著提高转导效率。

根据具体的研究问题，可采用多种改进方法以优化实验结果。对于研究慢性神经炎症的研究，我们已成功使用较低浓度的LPS（100 ng/mL）进行较长时间处理（72–96 小时），这更能模拟人类患者中观察到的慢性疾病状态7,8。我们还测试了其他病毒载体（AAV1、AAV2）以实现不同细...

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披露

作者声明本研究不存在任何竞争性财务利益或相关利益冲突。没有任何作者与本文中提及产品的公司存在财务关系。

致谢

作者感谢肥城市人民医院和烟台毓璜顶医院的技术人员在实验操作和动物护理方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AAV9 病毒载体Vector Core Facility定制含 Nrf2 构建体
加速旋转杆仪Ugo Basile47600用于行为学检测
抗 GAPDH 抗体Cell Signaling Technology5174一抗，1:5000
抗 GSDMD 抗体Abcamab219800一抗，1:1000
抗 Iba1 抗体Wako019-19741一抗，1:500
抗 NLRP3 抗体AdipoGenAG-20B-0014一抗，1:1000
抗 Nrf2 抗体Abcamab62352一抗，1:1000
抗 SLC6A4 抗体Novus BiologicalsNBP1-85726一抗，1:500
抗 TPH2 抗体MilliporeMAB847一抗，1:500
BCA 蛋白定量试剂盒Pierce23225用于蛋白质定量
BV2 小胶质细胞Shengen BiologySG-BV2小鼠小胶质细胞系
C57BL/6J 小鼠Vital River Laboratory2138 周龄，19–26 g
细胞组分分离试剂盒Cell Signaling Technology9038核质分离
完全高糖 DMEM 培养基Gibco11965092细胞培养基
DAB 显色剂Vector LaboratoriesSK-4100用于免疫组织化学
牙科钻Fine Science Tools18000-17用于颅骨钻孔
DHE（二氢乙啶）Molecular ProbesD11347活性氧检测
ELISA 试剂盒（IL-1β）R&D SystemsMLB00C小鼠 IL-1β 检测
ELISA 试剂盒（IL-18）R&D Systems7625小鼠 IL-18 检测
ELISA 试剂盒（IL-6）R&D SystemsM6000B小鼠 IL-6 检测
ELISA 试剂盒（TNF-α）R&D SystemsMTA00B小鼠 TNF-α 检测
胎牛血清Gibco16000044细胞培养添加剂
HRP 标记二抗Jackson ImmunoResearch111-035-003抗兔，1:10000
异氟烷RWD Life ScienceR510-22麻醉剂
LAL 检测试剂盒Lonza50-647ULPS 活性验证
Lipofectamine 转染试剂Invitrogen11668019用于细胞转染
LPS（脂多糖）Sigma-AldrichL2630来源于大肠杆菌，1 mg/mL 储存液
m6A 抗体Synaptic Systems202003用于 MeRIP，1:200
微量注射泵Harvard Apparatus70-3007用于立体定位注射
MPTPSigma-AldrichM0896神经毒素，30 mg/kg
旷场实验装置ANY-maze定制50 cm ´ 50 cm ´ 50 cm
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148PBS 中 4%
pcDNA3.1 载体InvitrogenV79020表达载体
青霉素-链霉素Gibco15140122抗生素溶液
Premix Ex Taq II 试剂盒TakaraRR820A用于 qPCR
PrimeScript 逆转录试剂盒TakaraRR037A逆转录
PVDF 膜MilliporeIPVH00010用于 Western blot
RIPA 裂解液Cell Signaling Technology9806蛋白质提取
siRNA（Mettl3）RiboBio定制靶序列验证
立体定位仪RWD Life Science68001用于脑部手术
TRIzol 试剂Invitrogen15596026RNA 提取
台盼蓝Sigma-AldrichT8154细胞活力染色

参考文献

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